常綠木質(zhì)藤本植物黑老虎基因組SSR特征分析及引物開發(fā)

（湖南省森林植物園，湖南 長(zhǎng)沙 410116）

黑老虎Kadsura coccinea(Lem.) A.C.Smith 亦稱冷飯團(tuán)，為五味子科Schisandraceae 南五味子屬常綠木質(zhì)藤本，天然分布于東南亞以及我國(guó)南方地區(qū)。黑老虎用途廣泛，在藥材、食品和園林觀賞方面具有廣闊應(yīng)用前景。其果實(shí)富含人體所需的各種氨基酸和維生素C 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，且香甜可口，風(fēng)味獨(dú)特，作為一種新奇水果，在我國(guó)水果市場(chǎng)頗受青睞[2]。黑老虎根和莖富含木脂素和三萜類活性成分[3-4]，其提取物具有顯著的美白護(hù)膚功效[5]；其根亦為一種傳統(tǒng)中藥材，具有抗氧化、降血脂、活血化瘀、行氣止痛等功效，可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打腫痛等病癥[6-7]；黑老虎還具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗HIV 和抗肝纖維化等藥理活性[4]。黑老虎掛果時(shí)間長(zhǎng)，鮮果顏色多樣、色澤艷麗，果形獨(dú)特，亦為優(yōu)良的觀賞植物。

近年來(lái)，由于利益驅(qū)動(dòng)，黑老虎野生資源分布地出現(xiàn)掠奪式采果和挖根現(xiàn)象，生境遭受嚴(yán)重破壞，黑老虎野生資源急劇減少，導(dǎo)致其種質(zhì)資源破壞殆盡，對(duì)于黑老虎遺傳改良將造成不可挽回的損失[8]，開展黑老虎種質(zhì)資源保護(hù)迫在眉睫。另一方面，目前黑老虎在湖南、貴州和廣西等省區(qū)迅速推廣種植，湖南通道縣種植尤為普遍，該縣黑老虎已成為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品和支柱產(chǎn)業(yè)[9]。然而生產(chǎn)上缺乏良種，目前普遍采用挖取野生苗或隨意采種育苗，良種選育研究才開始起步。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記具有信息含量高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、成本較低，而且為共顯性，為學(xué)者們廣泛應(yīng)用[10-12]。本研究首次開發(fā)黑老虎SSR標(biāo)記，旨在為其群體遺傳學(xué)研究、種質(zhì)資源收集、保存與評(píng)價(jià)以及育種計(jì)劃制定等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

在湖南共收集到黑老虎及其近緣種91 個(gè)植株的嫩葉（表1），包括會(huì)同、城步和桂東天然群體的66 個(gè)黑老虎植株，南岳樹木園10 個(gè)南五味子K.longipedunculata植株，南岳林場(chǎng)4 個(gè)異形南五味子K.heteroclita、4 個(gè)翼梗五味子Schisandra henryi、5 個(gè)華中五味子S.sphenanthera和2 個(gè)狹葉五味子S.lancifolia等15 個(gè)植株。采樣植株間的距離在30 m 以上。嫩葉采用硅膠干燥，應(yīng)用改良的CTAB 法提取其DNA[13]。

表1 用于SSR 標(biāo)記開發(fā)的南五味子屬和五味子屬樣品信息?Table 1 Information of all Kadsura and Schisandra samples for SSR markers development

1.2 高通量測(cè)序

從湖南省城步群體選取1 個(gè)黑老虎植株的總DNA 用于SSR 位點(diǎn)搜索。利用DNA 片段化試劑盒AIRTMDNA Fragmentation Kit （Bioo Scientific Corp.,Austin,USA）將其總DNA 打斷。經(jīng)切膠純化，選取其中300～500 bp 的片段，應(yīng)用高通量快速建庫(kù)試劑盒NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific Corp.,Austin,USA） 建庫(kù)。利用Illumina HiSeq 2000 PE 150 平臺(tái)（Illumina,San Diego,USA）進(jìn)行高通量測(cè)序。獲得下機(jī)序列后，應(yīng)用Trimmomatic 軟件[14]對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，刪除其中Q20＜90%和正反向序列不匹配比率高于10%的序列。應(yīng)用SPAdes 3.9.0 軟件[15]對(duì)序列進(jìn)行基因組拼接，參數(shù)選擇默認(rèn)值。

