密葉紅豆杉SSR位點(diǎn)分布特征及分子標(biāo)記開發(fā)

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

密葉紅豆杉Taxus fuana是西喜馬拉雅山脈特有的常綠裸子植物，近些年才確定了其分類地位[1-3]。密葉紅豆杉分布于阿富汗東部、巴基斯坦北部沿喜馬拉雅山脈向東達(dá)印度西北部、尼泊爾中部和中國西藏的西南部海拔2 500～3 400 m 地帶[4-7]。與同屬的其它物種相比，它是紅豆杉屬植物中現(xiàn)實(shí)分布區(qū)最小，種群數(shù)量最少的多年生異交樹種。密葉紅豆杉心材木質(zhì)堅(jiān)硬、色澤紅潤，其所含的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有明顯的防癌活性，是珍貴的用材和藥用樹種[8-10]。由于當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)野生植物保護(hù)意識(shí)不強(qiáng)，密葉紅豆杉遭盜伐較為嚴(yán)重，隨時(shí)都有瀕臨滅絕的風(fēng)險(xiǎn)，被列為我國重點(diǎn)Ⅰ級(jí)保護(hù)野生植物名錄[11]和《全國極小種群野生植物拯救保護(hù)工程規(guī)劃》的120 種極小種群野生植物之一。因此，開展密葉紅豆杉種群遺傳資源保育工作已刻不容緩。

植物種群遺傳資源保育面臨的主要障礙之一是缺乏對(duì)其遺傳多樣性全面認(rèn)識(shí)，研究的嚴(yán)重滯后制約了對(duì)種群制定合理有效的保護(hù)、保存和利用策略[12]。微衛(wèi)星（Simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記與其它分子標(biāo)記相比，在不同群體和個(gè)體間表現(xiàn)出相對(duì)較高的序列變異性，且具有共顯性特征，是種群遺傳資源保育研究的首選標(biāo)記之一[13-14]。在林木中應(yīng)用SSR 標(biāo)記的難點(diǎn)在于其引物開發(fā)，現(xiàn)今由于測(cè)序技術(shù)進(jìn)步，興起從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中開發(fā)SSR 引物[15]，但有關(guān)密葉紅豆杉SSR特異引物的開發(fā)尚未見報(bào)道。

用于密葉紅豆種群遺傳學(xué)研究的SSR 標(biāo)記引物數(shù)量的不足，將不利于密葉紅豆杉遺傳資源保育工作開展。因此，為密葉紅豆杉種群遺傳學(xué)研究開發(fā)合適的SSR 標(biāo)記引物顯得尤為重要。隨著SSR 標(biāo)記發(fā)展，特別是在沒有參考基因組的情況下，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)獲取EST 序列，從其中開發(fā)SSR 標(biāo)記，這是一條經(jīng)濟(jì)、高效的研究途徑[16-17]。本章基于密葉紅豆杉高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，采用de novo組裝方法構(gòu)建其EST 序列數(shù)據(jù)庫，運(yùn) 用MISA 1.0（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）分析其EST 序列數(shù)據(jù)庫中的SSR 位點(diǎn)，利用TP-M13-SSR 技術(shù)驗(yàn)證開發(fā)的SSR 位點(diǎn)多態(tài)性[17]，旨在為后續(xù)密葉紅豆杉遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)研究提供豐富的標(biāo)記引物。

1 材料與方法

1.1 材 料

密葉紅豆杉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品來自于2017年10月從西藏自治區(qū)日喀則市吉隆縣吉隆鎮(zhèn)移栽到中南林業(yè)科技大學(xué)植物園的1年生實(shí)生苗，摘取少許新鮮葉片，用無菌水洗凈，液氮速凍，干冰保存，轉(zhuǎn)交上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。篩選SSR位點(diǎn)所需24 個(gè)密葉紅豆杉樣本選自西藏自治區(qū)日喀則市吉隆縣吉隆鎮(zhèn)密葉紅豆杉6 個(gè)自然種群，摘采少許當(dāng)年生針葉，自然晾干，分株裝入盛有干燥硅膠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-70℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 SSR 位點(diǎn)挖掘與引物設(shè)計(jì)

