廖 亮，楊國(guó)輝

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院MICU，貴州 貴陽(yáng) 550004)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是臨床上多發(fā)的幾種惡性腫瘤之一，國(guó)外報(bào)道約占肺癌患者總?cè)藬?shù)的80%[1]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究的進(jìn)展，肺癌早期診斷、治療和預(yù)后均取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但患者5年生存率仍在15%左右[2]，而其中原因之一是肺癌細(xì)胞在人體內(nèi)的過(guò)早轉(zhuǎn)移。在非小細(xì)胞肺癌中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要而獨(dú)特的作用[3-5]，有研究表明它是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)機(jī)制復(fù)雜的生物學(xué)行為[3]。當(dāng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞將失去原來(lái)正常的細(xì)胞極性，并逐步獲得間質(zhì)細(xì)胞的某些特點(diǎn)，例如增強(qiáng)的遷移和侵襲能力等，同時(shí)，還伴隨著相關(guān)基因表達(dá)的改變[6]，其中N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和轉(zhuǎn)錄因子(Snail)等已成為檢測(cè)EMT發(fā)生的特異分子標(biāo)記物[7,8]。

嵌合內(nèi)含子(chimeric intron)是由人β-球蛋白第一個(gè)內(nèi)含子5'端剪切序列與人免疫球蛋白IgG重鏈可變區(qū)中內(nèi)含子3'端剪切序列組合而成[9]。有研究表明，嵌合內(nèi)含子能夠提高蛋白在體外的表達(dá)[10-12]以及能顯著促進(jìn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)在小鼠體內(nèi)的表達(dá)[10]。還有研究證實(shí)，它能提高綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在293T細(xì)胞中的表達(dá)[13]。在中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)中還能大幅度提高重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，并且證明其調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有方向性[14]。因此，本研究的目的是通過(guò)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9中表達(dá)嵌合內(nèi)含子重組質(zhì)粒，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力的改變以及對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；Matrigel轉(zhuǎn)移小室由Corning公司生產(chǎn)；DNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京碼因生物科技公司；總RNA提取Trizol試劑以及PCR試劑購(gòu)自Invitrogen公司；gDNA Eraser、Reverse Transcription、T4 DNA Ligase試劑盒以及SYBR?Green試劑盒購(gòu)自Takara公司；PCR儀購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司StepOnePlusTM；雙熒光酶檢測(cè)試劑采用購(gòu)自于GeneCopoeia公司的Luc-PairTMDuo-Luciferase；psiCHECK-2載體購(gòu)自于美國(guó)Promega公司；Western Blotting多克隆抗體以及二抗均購(gòu)自美國(guó)賽默飛(ThermoFisher)公司。PC-9細(xì)胞及E.coliDH5α感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以psiCHECK-2中的內(nèi)含子為模板，根據(jù)psiCHECK-2質(zhì)粒圖譜(圖1)[15]，分別設(shè)計(jì)包含有相關(guān)酶切位點(diǎn)的特異性引物，由上海生工公司合成,見(jiàn)表1。此嵌合內(nèi)含子已存在于psiCHECK-2雙熒光素酶報(bào)告載體SV40啟動(dòng)子的下游。利用PCR技術(shù)將擴(kuò)增內(nèi)含子目的基因片段。然后將目的基因產(chǎn)物插入并連接到海腎熒光素酶報(bào)告基因的下游多克隆位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布LB平板，挑取單克隆后進(jìn)行增菌培養(yǎng)，分別用于PCR鑒定和基因測(cè)序鑒定。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

圖中箭頭方向代表基因轉(zhuǎn)錄方向。hRluc+代表海腎熒光素酶cDNA。hluc+代表螢火蟲(chóng)熒光素酶cDNA。ApaI和MluI分別代表兩個(gè)酶切位點(diǎn)。hluc+上游∧符號(hào)代表插入的嵌合內(nèi)含子基因。圖1 psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖Fig 1 psiCHECK-2-Intron recombinant plasmid vector structure diagram