1.3 SSR 挖掘與引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用軟件MISA[16]（http://pjrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對(duì)拼接好的序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)搜索，其參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)單元樣式為單、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)，其最小重復(fù)次數(shù)分別為10、5、4、3、3 和3；復(fù)合位點(diǎn)的重復(fù)單元間序列堿基數(shù)不超過(guò)20。獲得含有SSR 位點(diǎn)的序列后，應(yīng)用軟件Primer 3[17]（http://fokker.wi.mit.edu/primer3/）設(shè)計(jì)引物，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

1.4 引物篩選與位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

從會(huì)同、城步和桂東群體各選取1 個(gè)DNA樣品對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，確定實(shí)驗(yàn)體系并檢測(cè)引物的可用性。為了方便后續(xù)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，選擇單元重復(fù)數(shù)不小于7 的SSR 位點(diǎn)合成160 對(duì)引物，并在其正向引物的5′端增加一段M13 序列（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)采用10 μL 體系，具體包括：50 ng DNA 模板、150 μM dNTPs、2.0 μM MgCl2、0.5 μM M13 標(biāo)記正向引物、0.5 μM 反向引物、1×PCR 緩沖液（天根生化科技有限公司，北京）和0.04 U/μL Taq DNA 聚合酶（天根生化科技有限公司，北京）。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR 擴(kuò)增儀Master cycler Gradient Thermal Cycler （Eppendorf）上 進(jìn)行，其程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 4 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；最終產(chǎn)物保存于4℃冰箱。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇給定片段長(zhǎng)度位置具有清晰且單一條帶的引物，用于后續(xù)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)。

選取會(huì)同、城步、桂東群體的66 個(gè)DNA 樣品，應(yīng)用M13-tailed 引物法[18]進(jìn)行SSR 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)。其PCR 擴(kuò)增反應(yīng)采用10 μL 體系，具體包括：50 ng DNA 模板、150 μM dNTPs、2.0 μM MgCl2、0.5 μM 熒光標(biāo)記的M13 引物、0.5 μM M13 標(biāo)記的正向引物、0.5 μM 反向引物、1×PCR 緩沖液（天根生化科技有限公司，北京）和0.04 U/μL Taq DNA 聚合酶（天根生化科技有限公司，北京）。擴(kuò)增反應(yīng)程序與前面部分相同。

采用3730 XL自動(dòng)測(cè)序儀（Applied Biosystems，USA 檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，選用內(nèi)標(biāo)為GeneScan 500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems，USA）。使用軟件GeneMarker V2.2.0[19]判讀基因型。進(jìn)一步選取5 個(gè)近緣種的25 個(gè)DNA 樣品（表1）開展引物通用性檢測(cè)。

1.5 遺傳多樣性分析

應(yīng)用MICRO-CHECKER 2.2.3 軟件[20]檢測(cè)和修正啞等位基因；應(yīng)用POPGENE version 1.31 軟件[21]計(jì)算每位點(diǎn)等位基因數(shù)（A）、實(shí)際雜合度（Ho）和期望雜合度（He），檢測(cè)位點(diǎn)是否偏離Hardy-Weinberg 平衡（HWE）以及是否存在連鎖不平衡現(xiàn)象（LD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組SSR 位點(diǎn)的分布特征

通過(guò)序列質(zhì)量控制和拼接組裝獲取687 805條unigene，其中，82 454 條含有SSR；61 032 條可用于設(shè)計(jì)PCR 引物，其預(yù)期產(chǎn)物片段大小為100～280 bp。SSR 重復(fù)長(zhǎng)度為10～100 bp，其平均長(zhǎng)度為14 bp。共獲得152 207 個(gè)候選SSR 位點(diǎn)，其中，二核苷酸重復(fù)比率最大（57.68%），其次為單核苷酸重復(fù)（17.30%）和四核苷酸重復(fù)（10.6%），三核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)的比率低得多，3 者總和為14.32%（表2）。在檢測(cè)到的序列中，單、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)的SSR 位點(diǎn)間平均距離分別7.67、2.30、17.12、12.43、41.41 和39.48 kb。

分析SSR 重復(fù)單元類型可以看出，單核苷酸重復(fù)單元（motif）中，A/T 最為普遍，占98.06%，C/G 僅為1.94%（圖1a）；二核苷酸重復(fù)單元以AC/GT（57.30%）最為普遍，其它依次為AG/CT（36.57%）、AT/AT（6.04%） 和CG/CG（0.09%）（圖1b）；三核苷酸重復(fù)單元有10個(gè)類型，以AAG/CTT 最普遍（41.91%），ACG/CGT 最少（0.34%）（圖1c）；AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT 和ACACAT/ATGTGT 分別是四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)單元中最普遍的，其比率為29.55%、29.18%和40.31%（圖1d—f）。