采用Trizol法提取RNA，SMART 法構(gòu)建cDNA 文庫，利用IlluminaHiSeq4000 測(cè)序儀測(cè)序，獲得的RNA-Seq 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。RNASeq 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。利用Trinity 2.4（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）軟件，采用de novo法拼接、組裝質(zhì)控后高質(zhì)量片段，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。并將序列信息提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫（National center for biotechnology information，NCBI），并獲得登錄號(hào)（SAMN12257767）。采用MISA 1.0 軟件在所有的Unigene 中識(shí)別和定位SSR，參數(shù)設(shè)置以單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸為最小重復(fù)單元，分別以10、6、5、5、5、5 為重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)，若2 個(gè)SSRs 間距小于100 bp，則組成一個(gè)復(fù)合SSR 位點(diǎn)。使用Primer 5.0（https://primer-premier.updatestar.com）批量設(shè)計(jì)SSR 引物，利用Oligo 6.7（http://www.oligo.net/downloads.html）驗(yàn)證引物各項(xiàng)指標(biāo)的適合度，檢查是否有引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等。采用EditPlus 7.1（https://www.editplus.com/download.html）在密葉紅豆杉總Unigene 數(shù)據(jù)庫中搜索已報(bào)道的199 對(duì)紅豆杉屬植物SSR 引物。

1.2.2 DNA 提取與PCR 擴(kuò)增

采用改良的CTAB 法提取密葉紅豆杉葉片DNA[18]。提取的DNA 樣品放入至-20℃冰箱保存待用。從批量設(shè)計(jì)的SSR 引物中，不同重復(fù)類型的SSR 位點(diǎn)取一部分，選擇了115 對(duì)引物。引物合成時(shí)在其正向引物的5’端加上1 條18 bp 的M13 引物（TGTAAAACGACGGCCAGT），M13引物采用ROX（Hexachloro fluorescein）、HEX（Hexachloro fluorescein） 和6-FAM（Carboxy fluorescein-6-succimidyl ester）3 種熒光素標(biāo)記序列。引物均由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用PAGE 純化。使用ABI Veriti 梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：模板DNA 50 ng，TPM13-SSR 正向引物（4 μM）0.3 μL，TP-M13-SSR反向引物（8 μM）0.6 μL，M13 引物（8 μM）0.6 μL，10×BUFFER 2.5 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.25 μL，dNTPs（2.5 mM each）2 μL，補(bǔ)水至25 μL體系。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性6 min；然后進(jìn)行94℃變性30 s，50～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；再94℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，16 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 毛細(xì)管電泳檢測(cè)與SSR 引物篩選

將ROX、HEX 和6-FAM 三種熒光素標(biāo)記的PCR 產(chǎn)物分別以4∶3∶3 混合，取1 μLPCR 擴(kuò)增混合產(chǎn)物加入到0.1 μLLIZ-500 分子標(biāo)量和8.9 μL去離子甲酰胺混合液中，瞬時(shí)離心混勻。95℃變性5 min，迅速冰浴，降溫至4℃以下，分裝在96 孔板上，在ABI3730XL 上進(jìn)行檢測(cè)。先從每個(gè)種群中任取1 株，組成沒有親緣關(guān)系的6 株用于SSR引物初步篩選，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否有目的條帶。再在每個(gè)種群中任取4～6 株，組成沒有親緣關(guān)系的24 株用于篩選有目的條帶的引物，PCR 產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后輸出的DNA 峰圖數(shù)據(jù)用GeneMarker V1.91 Demo 軟件（https://softgenetics.com/GeneMarker.php）分析，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物片斷長度。

