李一鳴，陳 華，袁曉燕，郭東風(fēng)

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院，上海 200135 1婦科；2 全科醫(yī)學(xué)科

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤，是全世界女性，尤其是發(fā)展中國(guó)家女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。隨著宮頸癌早期篩查、診斷技術(shù)和治療手段的不斷發(fā)展，近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所降低，但宮頸癌患者的長(zhǎng)期預(yù)后仍不容樂(lè)觀[2]。微RNA(microRNA，miRNA)是一種小的非蛋白質(zhì)RNA，由19 ～ 25個(gè)核苷酸組成，在許多與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。miR-324-3P與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，其可通過(guò)多種途徑參與非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌和胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可起到促癌因子的作用，也可起到抑癌因子的作用[5-7]。miR-324-3P在宮頸癌中的表達(dá)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。miRNA存在很多靶基因，其主要通過(guò)調(diào)控不同的靶基因發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，如miR-324-3p通過(guò)靶向調(diào)控WNT2b在鼻咽癌中發(fā)揮抑癌作用[6]。WNT3a為經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中的重要蛋白，與胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞的分化成熟有重要作用[8]。本研究采用TargetScan7.1軟件預(yù)測(cè)miR-324-3P可能的靶基因，分析miR-324-3P及其靶基因在宮頸癌患者組織中的表達(dá)情況及其對(duì)癌 細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

材料與方法

1 主要試劑和材料 Trizol試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR試劑盒，日本TaKaRa公司；miR-324-3P、WNT3a、內(nèi)參GAPDH引物，上海生工生物工程有限公司合成；FBS、高糖培養(yǎng)基和胰酶，美國(guó)Giboc公司；宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；過(guò)表達(dá)WNT3a質(zhì)粒、pGLO-WNT3a-野生型質(zhì)粒(WNT3a-wt)和pGLOWNT3a-突變型質(zhì)粒(WNT3a-mut)，上海吉?jiǎng)P公司；雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物試劑有限公司；miR-324-3P mimic，廣州瑞博生物技術(shù)有限公司；MTt試劑，北京索萊寶試劑有限公司；Boyden小室，美國(guó)BD公司；Transwell小室，美國(guó)Coring公司；RIPA和BCA，美國(guó)Thermo公司；WNT3a和β-catenin抗體 ，美國(guó)Proteintech公司。

2 宮頸組織來(lái)源 選擇2018年1月- 2019年1月入住我院的原發(fā)性宮頸癌患者術(shù)后樣本40例，納入標(biāo)準(zhǔn)：1)術(shù)后經(jīng)病理診斷，確診為宮頸癌；2)患者未接受過(guò)任何形式的抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并其他類型的惡性腫瘤；2)合并有嚴(yán)重器質(zhì)性病變；3)不同意參與本次研究。另選取同期我院收治的因子宮疾病切除正常宮頸組織樣本40例。所有患者均對(duì)本次研究?jī)?nèi)容知情同意 。所有操作均符合我院倫理委員會(huì)要求批件。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)量 加入Trizol試劑，依次加入氯仿、異丙醇和乙醇提取RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit配制反應(yīng)體系，85℃ 5 s，37℃ 15 min將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR配制反應(yīng)體系，95℃ 5 s，40個(gè)95℃ 5 s、65℃ 34 s循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)得各孔循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，按照2?ΔΔCt公式以GAPDH為內(nèi)參分別計(jì)算miR-324-3P和WNT3a mRNA相對(duì)表達(dá)量。miR-324-3P引物序列F：5′-ACTGC CCCAGGTGCTGCTGG-3′，R：5′- GCGAGCACAG AATTAATACGAC-3′。WNT3a引物序列F：5′-AGCTACCCGATCTGGTGGTC-3′，R：5′-CAAACTCG ATGTCCTCGCTAC-3′。GAPDH引物序列F：5′- GT GAACCATGAGAAGTATG-3′，R：5′-CGGCCATC A CGCCACAGTTTC-3′。

4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)復(fù)蘇后重懸至含有10% FBS的高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度為95%左右時(shí)，以一傳三進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)采用胰酶消化，1×105/孔接種至6孔板中，分為對(duì)照組(NC組)、miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組。細(xì)胞接種12 h后采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞，miR-324-3P模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染miR-324-3P mimic組細(xì)胞，miR-324-3P mimic和WNT3a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-324-3P mimic+o e-WNT3a組細(xì)胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5 驗(yàn)證miR-324-3P靶向調(diào)控WNT3a TargetScan 7.1軟件(http://www.targetscan.org)預(yù)測(cè)miR-324-3P可能的靶基因。HeLa細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)采用胰酶消化，2 000/孔接種到96孔板中，分為：NC+WNT3a-wt組；miR-324-3P+WNT3a-wt組；NC+WNT3a-mut組；miR-324-3P+WNT3a-mut組，無(wú)關(guān)序列與WNT3a-wt同時(shí)轉(zhuǎn)染NC+WNT3a-wt組細(xì)胞，miR-324-3P mimic與WNT3a-wt同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-324-3P+WNT3a-wt組細(xì)胞，無(wú)關(guān)序列與WNT3a-mut同時(shí)轉(zhuǎn)染NC+WNT3a-mut組細(xì)胞，miR-324-3P mimic與WNT3a-mut同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-324-3P+WNT3a-mut組細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h時(shí)的各組細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢 測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