2.2 SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性分析和種間應(yīng)用

引物篩選結(jié)果表明，參與測(cè)試的160對(duì)引物中，有102 對(duì)能夠清晰擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異片段（clear specific amplicons）；其中40 個(gè)位點(diǎn)具多態(tài)性。而40 個(gè)位點(diǎn)中，有12 個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)多個(gè)片段，難以判讀，因此，成功篩選出28 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（表3）。應(yīng)用3 個(gè)天然群體對(duì)28 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性分析可知，每位點(diǎn)等位基因數(shù)（A）為2～14，共計(jì)168 個(gè)等位基因，實(shí)際雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為 0.000～0.900 和0.000～0.860（表4）。其中9 個(gè)位點(diǎn)可能含有啞基因（95%置信區(qū)間）；對(duì)啞基因進(jìn)行修訂（correction）后發(fā)現(xiàn)，城步、桂東和會(huì)同群體分別有13、7 和9 個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.05）。28 個(gè)位點(diǎn)的所有成對(duì)分析中，均未發(fā)現(xiàn)顯著連鎖不平衡現(xiàn)象（P≥0.05）。

表2 黑老虎基因組SSR 的分布特征Table 2 Distribution of SSRs in the genome of Kadsura coccinea

表3 黑老虎28 個(gè)SSR 多態(tài)位點(diǎn)的特性?Table 3 Characterization of 28 polymorphic SSR loci for Kadsura coccinea.

表4 28 個(gè)SSR 位點(diǎn)在3 個(gè)黑老虎群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)?Table 4 Genetic diversity data of 28 polymorphic SSR loci in three Kadsura coccinea populations

28 對(duì)引物的通用性因植物種類而異。對(duì)于南五味子屬，有24 對(duì)引物可應(yīng)用于南五味子，14 對(duì)引物用于異形南五味子，分別占85.71%和50%；相比而言，28 對(duì)引物在五味子屬中的通用性低得多，僅6、9、7 對(duì)引物分別在翼梗五味子、華中五味子和狹葉五味子獲得成功擴(kuò)增，分別占21.43%、32.14%和25.00%（表5）。從表5還可以看出，有KCZ031、KCZ036、KCZ045、KCZ053、KCZ058、KCZ073、KCZ100、KCZ103、KCZ122、KCZ127、KCZ128、KCZ136、KCZ146、KCZ147 等14 對(duì)引物在南五味子屬的2 個(gè)種均能成功擴(kuò)增；僅引物KCZ147能成功應(yīng)用于南五味子屬和五味子屬的5 個(gè)種，說(shuō)明該引物的通用性最佳。

3 結(jié)論和討論

3.1 黑老虎基因組SSR 的特征

本研究通過(guò)Illumina高通量測(cè)序檢索到152 207個(gè)候選SSR 位點(diǎn)，以二核苷酸重復(fù)的比例最大，占57.69%，AC/GT 基元占二核苷酸重復(fù)總數(shù)的57.30%；單核苷酸和和四核苷酸重復(fù)的比例分別為17.30% 和10.68%，以A/T 和AAAT/ATTT 基元為主，占比為98.06%和29.55%。楊梅Myrica rubar基因組中，二核苷酸重復(fù)的占比高達(dá)82.99%，其中AG/CT 基元出現(xiàn)頻率高達(dá)55.70%，本研究與之基本一致；所不同的是，楊梅基因組中二至六核苷酸重復(fù)的占比呈明顯下降趨勢(shì)[22]，而在本研究中其占比則出現(xiàn)波動(dòng)。王家等[23]亦采用Illumina 高通量測(cè)序開發(fā)山白樹Sinowilsonia henryi的SSR 標(biāo)記，從7 614 條序列中搜索到694個(gè)SSR 位點(diǎn)，以單核苷酸重復(fù)最多，占51.78%，重復(fù)基元以A/T 最多；其次為二核苷酸重復(fù)，占34.01%，以AG/CT 為主；從單核苷酸至六核苷酸重復(fù)，其所占比例整體上越來(lái)越少，本研究與之差異較大。而橢圓葉花錨Halenia ellipitica則以三核苷酸重復(fù)最為豐富，其比例為43.11%，以基元AAT 為主；其次為四、二核苷酸重復(fù)，比例分別為29.31%和21.55%，以重復(fù)基元AAAT 和AT 為主[24]，本研究亦與之明顯不同。說(shuō)明SSR 在基因組的特征因植物種類不同而存在明顯差異。

