崔少遠，傅 博，王 旭，陳香美

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 腎臟病科，腎臟疾病國家重點實驗室，北京 100853

蛋白尿是原發(fā)性腎小球疾病基本的臨床表現(xiàn)，也是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)進展的獨立危險因素，其通過改變腎小球血流動力學、損傷腎小球毛細血管壁及系膜細胞等造成腎小球硬化，大量蛋白尿的持續(xù)存使腎損傷進行性加重，最終導致終末期腎病[1]。降低蛋白尿是治療腎病的關鍵，對早期防治CKD具有重要意義。

目前認為蛋白尿發(fā)生的主要原因是腎小球濾過屏障結構和功能改變，腎小球濾過屏障主要由足細胞及足細胞足突裂隙膜(slit diaphragm，SD)組成，足突附著在腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)的腎小球毛細血管上，形成細胞間連接，從而產(chǎn)生隔膜濾過屏障，幫助維持正常腎功能[2]；足細胞損傷后足突消失、細胞凋亡，導致腎小球濾過屏障破壞，是局灶節(jié)段性腎小球硬化、微小病變腎病以及糖尿病腎病等疾病患者發(fā)生蛋白尿的關鍵因素[3]。足細胞結構蛋白Nephrin、NEPH1、P-cadherin、FAT、ephrin-B1、TRPC6等關鍵分子組成SD復合物，細胞骨架協(xié)同蛋白Synaptopodin、ZO-1、Podocin、CD2AP、MAGI等連接裂隙膜與細胞骨架，這些蛋白調(diào)節(jié)足細胞骨架維持足突的復雜結構，使其行使正常的濾過功能[4-5]。而在一些有害因素的刺激下，足細胞內(nèi)鈣離子濃度可持續(xù)性升高，即鈣超載，鈣超載會對足細胞產(chǎn)生不可逆損傷，使足細胞凋亡、分離，足突結構改變及數(shù)量減少，破壞腎小球結構動態(tài)平衡，改變腎小球濾過系數(shù)，導致蛋白尿的發(fā)生[6]。

Ca2+是機體各項生理活動不可缺少的離子，作為第二信使參與多條信號通路轉(zhuǎn)導發(fā)揮重要作用，維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)主要指維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫、質(zhì)膜鈣泵及鈣離子通道的鈣穩(wěn)態(tài)[7]。NCX1作為調(diào)控Ca2+的重要通道，是廣泛分布于膜結構(如細胞質(zhì)膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等)的陽離子轉(zhuǎn)運蛋白，功能上具有兩種轉(zhuǎn)運模式：介導Na+內(nèi)流、Ca2+外排的前向模式(forward mode)和作用相反的反向模式(reverse mode)[8]。在有害因素刺激下，NCX1反向模式的異常激活導致胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，形成鈣超載，啟動下游鈣離子信號通路，導致病理反應[9-10]。

本研究建立被動型海曼腎炎(passive Heymann nephritis，PHN)大鼠模型，探討鈉鈣交換蛋白1(sodium-calcium exchanger 1，NCX1)與蛋白尿的關系；體外培養(yǎng)足細胞，建立補體激活足細胞損傷模型，檢測胞內(nèi)Ca2+變化及下游信號通路的激活情況，觀察足細胞骨架蛋白及相關蛋白的表達，NCX1反向作用抑制劑KB-R7943能否有效減輕足細胞損傷，闡明NCX1在足細胞損傷中的重要 作用和可能機制。

材料和方法

1 實驗材料 SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心SPF級屏障實驗動物中心飼養(yǎng)；小鼠足細胞條件永生系MPC-5為美國Bronx大學的Dr. Peter Mundel惠贈；Ca2+探針Fluo-3、F-actin探針購自Thermo Scientific公司，NCX1、Nephrin、Synaptopodin抗體購自CST公司，RhoA、ROCK1、ROCK2抗體購自Abcam公司，體外毒理學檢測試劑盒、C6補體血清及不含C6的補體血清、KB-R7943購自S igma-Aldrich公司。