1.2.4 引物的遺傳參數(shù)分析

利用GenALEx 6.5 軟件（http://biology-assets.anu.edu.au/GenAlEx/Download.html）統(tǒng)計(jì)各引物的等位基因數(shù)（Na）、期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）；基于遺傳距離矩陣對(duì)密葉紅豆杉部分樣本進(jìn)行主成分分析PCA（Principle component analysis，PCA），以評(píng)估位點(diǎn)鑒別效率。利用Genepop V 4.7 件（https://kimura.univ-montp2.fr/～rousset/）進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)，計(jì)算近交系數(shù)Fis。CERVUS 3.0 軟件（http://www.fieldgenetics.com/pages/aboutCervus_Analyses.jsp）計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量PIC（Polymorphism Information Content）。

2 結(jié)果與分析

2.1 密葉紅豆杉SSR 引物開發(fā)

基于RNA-Seq 結(jié)果，采用MISA 軟件識(shí)別和定位SSR 位點(diǎn)，共獲得39 261 條Unigene，總堿基數(shù)為36 302 583 bp，GC 含量為41.4%。在總Unigene 中，最長拼接長度為11 343 bp，最短拼接長度為201 bp，平均長度為924.65 bp。用MISA軟件對(duì)總Unigene 進(jìn)行搜索，共檢測(cè)到2 965 個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中2 343 條Unigene 含一個(gè)SSR 位點(diǎn)；288 條Unigene 含多個(gè)SSR 位點(diǎn)；111 條Unigene含復(fù)合型SSR 位點(diǎn)。這些SSR 位點(diǎn)散布在2 631條Unigene 中，發(fā)生頻率為6.7%，平均分布密度為1/12.43 kb。用Primer 5.0 軟件共設(shè)計(jì)出2 274對(duì)包含各位點(diǎn)的SSR 引物。

2.2 密葉紅豆杉SSR 位點(diǎn)分布特征

2.2.1 重復(fù)基序次數(shù)分布特征

密葉紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中各SSR 重復(fù)基序類型及數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）。密葉紅豆杉中SSR 重復(fù)類型從單堿基到六堿基重復(fù)均有分布，重復(fù)基序比較豐富，共有126 種。但不同重復(fù)基序的SSR位點(diǎn)數(shù)量相差較大，從4 到60 種不等，其中以三核苷酸重復(fù)基序類型的重復(fù)基序數(shù)量最多，為60種；其次是四核苷酸重復(fù)基序類型的重復(fù)基序，為25 種。單核苷酸、二核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)基序類型的重復(fù)基序數(shù)分別為4、8、10、19 種，其中單核苷酸重復(fù)基序類型的重復(fù)基序SSR 位點(diǎn)數(shù)目最多，為1 468 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的49.51%，平均長度為11.2 bp；其次是三核苷酸重復(fù)類型的重復(fù)基序SSR 位點(diǎn)數(shù)目次之，為928 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的31.3%，平均長度為16.9 bp；再次是二核苷酸重復(fù)類型的重復(fù)基序SSR 位點(diǎn)數(shù)目第三，為485 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的16.4%，平均長度為14.6 bp；最后是四、五、六核苷酸重復(fù)基序類型的重復(fù)基序，SSR 位點(diǎn)數(shù)目較少，分別占0.9%、0.3%和0.6%，平均長度分別為21.5、27.0 和36.3 bp。在密葉紅豆杉轉(zhuǎn)錄組所有重復(fù)基序中，A/T 為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序，共1 468 個(gè)，占重復(fù)基序總數(shù)49.5%；其次是AAG/CTT，共247 個(gè)，占8.3%。二核苷酸重復(fù)基序中，AG/CT 重復(fù)基序最多，共233 個(gè)，占重復(fù)基序總數(shù)的7.9%。

表1 密葉紅豆杉SSR 重復(fù)基序類型及數(shù)量Table 1 Type and number of repeat motifs in Taxus fuana