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基中加入非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9并用移液槍充分吹打混勻，放置在培養(yǎng)箱中，溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，培養(yǎng)48 h，每間隔24 h更換培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞完全貼壁以后，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-9細(xì)胞按照英格恩公司EntransterTM-H4000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 按照Invitrogen公司說(shuō)明書(shū)使用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，并按照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄的方法合成cDNA。引物由生工(上海)公司合成(見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)體系分別包括cDNA0.5 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，無(wú)菌水8.5 μL。參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性2 min，再進(jìn)行95 ℃，30 s；65 ℃，30 s；72 ℃，30 s(總共30個(gè)循環(huán))，最后72 ℃，5 min延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4雙熒光素酶活性檢測(cè) 將PC-9細(xì)胞從-80 ℃冰箱取出，每個(gè)孔加入80 μL細(xì)胞裂解液。在搖床中以250 r/min，20 ℃，10 min充分搖勻使細(xì)胞裂解。準(zhǔn)備一個(gè)黑色96孔檢測(cè)板，每個(gè)樣品分3次重復(fù)孔加入，然后每孔分別加入已事先準(zhǔn)備好的兩種底物SubⅠ和SubⅡ，上機(jī)檢測(cè)(BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀)。通過(guò)計(jì)算海腎熒光素酶與螢火蟲(chóng)熒光素酶底物熒光比值來(lái)測(cè)定熒光素酶的相對(duì)活性。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到12孔板中，并且當(dāng)細(xì)胞粘附至壁后24 h后將其轉(zhuǎn)染。48 h后使用100 μL移液管槍頭在融合細(xì)胞層上垂直劃出一條直線。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的多余細(xì)胞后，加入含4%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，此時(shí)記錄為0 h。在0～24 h內(nèi)，使用顯微鏡記錄同一位置的刮擦寬度。劃痕愈合率(%)= [劃痕寬度(T0-T24)/劃痕寬度T0]×100%(T0表示在0 h處的劃痕寬度，T24表示24 h之后的劃痕寬度)。實(shí)驗(yàn)被獨(dú)立地重復(fù)3遍，并且從每個(gè)孔中隨機(jī)選擇3個(gè)位置記錄，從每個(gè)孔中取平均值以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用Matrigel基質(zhì)膠和1640培養(yǎng)基按1∶8比例混勻稀釋，取100 μL均勻鋪在Transwell上室，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell的上室，并加入200 μL無(wú)血清1640培養(yǎng)基。在Transwell的下室加入1640完全培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)48 h后用醫(yī)用滅菌棉棒輕輕拭去上室的細(xì)胞，再用甲醇溶液將細(xì)胞固定30 min，然后用結(jié)晶紫染料進(jìn)行細(xì)胞染色20 min，最后將殘余的染料用PBS緩沖液洗去。重復(fù)3次，每次在顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)觀察野并進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，記錄均數(shù)用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting) 將psiCHECK-2空白載體和psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞中，72 h后，用PIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并制備樣品。配置SDS-PAGE膠，每孔上樣蛋白樣品25 μg，蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%BSA封閉1 h，再加入稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔(二抗)，37 ℃孵育2 h，TBST重復(fù)漂洗3次，每次10 min，HRP化學(xué)發(fā)光液顯影，GAPDH做為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒的構(gòu)建

以psiCHECK-2載體為模板，利用含ApaI和MluI酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增Intron基因，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為133 bp，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，目的片段長(zhǎng)度和預(yù)期結(jié)果相符，見(jiàn)圖2A。然后將psiCHECK-2質(zhì)粒和Intron目的片段雙酶切(ApaI和MluI)，回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶在16 ℃水浴中進(jìn)行連接，獲得重組載體psiCHECK-2-Intron后，將其轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)氨芐青霉素LB平板篩選后，挑取單克隆，PCR鑒定，見(jiàn)圖2B。

2.2 重組載體psiCHECK-2-Intron的測(cè)序鑒定

將PCR鑒定成功的陽(yáng)性克隆送至上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果證實(shí)插入的chimeric intron基因序列正確，無(wú)突變和缺失，表明重組質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建成功，見(jiàn)圖3。

A：M:DL2000 DNA Marker;1:Intron基因擴(kuò)增結(jié)果 B：M:DL5000DNAMarker：1：Intron目的片段 2：Intron目的片段雙酶切 3：psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒4：psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒雙酶切圖2 Intron目的基因以及psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒雙酶切及PCR鑒定Fig 2 Intron target gene and psiCHECK-2-Intron plasmid double restriction digestion and PCR identification