2 建立PHN大鼠模型 近曲腎小管刷狀緣抗原Fx1A提取：200 ～ 250 g雄性SPF級SD大鼠25只，3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取腹正中切口，心臟取血后左心室注入0.9%氯化鈉注射液灌洗腎致腎變白，取下腎，低溫下分離腎皮質(zhì)。取無血的腎皮質(zhì)加入甘露醇-Tris-HCl緩沖液(10 mL/g腎皮質(zhì))，玻璃勻漿器制勻，腎皮質(zhì)勻漿，加入1 mol/L MgCl2至濃度為10 mmol/L，攪拌15 min，2 200 g離心20 min，取上清，100 000 g 4℃離心45 min，收集沉淀，冷凍干燥，?20℃保存，近曲腎小管刷狀緣抗原Fx1A提取已完成。兔抗大鼠Fx1A抗血清制備：雄性新西蘭大白兔4只，體質(zhì)量約2.5 kg，通過足趾一腘窩淋巴結一背部皮內(nèi)皮下多點注射混合免疫法免疫兔子，末次注射免疫原后10 d試血。從耳靜脈采血檢測效價達1︰32 000以上時，頸動脈插管放血，分離Fx1A抗血清。使用前56℃滅活補體30 min，大鼠血球吸附，抗血清小量分裝，?20℃保存；雄性Wistar大鼠30只，隨機分為兩組，一組經(jīng)腹腔一次性注射蒸餾水，劑量為0.8 mL/100g，另外一組經(jīng)腹腔一次性注射等量兔抗Fx1A抗血清。于第1周末開始測定大鼠24 h尿蛋白定量，金屬代謝籠收集24 h尿液，全自動生化分析儀測定尿蛋白，當24 h尿蛋白定量＞1 0 mg時認為模型建立成功。

3 建立體外補體激活足細胞損傷模型 對照組(Con組)：小鼠足細胞MPC-5用含Rabbit anti-Fx1A抗體5 mg/mL的無血清培養(yǎng)液37℃孵育30 min，孵育后用不含C6補體的血清37℃孵育60 min。補體激活足細胞損傷模型組(C5b-9組)：小鼠足細胞MPC-5用含Rabbit anti-Fx1A 抗體5 mg/mL的無血清培養(yǎng)液37℃孵育30 min，然后用含C6補體的亞溶解劑量的補體血清(稀釋度為8%)的細胞培養(yǎng)液37℃孵育60 min。Checkerboard titration studies 法確定細胞亞溶解劑量，體外毒理學檢測試劑盒(Sigma-Aldrich)測定細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶的含量確定造模成功。NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(KB-R7943組)：5μmol/L KB-R7943預處理足細胞24 h，含Rabbit anti-Fx1A抗體5 mg/mL的無血清培養(yǎng)液37℃孵育30 min，然后用含亞溶解劑量的補體血清(稀釋度為8%)的細 胞培養(yǎng)液37℃孵育60 min。

4 胞 內(nèi)Ca2+檢 測 Ca2+探 針Fluo-3 5 μmol/L 37℃避光孵育細胞30 min，PBS洗滌3次，激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)上機觀察，掃描圖 像，數(shù)據(jù)分析。

5 免疫熒光檢測 標本置于預冷的4% 多聚甲醛，4℃ 固定20 min，PBS洗滌3次；0.1%的TritonX-100 4℃透化20 min，PBS洗滌3次；5%BSA室溫封閉20 min，加入一抗4℃孵育過夜；洗滌，加入二抗，室溫1 h。激光共聚焦顯微鏡( Olympus FV1000)上機觀察，掃描圖像。

6 Western blot檢測 裂解標本，提取蛋白，變性，電泳分離目標蛋白，轉(zhuǎn)膜，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌；二抗室溫孵育1 h?；瘜W發(fā)光儀(美國UVP)檢測，拍攝圖像，灰度分析軟件Q uantity One計算灰度值，統(tǒng)計分析。

7 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 7軟件進行圖表制作及統(tǒng)計分析。觀測數(shù)據(jù)均為計量資料，以 xˉ ±s表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意 義。