6 四 唑 鹽 比 色 法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 HeLa細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)采用胰酶消化，1 500/孔接種到96孔板中，分為NC組、miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組，按照前文中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，加入20 μL MTT試劑，培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO試劑溶解晶體。在490 nm處測(cè)得各樣品的OD值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組O D值×100%。

7 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集，PBS洗3次后，100 μL無(wú)血清高糖培養(yǎng)基重懸1×105個(gè)細(xì)胞，加至Boyden小室上室底部的微孔膜上，然后放入含有500 μL高糖完全培養(yǎng)基的24孔板中，使微孔膜下室面與24孔板中的培養(yǎng)基接觸。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出Boyden小室，微孔膜上室面細(xì)胞采用PBS洗去后，下室面細(xì)胞經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色后，計(jì)算 穿膜的細(xì)胞數(shù)。

8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集，PBS洗3后，100 μL無(wú)血清高糖培養(yǎng)基重懸1×105個(gè)細(xì)胞，加至Transwell小室上室底部的微孔膜上，然后放入含有500 μL高糖完全培養(yǎng)基的24孔板中，使微孔膜下室面與24孔板中的培養(yǎng)基接觸。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出Transwell小室，微孔膜上室面細(xì)胞采用PBS洗去后，下室面細(xì)胞經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫 染色后，計(jì)算穿膜的細(xì)胞數(shù)。

9 Western-blot法檢測(cè)WNT3a、β-catenin等蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集，PBS洗3次，加入RIPA混勻細(xì)胞后震蕩裂解30 min，4℃高速離心20 min，將上清蛋白裂解液移至新EP管中，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒獲得各樣品蛋白濃度。蛋白裂解液中加入上樣緩沖液，蛋白進(jìn)行煮沸變性。上樣行凝膠電泳分離蛋白，濕性轉(zhuǎn)PVDF膜，8%脫脂牛奶孵育PVDF膜，一抗稀釋液WNT3a和β-catenin 4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光蛋 白條帶。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，以±s 表示，兩組間的比較為成組t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)量為t)，多組間的比較為單因素方差分析(統(tǒng)計(jì)量為F)+兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)量LSD-t)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

結(jié) 果

1 miR-324-3P對(duì)WNT3a的靶向調(diào)控作用 Target Scan 7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示，WNT3a啟動(dòng)子區(qū)與miR-324-3P具有結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示：與NC+WNT3a-wt共轉(zhuǎn)染組相比，miR-324-3P+WNT3a-wt共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶 活 性 降 低(1.00±0.05 vs 0.53±0.08，t=12.203，P=0.000)；而NC+WNT3a-mut組與miR-324-3P+WNT3a-mut組間的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.00±0.03 vs 0.93±0.15，t=1.121，P=0.289)。與NC組相比，miR-324-3P mimic組中WNT3a mRNA的 表 達(dá) 降 低(1.00±0.01 vs 0.43±0.08，t=17.318，P =0.000)。miR-324-3P靶向負(fù)調(diào)控WNT3a(圖2)。

2 宮頸癌組織中miR-324-3P和WNT3a的表達(dá)水平 miR-324-3P在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.79±0.39，在宮頸正常組織中為1.00±0.34，與宮頸正常組織相比，宮頸癌組織中miR-324-3P的表達(dá)水平下降(t=2.567，P=0.012)，見(jiàn)圖3A。WNT3a mRNA在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.46±0.53，在宮頸正常組織中為1.00±0.30，與宮頸正常組織相比，宮頸癌組織中WNT3a mRNA的表達(dá)水平升高 (t=4.777，P=0.000)，見(jiàn)圖3B。

圖 1 WNT3a啟動(dòng)子區(qū)與miR-324-3P的結(jié)合位點(diǎn)F ig.1 Binding site of WNT3a promoter region with miR-324-3p

圖 2 miR-324-3P對(duì)WNT3a的靶向調(diào)控作用 (aP＜0.05)F ig.2 Targeted regulation of miR-324-3p on WNT3a (aP＜0.05)

3 miR-324-3P與WNT3a在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Pearson分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織中miR-324-3P與WNT3a mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=? 0.503，P=0.000)。

4 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對(duì)TE1細(xì)胞增殖能力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組細(xì)胞增殖率為100.14%±6.35%，miR-324-3P mimic組細(xì)胞增殖率為28.54%±4.58%，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞增殖率為59.97%±7.48%。與NC組相比，miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞增殖能力降低(t=22.401、10.028，P=0.000、0.000)。而 與miR-324-3P mimic組 相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(t=8.778，P=0.000)，提示W(wǎng)NT3a削弱了miR-324-3P對(duì)細(xì)胞增殖能力的抑制作用。見(jiàn)圖 4。