圖3 重組質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron部分測(cè)序結(jié)果(方框內(nèi)為插入的嵌合內(nèi)含子目的基因片段序列)Fig 3 Partial sequencing results of recombinant plasmid psiCHECK-2-Intron (the sequence of the inserted chimeric intron target gene fragment is in the box)

2.3 RT-PCR鑒定psiCHECK-2-Intron在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

將構(gòu)建成功的psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞并裂解，用Trizol提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用合成引物qRL和qFL；PCR擴(kuò)增出海腎熒光素酶及螢火蟲(chóng)熒光素酶目的基因片段，見(jiàn)圖4。長(zhǎng)度分別122 bp和174 bp。結(jié)果表明，重建的psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒能夠在PC-9細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄。

M:DL2000 DNA Marker;1：海腎熒光素酶基因片段122bp(A圖)&螢火蟲(chóng)熒光素酶基因片段174 bp(B圖);2：psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒(雙酶切)圖4 psiCHEKC-2-Intron轉(zhuǎn)染PC-9細(xì)胞后PCR鑒定結(jié)果Fig 4 PCR identification results of PC-9 cells transfected with psiCHEKC-2-Intron

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)psiCHECK-2-Intron在真核細(xì)胞中的表達(dá)

將psiCHECK-2空白載體作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞中的psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒所攜帶的兩種熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)后所發(fā)出的特定波長(zhǎng)的熒光均可被BioTekSynergy 2多功能酶標(biāo)儀所檢測(cè)到,見(jiàn)圖5。證實(shí)兩種熒光素酶基因均能夠在PC-9細(xì)胞中順利表達(dá)。與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)海腎和螢火蟲(chóng)兩種熒光素酶表達(dá)活性Fig 5 Dual luciferase reporter gene detection of renilla and firefly luciferase expression activity

2.5 Intron對(duì)PC-9細(xì)胞遷移的影響

將psiCHECK-2空白載體作為對(duì)照組，psiCHECK-2-Intron作為實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)嵌合內(nèi)含子表達(dá)對(duì)PC-9細(xì)胞遷移的影響。24 h后，空白對(duì)照組劃痕愈合度為(63.460±1.745)%，內(nèi)含子組的愈合度為(41.370±1.672)%,見(jiàn)圖6。以上結(jié)果表明嵌合內(nèi)含子抑制了PC-9細(xì)胞的遷移能力(P?0.001)。

A：細(xì)胞劃痕圖片，B：劃痕愈合度(%)計(jì)數(shù)柱狀圖圖6 chimeric intron表達(dá)對(duì)PC-9細(xì)胞遷移能力的影響Fig 6 The effect of chimeric intron expression on the migration ability of PC-9 cells

2.6 Intron對(duì)PC-9細(xì)胞侵襲的影響

Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組中穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為(98.430±3.000)個(gè)，Intron組為(41.670±4.163)個(gè),見(jiàn)圖7。提示內(nèi)含子組的PC-9細(xì)胞侵襲能力降低(P<0.001)。

A：細(xì)胞侵襲圖片 B：細(xì)胞計(jì)數(shù)柱狀圖圖7 嵌合內(nèi)含子表達(dá)對(duì)PC-9細(xì)胞株侵襲能力的影響Fig 7 The effect of chimeric intron expression on the invasion ability of PC-9 cell line

2.7 Intron對(duì)EMT相關(guān)分子標(biāo)記物表達(dá)的影響

將psiCHECK-2-Intron表達(dá)重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞，48 h后通過(guò)Western-blotting和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分別從蛋白和mRNA水平檢測(cè)N-cadherin、β-catenin、以及Snail 3種EMT相關(guān)分子標(biāo)記物的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，Intron組明顯降低了N-cadherin、β-catenin和Snail的表達(dá)(P<0.001，P<0.01)，見(jiàn)圖8。

A：qRT-PCR檢測(cè)N-cadherin、β-catenin、Snail的表達(dá)。B：Westernblotting檢測(cè)N-cadherin、β-catenin、Snail的表達(dá)圖8 嵌合內(nèi)含子對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的影響Fig 8 The effect of chimeric introns on the expression of molecular markers related to epithelial-mesenchymal transition

