侯 任，盧 劍，楊曉宇，張為遠(yuǎn)

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 541000；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，北京 100020)

宮頸癌是女性第四大常見惡性腫瘤及第四大因惡性腫瘤死亡的疾病，世界上每年有約569847例新患病例，約311365例女性死于該疾病。在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，宮頸癌的死亡率仍僅次于乳腺癌位居第二[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomaviruss,HR-HPV)持續(xù)感染是高級別上皮內(nèi)病變發(fā)生并發(fā)展為宮頸癌的主要和必需因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)99%的宮頸癌與HPV感染有關(guān)，而HPV16和HPV18亞型感染是世界上最為廣泛流行的兩種高危亞型，分別導(dǎo)致了約70%的宮頸鱗狀細(xì)胞癌及約90%的宮頸腺癌[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3]，HPV16是導(dǎo)致北京市婦女宮頸病變惡性進(jìn)展的最主要HPV亞型。HPV18是北京市婦女易感的5種主要HPV亞型之一，但與HPV16相比，其感染率較低。HPV是一種常見的小DNA雙鏈病毒，HPV基因組中包含開放閱讀框(open reading frame，ORF)的DNA編碼鏈可分為3個(gè)區(qū)域，即早期蛋白編碼區(qū)(early region，ER)、晚期蛋白編碼區(qū)(late region，LR)，非編碼區(qū)：長控制區(qū)(long control region，LCR)。早期區(qū)域編碼8個(gè)開放閱讀框，其產(chǎn)物E2、E6和E7均參與HPV DNA的整合調(diào)控。E2蛋白是一種調(diào)節(jié)蛋白，參與病毒DNA復(fù)制、游離基因維護(hù)和病毒轉(zhuǎn)錄，E2基因的斷裂缺失和表達(dá)缺少解除了對E6、E7基因的抑制作用，導(dǎo)致E6、E7基因過度表達(dá)。而E6、E7蛋白分別通過與抑癌基因p53和pRb結(jié)合，導(dǎo)致p53蛋白和pRb蛋白失活，最終導(dǎo)致感染HR-HPV細(xì)胞持續(xù)增殖，是病毒基因發(fā)生整合的重要標(biāo)志[4]。本文通過real-time PCR技術(shù)檢測HPV16和HPV18兩種亞型的DNA在宿主細(xì)胞中的存在狀態(tài)，探討這兩種亞型感染與宮頸病變發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 156例石蠟標(biāo)本取自2016年1月至2018年2月北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科及腫瘤科。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～68歲；無全子宮切除史；無宮頸手術(shù)史；近兩年內(nèi)無婦產(chǎn)科檢查和(或)藥物治療史；無盆腔放射治療史；近3天無性生活的已婚女性。予以行宮頸液基細(xì)胞檢查(ThinPrep liquid-based cytology test，TCT)后根據(jù)細(xì)胞學(xué)TBS-2014(the Bethesda system，宮頸/陰道細(xì)胞診斷報(bào)告系統(tǒng))分類法診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示為意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)及以上病變，包括低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)。經(jīng)HPV快速導(dǎo)流雜交法(檢測試劑及儀器由潮州凱普生物化學(xué)有限公司提供)分型檢測明確為HPV16感染者132例，HPV18感染者24例。宮頸活組織檢查提示宮頸炎癥17例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級20例，CINⅡ級45例，CINⅢ級48例，宮頸癌(cervical cancer，CC)26例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 DNA提取試劑盒購自潮州凱普生物化學(xué)有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購自美國ABI生物科技公司；RT-PCR儀選自美國ABI 7300 real time-PCR儀；引物、Taqman探針由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.2 DNA提取 將宮頸活組織標(biāo)本立即于10%甲醛固定液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋，將石蠟包埋的標(biāo)本切為5μm厚切片，取5片置1.5ml PE離心管，脫蠟、晾干。加DNA提取液，經(jīng)孵育、震蕩、離心、洗脫，提取DNA，溶于60μl游離水，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) 采用實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR，RT-PCR)進(jìn)行HPV16和HPV18型整合狀態(tài)檢測，分別擴(kuò)增HPV16 E2和E6基因及HPV18 E2和E7基因。HPV整合狀態(tài)的檢測均在不知道細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)結(jié)果的情況下進(jìn)行，所用引物見表1，反應(yīng)體系及反應(yīng)時(shí)間按照試劑說明書進(jìn)行。