2.2.2 密葉紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)分布特征

密葉紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中，單核苷酸SSR 位點(diǎn)數(shù)約占總SSR 位點(diǎn)數(shù)的1/2（表1）。由于poly (A)結(jié)構(gòu)中，很難辨別poly (A)結(jié)構(gòu)與直實(shí)SSR 位點(diǎn)，而且單核苷酸SSR 標(biāo)記在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)無法分辨其單個(gè)堿基的差異，即使在帶熒光標(biāo)記的毛細(xì)管電泳也會(huì)因?yàn)門aq 酶通常會(huì)在部分PCR 產(chǎn)物末端額外帶上A 堿基，單個(gè)堿基的差異在峰圖上很難分辨，因此，單個(gè)堿基的SSR 標(biāo)記實(shí)用性不強(qiáng)。在剔除單核苷酸重復(fù)類型后，SSR 位點(diǎn)數(shù)目與重復(fù)基序長度相關(guān)，隨著重復(fù)基序長度增加，SSR 位點(diǎn)數(shù)量逐漸減少，結(jié)果如圖1。大多SSR位點(diǎn)的重復(fù)基序長度介于12～22 bp 之間，合計(jì)1 425 個(gè)，占總SSR 位點(diǎn)數(shù)97%，發(fā)生頻率為3.6%。

在密葉紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中，由二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基序的SSR 位點(diǎn)占主導(dǎo)（表2），占總數(shù)的96.1%。且三核苷酸重復(fù)基序要比二核苷酸重復(fù)基序的SSR 位點(diǎn)數(shù)目多91.3%。

2.3 密葉紅豆杉多態(tài)性SSR 引物篩選

用6 株樣本初步檢驗(yàn)160 對(duì)引物是否有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，其中有92 對(duì)引物可擴(kuò)增出清晰的目的條帶，擴(kuò)增率為57.5%。以1 085 引物為例，從瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2），可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物比250 bp的分子標(biāo)量條帶稍大，說明PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與理論計(jì)算大致相符（表3）。

圖1 密葉紅豆沙SSR 位點(diǎn)數(shù)與重復(fù)基序長度關(guān)系Fig.1 The relationship between the number of SSRs and the length of repetitive motifs in Taxus fuana

引物多態(tài)性篩選，用24 株樣本檢驗(yàn)92 對(duì)引物，其PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)。其擴(kuò)增產(chǎn)物大小是引物設(shè)計(jì)的片段長度、M13 引物長度和Taq 酶在dNTPs 過剩的條件下在擴(kuò)增產(chǎn)物的末端添加的A，總長度計(jì)為262 bp（圖3），與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物長度一致。

表2 密葉紅豆杉重復(fù)基序次數(shù)與SSR 位點(diǎn)分布Table 2 Numbers of repeat motifs and distribution of SSRs in Taxus fuana

圖2 密葉紅豆杉中用6 個(gè)樣本初步篩選的TC85 引物Fig.2 Preliminary selection of TC85 primer with six samples in Taxus fauna

在這92 對(duì)引物當(dāng)中，經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有68對(duì)引物只有1～2 條大小完全一致的條帶，只有24 對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)引物百分比為26.1%。在這24 對(duì)多態(tài)性SSR 引物中，等位基因數(shù)（Na）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、近交系數(shù)（Fis）以及多態(tài)信息含量（PIC）平均分別為4.958、0.497、0.671、0.246 和0.619（表3），其中有8 對(duì)偏離了哈迪-溫伯格平衡。

2.4 多態(tài)性位點(diǎn)的有效性檢驗(yàn)

主成分分析（PCA）結(jié)果表明（圖4），24個(gè)密葉紅豆杉樣本基本都能被清楚的區(qū)分開，表明這些多態(tài)性位點(diǎn)能較好的區(qū)分單株。

圖3 4 個(gè)密葉紅豆杉樣本用TC85 引物擴(kuò)增片段的毛細(xì)管電泳峰圖Fig.3 Capillary electrophoresis peak maps of four samples of Taxus fuana amplified with TC85 primer

表3 密葉紅豆杉SSR 引物及遺傳信息?Table 3 Information of SSR primers and genetic information in Taxus fuana