結 果

1 PHN大鼠模型中NCX1表達水平的變化 免疫熒光染色結果顯示，與對照組比較，PHN模型組大鼠NCX1的表達水平隨造模時間逐漸減少，并 在21 d時達到最低(圖1)。

2 補體激活足細胞損傷模型中NCX1及Ca2+水平的改變 NCX1熒光染色結果顯示，在補體激活足細胞損傷模型組中其表達降低，應用反向模式抑制劑KB-R7943處理后，其表達明顯增高(圖2A)。Ca2+熒光染色結果顯示，與對照組相比，補體激活足細胞損傷模型組的胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P＜0.05)；應用NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理后，胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低(P＜0.05)(圖2 B和圖2C)。

3 足細胞損傷模型中Ca2+下游RhoA/ROCK信號通路分子活性的改變 我們進一步用Western blot分析了補體激活足細胞損傷模型中Ca2+下游RhoA/ROCK信號通路分子活性與表達的改變。結果顯示，與對照組比較，補體激活足細胞損傷模型中活化型RhoA (active RhoA)、ROCK1和ROCK2蛋白的表達水平明顯增高(P＜0.05)；應用NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理后，可以有效降低這些信號通路蛋白的活性及表達水平(P＜0.05)，提示抑制NCX1反向模式可以有效降低RhoA/ROCK信 號通路的激活(圖3)。

圖 1 免疫熒光染色檢測PHN大鼠模型中NCX1的表達(Con組：對照組；PHN模型組7 d、14 d、21 d、28 d；藍色：細胞核)Fig.1 Expression of NCX1 in PHN rat model detected by immunofluorescence staining (Con: control group; PHN model groups for 7 days, 14 days, 21 days, 28 days; Blue: nuclei)

4 NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理有效減輕足細胞損傷 應用激光共聚焦顯微鏡觀察足細胞中細胞骨架蛋白F-actin的表達與結構改變。結果發(fā)現(xiàn)對照組細胞骨架沿細胞長軸呈線性分布，骨架結構整齊清晰，足突明顯，熒光強度明亮；補體激活足細胞損傷模型組骨架蛋白表達較對照組降低，足細胞皺縮，骨架結構斷裂，排列紊亂；而KB-R7943處理組骨架蛋白表達水平恢復，細胞骨架結構明顯改善，足細胞損傷明顯減輕(P＜0.05)。足細胞標志物Nephrin蛋白主要在細胞質(zhì)中表達，呈顆粒或線裝分布。F-actin、Nephrin蛋白、足細胞骨架協(xié)同蛋白Synaptopodin在三組間的變換趨勢比較一致，補體激活足細胞損傷模型組顯著低于對照組(P＜0.05)；而KB-R7943處理組顯著高于補體激活足細胞損傷模型組(P＜0.05)，而與對照組比較則無統(tǒng)計學差異(圖4)，說明足細胞損傷后三種蛋白表達均降低，而KBR7943可以逆轉(zhuǎn)這種損傷，使蛋白水平恢復到正常水 平。

圖 2 補體激活足細胞損傷模型中NCX1及Ca2+水平的變化(藍色：細胞核)A：足細胞免疫熒光染色NCX1；B和C：足細胞Ca2+熒光染色圖像及熒光數(shù)據(jù)分析；Con：對照組；C5b-9：補體激活足細胞損傷模型組；KB-R7943：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=10，C5b-9 vs Con，KB-R7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.2 Immunofluorescence staining of NCX1 and intracellular Ca2+ in podocytes (Blue: nuclei)A: Immunofluorescence staining of NCX1; B and C: Fluorescence imaging and quantitative analysis of Ca2+; Con: Control group; C5b-9: Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=10, C5b-9 vs Con, KB-R7943 vs C5b-9,aP＜0.05)

圖 3 Western blot檢測RhoA/ROCK信號通路蛋白活性Con：對照組；C5b-9：補體激活足細胞損傷模型組；KB-R7943：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=5，C5b-9 vs Con，KBR7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.3 RhoA/ROCK signaling pathway proteins activities detected by Western blot Con: Control group; C5b-9: Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=5, C5b-9 vs Con,KB-R7943 vs C5b-9, aP＜0.05)