表1 RT-PCR所用引物

1.2.4 HPV16和HPV18 E2、E6/E7基因擴(kuò)增產(chǎn)物的半定量分析 繪制HPV16的E2和E6標(biāo)準(zhǔn)曲線及HPV18的E2和E7標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算機(jī)自動(dòng)根據(jù)每一待檢標(biāo)本的擴(kuò)增曲線所確定的E2和E6/E7的Ct值，計(jì)算各模板的E2、E6/E7起始拷貝數(shù)。通過E2/E6或E2/E7比值判斷HPVl6和HPV18感染的體內(nèi)狀態(tài)：E2/E6或E2/E7比值接近或大于1為HPV感染游離狀態(tài)；0

圖1 HPV16不同存在狀態(tài)的E2、E6 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖像N：陰性空白對照；1～2：HPV16游離狀態(tài)；3～4：HPV16整合狀態(tài)；5～6：HPV16混合狀態(tài)

圖2 HPV18不同存在狀態(tài)的E2、E7 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖像N：陰性空白對照；1：HPV18混合狀態(tài)；2～3：HPV18整合狀態(tài)；4～5：HPV18游離狀態(tài)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)初步分析HPV16和HPV18各種存在狀態(tài)對宮頸組織病變及細(xì)胞學(xué)的影響。應(yīng)用比值比(odds ratios，OR)值和95%可信區(qū)間(95% confidence intervals，95%CI)用于描述HPV整合狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。所有統(tǒng)計(jì)為雙側(cè)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV16 DNA存在狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系 HPV16陽性的132例宮頸組織中包括宮頸炎癥組織11例，CINⅠ 15例，CINⅡ 40例，CINⅢ 48例，CC 18例。炎癥組織中均未見整合形式的HPV16出現(xiàn)，均為游離型HPV16感染。游離型HPV16存在于各個(gè)級別的宮頸組織中，隨宮頸病理學(xué)級別的升高，游離型HPV16的感染率逐漸降低，E2基因出現(xiàn)斷裂的比率逐漸升高，但各組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR=0.625，95%CI=0.151～2.586，P>0.05，r=0.113)。游離和整合基因構(gòu)成的混合型HPV16感染率隨宮頸病變級別升高而升高，特別在CINⅢ和CC中，混合型HPV16感染率最高(39.6%和38.9%)。CINⅡ和CINⅢ組的混合型HPV16感染率有顯著差異(P<0.05)，其他幾組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各級別宮頸病變組相比較，HPV16完全整合率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 HPV16 DNA存在狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系

*P<0.05 vs CINⅡ

2.2 HPV18 DNA存在狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系 HPV18陽性的24例宮頸組織中，宮頸炎癥組織6例，CIN組織10例，CC組織8例。HPV18陽性的炎癥組織中HPV常以游離形式存在(66.7%)，在宮頸病變的早期(CINⅠ)中病毒以完全整合形式的比率達(dá)60%，但在高級別宮頸病變中的完全整合率僅為20%，兩者相比有顯著差異(P<0.05)。8例CC組織中HPV18均以完全整合狀態(tài)存在。所有研究組中，僅CINⅠ組中有混合形式的HPV18存在(20%)，而其他各組中HPV18僅以游離型和完全整合型的狀態(tài)存在(表3)。

表3 HPV18 DNA存在狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系

2.3 HPV DNA整合與宮頸細(xì)胞學(xué)改變的關(guān)系 納入研究的宮頸細(xì)胞學(xué)為ASCUS及以上的HPV16/18感染的156例宮頸組織中，細(xì)胞學(xué)判讀為ASCUS的病例35例，LSIL 47例，HSIL 74例。HPV16/18感染的宮頸脫落細(xì)胞中，多數(shù)HPV以游離形式存在于各級別的細(xì)胞學(xué)判讀級別中，隨著細(xì)胞學(xué)判讀級別的升高，以游離形式的HPV所占比率從ASCUS的74.3%降至HSIL的52.7%(χ2=10.863，P<0.05)，完全整合形式的HPV并沒有隨著細(xì)胞學(xué)嚴(yán)重程度的增加而明顯增加(χ2=0.090，P>0.05)；但是鄰近的細(xì)胞學(xué)判讀級別之間,HPV的3種存在形式均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表4)。