圖4 24 個(gè)密葉紅豆杉單株的主成分分析Fig.4 PCA for 24 samples of Taxus fauna

3 討 論

為探討密葉紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)特點(diǎn)與其它瀕危物種有何差異，選用近緣物種南方紅豆杉Taxus wallichianavar.mairei和雙子葉植物綱長柄雙花木Disanthus cercidifoliusvar.longipe和丹霞梧桐Firminana danxiaensis，在SSR 位點(diǎn)發(fā)生頻率、主要優(yōu)勢(shì)核苷酸類型和重復(fù)基序等方面做橫向?qū)Ρ?。密葉紅豆杉SSR 位點(diǎn)發(fā)生頻率為3.6%，高于南方紅豆杉的2.2%[19]。密葉紅豆杉三核苷酸重復(fù)類型占總SSR 位點(diǎn)數(shù)的65.1%，二核苷酸重復(fù)類型占總SSR 位點(diǎn)數(shù)的34.0%，均高于南方紅豆杉的38.6%和7.7%[19]，說明在紅豆杉中三核苷酸重復(fù)類型可能是優(yōu)勢(shì)類型。長柄雙花木以二核苷酸重復(fù)為優(yōu)勢(shì)類型，占71%[20]，丹霞梧桐以三核苷酸重復(fù)為優(yōu)勢(shì)類型，占15.5%[21]，暗示親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的不同物種其優(yōu)勢(shì)類型各不相同。在密葉紅豆杉三核苷酸重復(fù)基序中，以AAG/CTT 最多，共247 個(gè)，占三核苷酸重復(fù)類型的26.4%；在二核苷酸重復(fù)基序中，以AG/CT 重復(fù)基序最多，共233 個(gè)，占二核苷酸重復(fù)類型的48.0%，這與其它物種相一致，都以這兩種重復(fù)基序占優(yōu)勢(shì)[19-27]。暗示AAG/CTT 和AG/CT 在不同物種中可能都屬于高頻基序?；蚪M中占主導(dǎo)地位的重復(fù)基序可能與其被翻譯成多種氨基酸，以及該物種中由該氨基酸合成的蛋白質(zhì)多肽鏈含量較高有關(guān)。二核苷酸重復(fù)基序可能由閱讀框改變，產(chǎn)生滑脫鏈誤配的差錯(cuò)造成。GA/CT 基序可代表mRNA 中CUC、UCU、AGA及GAG 密碼子，分別翻譯為亮氨酸、絲氨酸、谷氨酸和精氨酸，導(dǎo)致GA/CT 重復(fù)基序在轉(zhuǎn)錄組及EST 文庫中比例較高[28]。AAG/CTT 基序可代表mRNA 中AAG、CUU 密碼子，翻譯為谷酰胺酸和亮氨酸，暗示密葉紅豆杉細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)中含谷酰胺酸和亮氨酸多肽鏈蛋白質(zhì)比例較高。

密葉紅豆杉三核苷酸重復(fù)類型占SSR 位點(diǎn)數(shù)的65.1%，遠(yuǎn)高于南方紅豆杉、長柄雙花木和丹霞梧桐三核苷酸重復(fù)類型平均占總SSR 位點(diǎn)數(shù)的36.4%[19-21]，這暗示著，密葉紅豆杉有較多三核苷酸重復(fù)類型是基因編碼序列，屬于密碼子的同義突變，并不具多態(tài)性。在該24 個(gè)位點(diǎn)中，密葉紅豆杉的期望雜合度均值為0.671，其作為數(shù)量并不占優(yōu)勢(shì)的極小種群，可能是為保持較高遺傳多樣性而承擔(dān)了較高的遺傳負(fù)荷。因此，與其它物種相比，雖然密葉紅豆杉三核苷酸重復(fù)類型占SSR位點(diǎn)數(shù)較多，但具有多態(tài)性SSR 位點(diǎn)并未相應(yīng)增加，這與篩選出來的24 個(gè)具有多態(tài)性的SSR 位點(diǎn)中有8 個(gè)屬于二核苷酸重復(fù)類型，而三核苷酸重復(fù)類型只有5 個(gè)的結(jié)果相呼應(yīng)。這進(jìn)一步說明，大多數(shù)三核苷酸重復(fù)類型的SSR 位點(diǎn)并不具有多態(tài)性。選取160 對(duì)引物中有68 對(duì)引物沒有擴(kuò)增出目的條帶，與南方紅豆杉53.2%的擴(kuò)增率相當(dāng)[19]，這與擴(kuò)增片段中內(nèi)含子變異或引物位點(diǎn)突變等有關(guān)。但南方紅豆杉多態(tài)性位點(diǎn)百分比為38.7%[19]，而密葉紅豆杉卻只有26.1%，這可能與其三核苷酸重復(fù)類型多態(tài)性較低所致。

