腦轉(zhuǎn)移及動(dòng)物模型制備的研究進(jìn)展

趙 峰，楊林杰,2，周曉坤，呂 良*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，廣西 桂林 541199；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530021；3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 桂林 541001）

惡性腫瘤腦轉(zhuǎn)移（brain metastases）被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展過程中的晚期事件，對(duì)患者的生存質(zhì)量和生存進(jìn)程有著破壞性的影響。所有部位惡性腫瘤發(fā)生腦部（包括腦實(shí)質(zhì)與腦膜）轉(zhuǎn)移的總發(fā)病率約為10%，常見發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤包括：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤及腎癌[1]。研究表明[2]，隨著分子靶向藥物的治療，肝癌等的腫瘤患者生存時(shí)間得到延長(zhǎng)，腦轉(zhuǎn)移的發(fā)病率也呈上升的趨勢(shì)。腦轉(zhuǎn)移的治療是棘手的，目前的治療方式以手術(shù)、全腦放療、立體定向放射治療及化療為主，但均是姑息性的，預(yù)后仍然很差[3]。建立理想的腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型對(duì)于腦轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探究與治療藥物的研發(fā)具有重要的意義，本文概述腦轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制，并就腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的制備方式、應(yīng)用及進(jìn)展作一綜述。

1.腦轉(zhuǎn)移機(jī)制概述

經(jīng)典的“種子與土壤”假說認(rèn)為，作為“種子”的腫瘤細(xì)胞，只有那些增殖能力強(qiáng)、更具遷移力和侵襲力的腫瘤細(xì)胞可以成功實(shí)現(xiàn)腦部的轉(zhuǎn)移。有研究[4]將相匹配的原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)比較，證實(shí)盡管轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的腫瘤同源，但是存在有部分基因擴(kuò)增或缺失、過度表達(dá)或激活、表達(dá)不足或失活，說明腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位發(fā)生了獨(dú)特的改變。這些轉(zhuǎn)移灶內(nèi)發(fā)生的與其原發(fā)部位不同的基因型改變的包括有CDKN2A和PIK3CA的不同突變、PTEN的丟失、ERBB2的擴(kuò)增等，這些基因改變涉及細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和生存的調(diào)控。作為“土壤”的腦部定植部位，通過細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使局部微環(huán)境發(fā)生改變，如引發(fā)炎癥反應(yīng)、增加血管內(nèi)皮通透性、破壞血腦屏障功能、促血管生成等。

血行轉(zhuǎn)移是其主要轉(zhuǎn)移途徑，如圖1所示，一般會(huì)經(jīng)歷：腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶分離、侵入血管、通過血液循環(huán)運(yùn)輸、到達(dá)腦部并滲出血管、腦組織內(nèi)定植生長(zhǎng)。

圖1 惡性腫瘤腦轉(zhuǎn)移一般過程簡(jiǎn)圖

轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過程涉及復(fù)雜及串?dāng)_的分子機(jī)制。首先，腫瘤細(xì)胞通過主要由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β通路（TGF-β）參與調(diào)控的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）獲得間質(zhì)細(xì)胞所具有的遷移和侵襲能力從原發(fā)部位脫離[5]，繼而富集在血管周邊的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，這些因子以血管為中心擴(kuò)散，從而形成了一個(gè)指向血管的濃度梯度，從原發(fā)灶脫落的腫瘤細(xì)胞可以沿著這一濃度梯度向血管作趨化運(yùn)動(dòng)[6]。在這一過程中，血管附近巨噬細(xì)胞分泌的EGF，腫瘤細(xì)胞分泌的CSF-1等趨化因子發(fā)揮了重要作用。在血液循環(huán)系統(tǒng)中，血小板為腫瘤細(xì)胞的存活提供了保護(hù)，它會(huì)粘附于腫瘤細(xì)胞表面形成血小板-腫瘤細(xì)胞聚合體，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫識(shí)別[7]。腫瘤細(xì)胞到達(dá)腦部，被毛細(xì)血管截留（循環(huán)停止），被認(rèn)為是其主要的捕獲機(jī)制[8]。

腦部具有其獨(dú)特的解剖、代謝、免疫微環(huán)境，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等是其主要細(xì)胞成分，血腦屏障（BBB）、血腦脊液屏障（BCSFB）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的守門人，通過封閉腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或特殊的上皮和軟腦膜細(xì)胞的緊密連接的作用，保護(hù)大腦免受大規(guī)模炎癥的潛在致命后果[9-10]。既往大腦被認(rèn)為是免疫特權(quán)器官的場(chǎng)所，事實(shí)上，現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和腎癌患者腦轉(zhuǎn)移中存在腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞[11]。此外，組織蛋白酶S被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者的腦轉(zhuǎn)移中表達(dá)顯示其介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞通過BBB的遷移[12]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦轉(zhuǎn)移的過程中起到了重要的作用，研究表明其可以通過激活腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中的PPARγ[13]、促進(jìn)縫隙連接轉(zhuǎn)運(yùn)cGAMP從而激活癌細(xì)胞的STAT1和NF-κB通路[14]、調(diào)節(jié)CXCL10-CXCR3軸[15]等促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移的發(fā)展。腦部微環(huán)境是決定腦轉(zhuǎn)移發(fā)展的中心因素，因此，剖析腫瘤細(xì)胞跨BBB、阻斷腦自然防御及與其他細(xì)胞間的相互作用有助更好地理解解腦轉(zhuǎn)移生物學(xué)的關(guān)鍵信息。