討 論

哺乳動物的NCX是由同源蛋白的多基因家族形成，包括3個家族、9個亞型，分別為非K+依賴性的NCX1、NCX2、NCX3；K+依 賴性的NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5；陽離子依賴性的NCKX6和NCLX[11]。NCX1廣泛分布于哺乳動物器官和組織，NCX2和NCX3主要表達于神經(jīng)和骨骼肌中，而腎表達以NCX1為主[12]。近年來，各領域?qū)CX1的研究不斷深入，NCX1不僅能夠調(diào)控Ca2+濃度，還參與調(diào)節(jié)細胞興奮性及興奮耦聯(lián)功能[13-15]，參與細胞生長、分化、凋亡、浸潤、遷移等過程[16-18]。在心臟搏動、大腦長程學習效應、血壓控制、腎重吸收、免疫應答、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、胰島素分泌等方面發(fā)揮重要作用。?

圖 4 足細胞F-actin、Nephrin和Synaptopodin的表達與結構改變(藍色：細胞核 )A：免疫熒光染色檢測F-actin、Nephrin和Synaptopodin；B：熒光數(shù)據(jù)分析；Con：對照組；C5b-9：補體激活足細胞損傷模型組；KBR7943組：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=12，C5b-9 vs Con，KB-R7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.4 Immunofluorescence staining of F-actin, Nephrin and Synaptopodin in podocytes (Blue: nuclei)A: Immunofluorescence imaging of F-actin, Nephrin and Synaptopodin; B: Quantitative analysis of immunofluorescence images; Con:Control group; C5b-9:Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=12, C5b-9 vs Con, KBR7943 vs C5b-9, aP＜0.05)

有報道NCX1參與腎Ca2+重吸收，與腎缺血再灌注相關，并誘導腎上皮細胞轉(zhuǎn)分化[19-20]。關于NCX1在腎小球足細胞中作用的研究較少，已報道腎小球足細胞中有NCX1表達；在嘌呤霉素誘導的足細胞損傷研究中發(fā)現(xiàn)NCX1表達減少，其前向模式受到抑制而激活反向模式，增加了Ca2+內(nèi)流導致胞內(nèi)Ca2+超載，損傷足細胞[21]。NCX1作為調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的重要通道，在調(diào)節(jié)細胞骨架方面發(fā)揮重要作用，其調(diào)節(jié)細胞骨架的作用依賴自身Ca2+結合中心的變構激活，與胞內(nèi)Ca2+濃度密切相關[22]。我們的工作證實了NCX1通過調(diào)控鈣離子內(nèi)流激活了RhoA/ROCK信號通路，從而改變足細胞骨架結構，導致足細胞損傷，應用KB-R7943能有效減輕足細胞損傷。KBR7943屬于Benzyloxyphenyl衍生物，NCX反向轉(zhuǎn)運的選擇性抑制劑，其廣泛應用于心血管相關疾病的研究[23]。KB-R7943可濃度依賴性地舒張高鉀預收縮的大鼠離體腎動脈環(huán)，為治療腎性高血壓，緩解腎病理損傷提供實驗依據(jù)[24]；KBR7943對缺血再灌注所致的腎功能障礙和組織損傷有保護作用[25-26]；本研究證實了其在足細胞中的保護作用，這些研究證實了KB-R7943在腎病治療中的可能性。

NCX1作為膜蛋白，其在細胞表面不規(guī)則分布，胞內(nèi)呈弱放射線分布，與F-actin張力纖維接觸，而且在細胞與細胞連接的區(qū)域呈現(xiàn)高表達，同時F-actin亦高表達，這與相鄰足細胞連接形成腎小球濾過屏障，調(diào)控腎小球濾過的作用極其相似；而足細胞中另外一個重要的Ca2+通道蛋白TRPC6是腎小球裂隙膜蛋白SD復合物分子，其與NCX1的復合物能調(diào)控細胞遷移，這對維持腎小球濾過作用很重要，NCX1是否也是SD復合物分子？其與已知的組成裂隙膜的重要結構蛋白質(zhì)CD2AP、Podocin等存在何種相互作用？這是我們進一步研究的方向，以全面揭示NCX1在足細胞上的作用機制，探索蛋白尿產(chǎn)生的新途徑，為臨床防治蛋白尿提供新的思路。