目前，已運(yùn)用不同方法開發(fā)了紅豆杉屬植物特異性SSR 引物。如Huang 等[28]采用PIMA法（PCR-based isolation of microsatellite arrays,PIMA） 開發(fā)了12 對(duì)蘇門答臘紅豆杉Taxus sumatranaSSR 引物；Miao 等[29]用PCR 錨定法開發(fā)了8 對(duì)云南紅豆杉Taxus yunnanensisSSR 引物；Dubreuil 等[30]通過構(gòu)建微衛(wèi)星文庫開發(fā)8 對(duì)歐洲紅豆杉Taxus baccataSSR 引物；用FIASCO 法（Fast isolation by amplified fragment length polymorphism of sequences containing repeats）在南方紅豆杉和西藏紅豆杉Taxus wallichiana中分別篩選出4 對(duì)和10 對(duì)SSR 引物[31-32]；Wei 等[33]用構(gòu)建小基因組文庫的方法和生物素探針在南方紅豆杉中篩選出12對(duì)SSR 引物；Jyoti 等[34]用鳥槍測(cè)序法在西藏紅豆杉開發(fā)出10 對(duì)SSR 引物；用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)南方紅豆杉的SSR引物104對(duì)[35-37]。由上述比較可知，用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR 引物效率最高。

用已報(bào)道的199 對(duì)紅豆杉屬植物SSR 引物序列，逐條在密葉紅豆杉39 261 條Unigene 序列中搜索，僅找到TWS62 引物[19]和TB01 引物[30]。TB01 引物在密葉紅豆杉中處于18S 基因中，其SSR 位點(diǎn)基序僅重復(fù)3 次；TWS62 引物的SSR 位點(diǎn)基序僅重復(fù)1 次，不符合MISA 軟件設(shè)置的篩選條件，故在本研究中沒有選中。所以在密葉紅豆杉新開發(fā)的24 對(duì)SSR 引物與已經(jīng)報(bào)道的紅豆杉SSR 引物尚無重復(fù)。反映SSR 位點(diǎn)多態(tài)性水平的PIC 值在該24 對(duì)引物中均值為0.619，表明所開發(fā)的SSR 位點(diǎn)呈高度多態(tài)性。

近年來，隨著測(cè)序成本迅速降低，基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR 標(biāo)記的物種日益增多[19-26,37-38]，但由于EST-SSR 標(biāo)記屬編碼區(qū)標(biāo)記，具有非中性特點(diǎn)，部分位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg 平衡，這對(duì)部分基于模型檢測(cè)的種群遺傳分析軟件，計(jì)算所得結(jié)果準(zhǔn)確性降低。

4 結(jié) 論

在密葉紅豆杉中，占優(yōu)勢(shì)的SSR 位點(diǎn)重復(fù)類型和重復(fù)基序與其它瀕危物種基本相同，但其具有多態(tài)性的三核苷酸重復(fù)類型與其所占比例具有物種特異性。在密葉紅豆杉中首次基于轉(zhuǎn)錄組序列信息開發(fā)出的24 個(gè)SSR 位點(diǎn)，雖然部分SSR位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg 平衡，但是其高度多態(tài)，個(gè)體區(qū)分度高，可為后續(xù)的密葉紅豆杉種群遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了豐富的標(biāo)記引物，由于SSR 標(biāo)記的種間可通用性，也可以為其它紅豆杉屬植物作為候選標(biāo)記。