2.腦轉(zhuǎn)移模型制備策略

研究腦轉(zhuǎn)移的“最佳”模型應(yīng)該取決于所要聚焦的方向。在腫瘤的異質(zhì)性或人類特有的基因變化的研究中，因具有重現(xiàn)人類遺傳和表觀遺傳改變以及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的優(yōu)勢(shì)，以裸鼠為代表的異種移植模型往往是最佳選擇，但代價(jià)是犧牲宿主中完整的免疫系統(tǒng)[16]。免疫活性人源化受體小鼠用于建立人類來源的異種移植物的最新進(jìn)展也許是一個(gè)具有前景的選擇[17]。因此，如果聚焦于癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相互作用，那么同基因或免疫活性動(dòng)物是理想的。如果聚焦于原發(fā)腫瘤向轉(zhuǎn)移腫瘤的進(jìn)展上，那么基因工程小鼠模型（GEMM）是理想的。此外，使用熒光標(biāo)記細(xì)胞并利用生物發(fā)光成像進(jìn)行追蹤[18]、以三維微流控系統(tǒng)模擬血腦屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[19]、器官型腦片培養(yǎng)[20]等重要的研究技術(shù)目前已成為腦轉(zhuǎn)移研究手段中不可或缺的組合策略。

3.腦轉(zhuǎn)移腫瘤接種方式

理想的腦轉(zhuǎn)移模型可完全概括轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)，擁有完整的免疫系統(tǒng)，因此原發(fā)腫瘤的自發(fā)腦轉(zhuǎn)移模型具有很高價(jià)值?，F(xiàn)實(shí)科研實(shí)踐中，綜合研究目的、效率與準(zhǔn)確的平衡、藥物篩選等的客觀需求，如圖2所示，目前主流的實(shí)驗(yàn)方法是將親腦細(xì)胞系通過注射移植以誘導(dǎo)腦部轉(zhuǎn)移。

圖2 腦轉(zhuǎn)移造模接種方式示意圖

3.1 腦立體定位注射

Soto等[21]詳細(xì)介紹了借助于腦立體定位儀進(jìn)行腫瘤細(xì)胞直接腦內(nèi)植入造模的方法，這種模型涵蓋了轉(zhuǎn)移過程的播種和定植階段，可用于分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定區(qū)域內(nèi)的腫瘤增殖和腫瘤-宿主細(xì)胞相互作用。Wang等[22]將保留有部分腫瘤基質(zhì)的人源腦轉(zhuǎn)移組織直接植入裸大鼠腦內(nèi)，采用MRI、免疫組化、DNA拷貝分析等將異種移植物與患者的腫瘤進(jìn)行比較。模型腦轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出與臨床觀察相似的放射學(xué)特征，原發(fā)腫瘤、患者腦轉(zhuǎn)移瘤和異種移植瘤在組織學(xué)和生長(zhǎng)模式上有顯著的相似性，DNA拷貝數(shù)分析顯示染色體含量的增加和減少有很強(qiáng)的相似性，因此這種腦轉(zhuǎn)移模型可作為評(píng)估治療反應(yīng)和研究腫瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移背后機(jī)制的一個(gè)重要工具。

3.2 尾靜脈注射

張峻青等[23]使用人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-14反復(fù)通過尾靜脈注射接種裸鼠以篩選出特異性腦轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株。一次接種約25%的裸鼠產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移，經(jīng)4個(gè)循環(huán)反復(fù)接種篩選得到具有腦轉(zhuǎn)移特異性的PC-14/B細(xì)胞株，篩選獲得的亞株經(jīng)尾靜脈注射可產(chǎn)生4/5的腦轉(zhuǎn)移。杜琴等[24]將肺癌細(xì)胞A549與卵巢癌細(xì)胞Skov3分別通過尾靜脈、腹腔、頸動(dòng)脈及顱內(nèi)途徑接種（每組16只裸鼠），結(jié)果顯示尾靜脈注射、腹腔注射和頸動(dòng)脈注射途徑Skov3細(xì)胞組未發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)成瘤，A549細(xì)胞組前兩種方式各發(fā)生2例，后者發(fā)生8例顱內(nèi)成瘤，認(rèn)為血腦屏障可能在阻止卵巢癌腦轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用。因此，尾靜脈注射方式在篩選高特異性腦轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞株、研究某些腫瘤相對(duì)較少發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的機(jī)制中有其特殊的意義。