表4 HPV16/18基因存在狀態(tài)與細(xì)胞學(xué)結(jié)果的關(guān)系

3 討 論

宮頸癌是目前唯一可通過早期篩查及早期干預(yù)就能降低其發(fā)病率及死亡率的婦科惡性腫瘤。CIN的惡性進(jìn)展是宮頸浸潤癌發(fā)生的基礎(chǔ)，但仍有約60%的CIN出現(xiàn)良性轉(zhuǎn)歸。臨床上病理診斷為CINⅠ～Ⅱ，并不能根據(jù)形態(tài)學(xué)的改變來預(yù)測其發(fā)展的趨勢。病毒基因整合于宿主細(xì)胞中，既往認(rèn)為是HPV導(dǎo)致宮頸病變惡性進(jìn)展的主要標(biāo)志及關(guān)鍵步驟[6]。E6和E7蛋白與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白相互作用，具有致癌能力。典型的病毒基因的整合過程是E2基因斷裂，同時(shí)伴有E6/E7基因的過度表達(dá)。E6和E7都不具有內(nèi)源性酶活性，但通過與宿主細(xì)胞蛋白的直接和間接相互作用而發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致DNA復(fù)制過程的紊亂，促使HPV基因整合到染色體，造成宿主細(xì)胞的不穩(wěn)定[6-7]。與此同時(shí)，E2基因斷裂也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的表達(dá)[8]。HR-HPV持續(xù)感染發(fā)展至宮頸高級別瘤變的風(fēng)險(xiǎn)較高，可能因病毒基因組以整合狀態(tài)存在時(shí)，一方面難以被細(xì)胞免疫所清除，另一方面由于E2負(fù)調(diào)控蛋白的缺失增加了病毒癌基因的表達(dá)，這些因素均促進(jìn)了病毒持續(xù)感染的發(fā)生[9]。

本研究中，CINⅠ組織中HPV16 E2基因斷裂率為33.3%，并且完全以整合形式存在可達(dá)13.3%；HPV18感染的病例中，正常組織中完全整合率達(dá)33.3%。在宮頸病變早期發(fā)生的HPV整合狀態(tài)，可能是在HPV感染的宮頸上皮細(xì)胞中，E6和E7蛋白的過表達(dá)明顯增加了宮頸病變早期階段的宿主細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率，而導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)育不良[10]。這些發(fā)生染色體畸變的宿主細(xì)胞可存在于低級別病變甚至正常宮頸組織中，但成為宮頸病變惡性進(jìn)展的前提。一項(xiàng)對428例宮頸HPV16陽性婦女進(jìn)行跟蹤隨訪研究顯示，持續(xù)感染的HPV16常以整合形式存在，證實(shí)宮頸病變程度可能與病毒載量之間無顯著相關(guān)性，而病毒與宿主基因組整合后，改變了基因的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致病變程度明顯升高[11]。感染HPV16的CINⅡ+組織很少發(fā)生逆轉(zhuǎn)為低級別病變的現(xiàn)象，而感染其他病毒的CINⅡ+組織可有40%發(fā)生逆轉(zhuǎn)[12]。這與本研究相似，隨著宮頸病變級別的升高，HPV16 E2基因出現(xiàn)斷裂的現(xiàn)象逐漸增高，在CC組織中可達(dá)44.5%，但與已發(fā)生宮頸病變的各組組織相比，并無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可能是因HPV16的整合形式可形成一個(gè)超級增強(qiáng)子樣的元件來驅(qū)動(dòng)病毒癌基因的轉(zhuǎn)錄，并且超級增強(qiáng)子除了驅(qū)動(dòng)E6/E7的高表達(dá)外，還能促進(jìn)鄰近基因的轉(zhuǎn)錄，提高了病毒感染的持續(xù)性[13]。這也可以解釋在本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的HPV16在各個(gè)病理級別中的感染率均較高的現(xiàn)象[3]。