3 討論

影響外源基因表達(dá)的因素有很多，比如啟動(dòng)子、沉默子、增強(qiáng)子、信號(hào)肽及所處的表達(dá)條件等[13]。在哺乳動(dòng)物中，內(nèi)含子作用和功能直到最近才被人們所認(rèn)識(shí)[16]。某些特定的內(nèi)含子可能包含一個(gè)或多個(gè)可以促進(jìn)基因表達(dá)的生物學(xué)特征，有研究表明內(nèi)含子可能包括了某些增強(qiáng)元件[17]或特定序列[18]從而促進(jìn)了翻譯的過(guò)程。還有一些內(nèi)含子對(duì)于基因的表達(dá)有直接或間接的抑制作用[19,20]。而且內(nèi)含子在不同細(xì)胞系中的作用也存在差異，Huang等[21]討論了嵌合內(nèi)含子序列IVS對(duì)氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)在不同細(xì)胞中的表達(dá)的影響，他們發(fā)現(xiàn)CAT表達(dá)活性最高的是在中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)中，其次是在人腎上皮細(xì)胞系(293T)中，最低的是在海拉細(xì)胞系(Hela)中。另外，內(nèi)含子上游不同的啟動(dòng)子對(duì)其功能的發(fā)揮也存在影響，Xu等[22]比較了內(nèi)含子在兩個(gè)啟動(dòng)子SV40與CMV的啟動(dòng)下對(duì)熒光素的表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)CMV是SV40作用的兩倍。

為了研究?jī)?nèi)含子在肺癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告載體將內(nèi)含子插入到海腎熒光素酶下游的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞株中得以表達(dá)，研究其對(duì)PC-9細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力以及EMT的影響。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤細(xì)胞在人體中的遷移和侵襲過(guò)程，顯示PC-9細(xì)胞侵襲能力的降低。然后進(jìn)一步檢測(cè)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)3種分子標(biāo)志物：N-cadherin、Snail和β-catenin的表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)嵌合內(nèi)含子下調(diào)了以上3種標(biāo)志物的表達(dá)，這說(shuō)明該內(nèi)含子在一定程度上抑制了PC-9細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。本研究選擇PC-9細(xì)胞株作為受試細(xì)胞，是因?yàn)樗哂信囵B(yǎng)簡(jiǎn)單，細(xì)胞容易貼壁和高轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)[23]。

本研究中應(yīng)用了由Promega公司研發(fā)的雙熒光素酶報(bào)告載體(psiCHECK-2TM)，它同時(shí)攜帶了以上兩種報(bào)告基因，這樣能夠在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)兩種熒光素酶活性，而不必分開(kāi)進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)操作的效率，節(jié)省了時(shí)間，而且也能在很大限度上減少樣本污染的機(jī)率，同時(shí)也在最大程度上減少了不同批次內(nèi)和批次間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異，為科研工作帶來(lái)了很大便利。此外，兩個(gè)熒光素酶基因都有獨(dú)立的啟動(dòng)子和終止位點(diǎn)，二者單獨(dú)表達(dá)且互不干擾[24]。將研究的目的基因克隆到位于海腎熒光素酶下游的多克隆位點(diǎn)，通過(guò)比較過(guò)表達(dá)或者干擾miRNA后檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，可以定量檢測(cè)miRNA對(duì)目的基因的調(diào)控作用[25]，還可以結(jié)合定點(diǎn)突變等方法確定miRNA和靶基因3'UTR的作用位點(diǎn)[26]。本研究中應(yīng)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)快速檢測(cè)報(bào)告蛋白表達(dá)活性，從而可以在最短的時(shí)間內(nèi)確認(rèn)質(zhì)粒的構(gòu)建是否成功以及在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。

本研究也存在不足之處。因?yàn)闀r(shí)間的限制，本研究只選擇了PC-9細(xì)胞株作為受試細(xì)胞。將來(lái)我們考慮增加另一種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株進(jìn)行驗(yàn)證使結(jié)論更有說(shuō)服力。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了嵌合內(nèi)含子能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9的EMT轉(zhuǎn)化能力。該結(jié)論為臨床對(duì)非小細(xì)胞肺癌診斷、治療提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。

鳴謝

感謝貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)系王琴容副教授對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。