3.3 左心室注射

Conley[25]詳細(xì)介紹了左心室注射的操作技術(shù)：麻醉后仰臥位固定小鼠，前胸壁消毒后在上胸廓做中線切口，露出鎖骨和上肋骨，確定第二肋間隙，將注射針插入約4mm，從胸骨左側(cè)2mm開始與胸壁呈45°角將針頭插入左心室，緩慢注射總體積約200μl（1×105個(gè)細(xì)胞）的腫瘤細(xì)胞懸液，注射完畢退針封閉切口。

陳愉生等[26]對(duì)比經(jīng)胸腔原位種植與經(jīng)左心室注射建立肺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，結(jié)果顯示使用人肺腺癌PC-9細(xì)胞通過兩種方式造模，前者腦轉(zhuǎn)移率為11.1%，后者腦轉(zhuǎn)移率為100%，說明左心室注射法保證了更高的腦轉(zhuǎn)移率。

Bos等[27]使用ER-的人源乳腺癌細(xì)胞CN34與具有肺、骨轉(zhuǎn)移傾向的ER-的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231通過左心室注射方法接種于免疫缺陷雌性小鼠，篩選出具有腦轉(zhuǎn)移特異性的亞克隆，對(duì)其進(jìn)行基因表達(dá)及功能分析，確定了環(huán)氧合酶COX2、表皮生長(zhǎng)因子配體HBEGF、α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GALNAC5是作為癌細(xì)胞通過血腦屏障的關(guān)鍵介質(zhì)。

左心室注射方式大多數(shù)小鼠耐受手術(shù)且顯著降低個(gè)體動(dòng)物的總腫瘤負(fù)擔(dān)，接種的細(xì)胞避免了肺毛細(xì)血管床的阻滯直接進(jìn)入體循環(huán)，通過動(dòng)脈系統(tǒng)向腦部轉(zhuǎn)移，到達(dá)腦部后進(jìn)行粘附、增殖、遷移等一系列生物學(xué)行為，提高了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率亦很好的部分模擬了血行播散過程。

3.4 頸動(dòng)脈注射

Zhang等[28]介紹了頸動(dòng)脈注射的具體操作步驟：仰臥位固定小鼠，吸入麻醉后頸部消毒，行頸部正中切口約1cm，向下鈍性分離暴露頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎阻斷血流，遠(yuǎn)心端打松結(jié)備用，使用31G針頭注射器在解剖顯微鏡下在兩結(jié)之間進(jìn)針并緩慢注射腫瘤細(xì)胞懸液（總體積100μl，含1-5×105個(gè)細(xì)胞），注射完畢后系緊遠(yuǎn)心端結(jié)并關(guān)閉切口。

徐磊等[29]使用GFP標(biāo)記的Lewis肺癌細(xì)胞3LL經(jīng)頸動(dòng)脈注射方式建立C57BL/6X小鼠腦轉(zhuǎn)移模型，造模動(dòng)物手術(shù)存活率93.75%，手術(shù)成功的小鼠術(shù)后發(fā)生腦轉(zhuǎn)移率100%。魏水劍等[30]使用非小細(xì)胞肺癌PC-9細(xì)胞通過頸內(nèi)動(dòng)脈注射方式建立裸鼠腦轉(zhuǎn)移模型并用MRI成像儀經(jīng)行活體檢測(cè)，建模成功率為71%，證明該注射技術(shù)是一種經(jīng)濟(jì)高效的腦轉(zhuǎn)移造模方式。此外，頸動(dòng)脈注射還可以將藥物、病毒顆粒等其他外源性物質(zhì)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)高效輸送，用作評(píng)價(jià)藥物治療效果、研究病原體感染腦部病理機(jī)制的手段[31]。

4.結(jié)語

腦部微環(huán)境作為目前研究的熱點(diǎn)，其獨(dú)特的細(xì)胞類型、解剖結(jié)構(gòu)、代謝特點(diǎn)、免疫環(huán)境與顱外病變微環(huán)境截然不同，對(duì)腫瘤細(xì)胞所施加的選擇性壓力密切影響腫瘤的轉(zhuǎn)移過程和治療反應(yīng)，這凸顯了開發(fā)包含完整的轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)和/或腦部微環(huán)境的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹匾?。本文概述了腦轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制及主要的動(dòng)物模型制備方法，其中立體定向注射可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)生長(zhǎng)的檢測(cè)，心內(nèi)注射和頸動(dòng)脈注射可以模擬癌細(xì)胞向血液中的擴(kuò)散，并可用于研究通過血腦屏障的外滲以及在腦內(nèi)的定植和生長(zhǎng)?，F(xiàn)有的臨床前模型各有側(cè)重的部分揭示了腦轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜的轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過程，未來對(duì)腦部具有趨向性的細(xì)胞系的擴(kuò)充建立、造模方式的優(yōu)化、活體檢測(cè)技術(shù)的完善以及生物信息學(xué)的進(jìn)展將有助于人們更好的認(rèn)識(shí)腦轉(zhuǎn)移生物學(xué)的關(guān)鍵信息從而更有效地針對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)治療。