HPV18陽性宮頸病變組織的E2基因斷裂情況比HPV16陽性常見，幾乎所有的HPV18均以整合的形式存在于宮頸癌組織細(xì)胞中；HPV16感染的宮頸組織中，即使在CC中病毒也常以游離狀態(tài)和整合狀態(tài)的混合形式出現(xiàn)，而整合率并不高[14]。這與本研究結(jié)果相似，HPV16感染的宮頸癌組織中，以整合形式存在的HPV16占44.5%(包括混合型和整合型)，而在HPV18感染的宮頸癌組織中，病毒卻全部以完全整合的形式存在。這可能是因?yàn)橄噍^于HPV18 DNA，HPV16 3'LCR的甲基化水平較高，導(dǎo)致E2蛋白對E6和E7癌基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)性控制喪失，使得在HPV16感染的宮頸癌組織中仍有游離的DNA存在，而在HPV18陽性組織中，E2基因斷裂發(fā)生頻繁[15]。推測在HPV16亞型感染的宮頸癌中，不僅僅因HPV整合這一個(gè)元素導(dǎo)致了宮頸病變的惡性進(jìn)展，還可能與其他因素相關(guān)或協(xié)同作用有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HPV18感染的宮頸組織中，病毒的整合狀態(tài)分別以33%及60%的比例出現(xiàn)在宮頸炎癥組織和CINⅠ組織中，但CINⅡ+組織中僅占20%。這可能是因?yàn)镠PV18型常與宮頸腺細(xì)胞癌相關(guān)，而腺細(xì)胞癌的發(fā)病率低，總樣本量少所致；此外與HPV18相關(guān)的病變常很快地經(jīng)癌前病變的窗口期而直接迅速進(jìn)展為宮頸癌[16]，在宮頸病變CINⅡ階段所能檢測到的病例量不足。因此，感染HPV18可能更易導(dǎo)致宮頸細(xì)胞染色體的不穩(wěn)定性，使得較快經(jīng)過高級別宮頸病變期而侵襲致宮頸癌[17]。

不同亞型的HPV基因的生物學(xué)性狀有很大差異，因此HPV16和HPV18感染的宮頸組織細(xì)胞中，不同病理級別中病毒的整合水平可能直接關(guān)系到病毒的傳染性和持續(xù)感染性[18]。HPV16雖然常以游離的形式存在，但是傳染性較高，持續(xù)感染時(shí)間久；HPV18的感染率雖很低，但卻較快經(jīng)過癌前病變期進(jìn)入宮頸癌期。

在宮頸細(xì)胞學(xué)與HPV存在狀態(tài)的研究中，宮頸細(xì)胞學(xué)為ASCUS的病例中有17.1%的整合狀態(tài)的HPV16/18存在。這是病毒基因整合到宿主細(xì)胞作為宮頸病變的早期事件在細(xì)胞學(xué)的另一個(gè)體現(xiàn)。在各級別細(xì)胞學(xué)改變中均有游離或整合形式的HPV存在，這與之前學(xué)者得出的結(jié)論不同，在細(xì)胞學(xué)陰性或LSIL以下的宮頸細(xì)胞中只存在游離形式的HPV，而高級別的細(xì)胞學(xué)改變中沒有單純游離形式的HPV存在[19]。隨著細(xì)胞學(xué)病理級別的增高，游離型HPV16/18的感染率逐漸降低(74.3%，61.7%，52.7%)，雖然病毒以游離的形式存在于宮頸病變的各個(gè)時(shí)期，但E2基因的斷裂/消失情況逐漸增多?？梢姴《景┗虻拇嬖跔顟B(tài)和表達(dá)可以作為評估宮頸病變惡性進(jìn)展的輔助手段，從而有助于預(yù)測宮頸病變的進(jìn)展[20]。

總之，HPV基因的整合會(huì)在宮頸疾病的早期進(jìn)展過程中出現(xiàn)，而整合現(xiàn)象的出現(xiàn)并不是導(dǎo)致宮頸疾病惡性進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而是一個(gè)重要的分子生物學(xué)過程。病毒整合狀態(tài)的檢測比單純HPV分型檢測更有臨床意義，整合狀態(tài)的檢測可作為一種生物標(biāo)記用來預(yù)測宮頸病變的進(jìn)展情況以用來評估宮頸惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。不同的HPV亞型在致病的生物學(xué)和分子學(xué)性狀有顯著的不同，了解不同亞型的HPV基因存在狀態(tài)對宮頸病變的規(guī)律有利于盡早準(zhǔn)確判斷宮頸病變的惡性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，提高宮頸疾病的防治效率，指導(dǎo)臨床治療及隨訪策略的制定，對預(yù)防性疫苗的改良和新的治療方法的研制也有著深遠(yuǎn)的意義，也必將成為預(yù)防領(lǐng)域的新視角。