表5 黑老虎28 個(gè)SSR 位點(diǎn)在近緣種的應(yīng)用?Table 5 Allele numbers obtained in cross-amplification trials of 28 SSR loci for relatives of Kadsura coccinea

3.2 黑老虎SSR 標(biāo)記開發(fā)

開發(fā)SSR 引物有很多種方法，利用高通量測(cè)序獲得SSR 位點(diǎn)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于探針雜交富集等傳統(tǒng)方法。如在五味子科中，Yan 等[25]基于華中五味子的AFLP 片段序列構(gòu)建富集SSR 基因組文庫(kù)，經(jīng)SSR 探針雜交，獲得61 條含有SSR 的序列，設(shè)計(jì)50 對(duì)引物開發(fā)出9 個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記；Sun等[26]基于SSR 探針雜交富集SSR，獲得五味子234 條含SSR 的序列，設(shè)計(jì)137 對(duì)引物開發(fā)出14個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記；而在本研究中，應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序獲得82 454 條含有SSR 的序列，設(shè)計(jì)160 對(duì)引物，獲得28 個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記。在本研究中，我們?yōu)榱颂接懼貜?fù)單元對(duì)引物篩選效率的影響，設(shè)計(jì)的160 對(duì)引物中，二、三、四、五核苷酸重復(fù)各40 對(duì)，由表3可以看出，4 種類型分別開發(fā)出14、8、4、2 對(duì)引物，其等位基因數(shù)依次為5～14、2～8、3～5、2～3，開發(fā)的引物數(shù)和多態(tài)性均呈下降趨勢(shì)。由此可見，引物篩選效率與檢測(cè)引物有關(guān)，宜選擇二、三核苷酸重復(fù)的SSR 位點(diǎn)設(shè)計(jì)并開發(fā)引物。

本研究開發(fā)出的28 對(duì)SSR 引物，分別有24 和14 對(duì)可應(yīng)用于同屬的南五味子和異形南五味子，成功率分別為85.71%和50.00%；而僅有6～9 對(duì)引物在五味子屬的翼梗五味子、華中五味子和狹葉五味子得到成功擴(kuò)增，成功率為21.43%～32.14%。Sun 等[26]亦發(fā)現(xiàn)14 對(duì)五味子SSR 引物中有11 對(duì)可用于同屬的華中五味子，成功率近80%。石曉蒙等[27]從同屬的無(wú)?；礠uercus petraea、蒙古櫟Q.mongolica、夏櫟Q.robur、麻櫟Q.acutissima、遼東櫟Q.liaotungensis5 個(gè)種的62 對(duì)基因組SSR 和EST-SSR 引物中篩選出41 對(duì)可用于栓皮櫟Q.variabilis，成功率達(dá)66.13%。說(shuō)明親緣關(guān)系明顯影響引物的種間應(yīng)用，同屬植物間SSR 引物的通用性要遠(yuǎn)高于不同屬。因此，應(yīng)用別種植物的SSR 引物進(jìn)行篩選時(shí)，盡量選擇親緣關(guān)系近的種。一般而言，宜選擇同屬植物，以提高引物篩選效率以及SSR 標(biāo)記的多態(tài)性。

綜上所述，本研究開發(fā)出28 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)；通過(guò)3 個(gè)天然群體的多樣性分析可知，每位點(diǎn)等位基因數(shù)為2～14，實(shí)際雜合度和期望雜合度分別為0.000～0.900 和0.000～0.860，說(shuō)明這些標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，可用于揭示黑老虎群體間和群體內(nèi)的遺傳多樣性，為我們深入開展黑老虎群體遺傳學(xué)研究、種質(zhì)資源收集、保存和評(píng)價(jià)以及分子標(biāo)記輔助育種研究提供了技術(shù)支撐。本研究開發(fā)的引物數(shù)量對(duì)于基因組關(guān)聯(lián)分析等研究而言尚偏少，然而大量SSR 候選位點(diǎn)序列也為我們將來(lái)大規(guī)模標(biāo)記開發(fā)進(jìn)而為黑老虎基因組關(guān)聯(lián)分析、基因組選擇等奠定了基礎(chǔ)。