圖 3 miR-324-3P(A)、WNT3a(B)在宮頸癌和宮頸正常組織中的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of miR-324-3p (A) and WNT3a (B) in cervical cancer and normal cervical tissues

圖 4 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對(duì)TE1細(xì)胞增殖能力的影響(aP＜0.05)Fig.4 Effect of miR-324-3p on proliferation of TE1 cells regulated by WNT3a (aP＜0.05)

5 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對(duì)TE1細(xì)胞侵襲能力的影響 Boyden檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為71.33±5.98，miR-324-3P mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)為25.67±6.55，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組穿膜細(xì)胞數(shù)為49.33±2.85。與NC組相比，miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞侵襲能力降低(t=12.610、8.135，P=0.000、0.000)。與miR-324-3P mimic組相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(t=8.113，P=0.000)，提示W(wǎng)NT3a削弱了miR-324-3P對(duì)細(xì)胞侵 襲能力的抑制作用。見(jiàn)圖5。

6 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對(duì)TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為89.67±4.22，miR-324-3P mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)為40.33±3.84，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組穿膜細(xì)胞數(shù)為63.33±2.88。與NC組相比，miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低(t=21.182、12.628，P=0.000、0.000)。與miR-324-3P mimic組相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增加(t=11.737，P=0.000)，提示W(wǎng)NT3a削弱了miR-324-3P對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn) 移能力的抑制作用。見(jiàn)圖6。

7 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對(duì)wnt/β-catenin的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-324-3P mimic組 和 miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞中WNT3a和β-catenin蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。與miR-324-3P mimic組相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細(xì)胞中WNT3a和βcatenin蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)，提示W(wǎng)NT3a削弱 了miR-324-3P對(duì)β-catenin的抑制作用。見(jiàn)圖7。

圖 5 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對(duì)MKN1細(xì)胞侵襲能力的影響(200×)Fig.5 Effect of miR-324-3p on invasion of MKN1 cells under WNT3a regulation (200×)

圖 6 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對(duì)MKN1細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響(200×)F i g.6 Effect of miR-324-3p on the metastatic ability of MKN1 cells under WNT3a regulation (200×)

圖 7 miR-324-3P負(fù)靶向調(diào)控WNT3a對(duì)wnt/β-catenin的影響 (aP＜0.05)F ig.7 Effect of miR-324-3p negative targeting WNT3a on wnt/β-Catenin (aP＜0.05)

討 論

2018年全球約有57萬(wàn)名女性被診斷出患有宮頸癌，有31萬(wàn)例左右患者死于宮頸癌[9]。當(dāng)前的新輔助放療和化療組合對(duì)于早期宮頸癌患者具有較好的療效，然而對(duì)于晚期宮頸癌患者的治療效果仍然不能令人滿意，轉(zhuǎn)移性晚期宮頸癌患者的5年生存率僅為16.5%[10]。目前宮頸癌具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此需深入研究宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制，為尋找宮頸癌新的治療策略提供參考。

研究發(fā)現(xiàn)miR-324-3p在非小細(xì)胞肺癌組織樣本中表達(dá)降低，并可與長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOXL1-AS1影響非小細(xì)胞肺癌增殖和侵襲能力[5]。miR-324-3p在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)，其可通過(guò)影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的E-鈣黏蛋白和波形蛋白等生物標(biāo)志物的表達(dá)水平抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[11]。Sun等[7]報(bào)道胃癌組織中miR-324-3p表達(dá)增加，并促進(jìn)了胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，抑制細(xì)胞的凋亡。miR-324-3p可發(fā)揮促癌和抑癌的雙重作用。研究結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中miR-324-3p的表達(dá)下降。在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-324-3p mimic后，MTT、Transwell和Boyden功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-324-3p的HeLa細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低，表明低表達(dá)的miR-324-3p在宮頸癌組織中有抑癌作用。

報(bào)道顯示，在胃癌細(xì)胞中miR-324-3p通過(guò)抑制Smad4的表達(dá)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而參與腫瘤的惡性進(jìn)展[7]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要信號(hào)途徑，其激活后可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[12-13]。miR-324-3p可靶向調(diào)控WNT2b[6]，WNT2b為Wnt蛋白家族之一，Wnt家族蛋白在啟動(dòng)Wnt/βcatenin信號(hào)通路活化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。以上文獻(xiàn)提示miR-324-3p可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)，本研究采用TargetScan 7.1軟件在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)WNT3a可能是miR-324-3p的靶基因。WNT3a屬于Wnt蛋白家族之一，在宮頸癌中表達(dá)增加，發(fā)揮促癌作用[15]。本研究結(jié)果顯示，WNT3a在宮頸癌組織中表達(dá)增加，與已有的研究結(jié)果一致。同時(shí)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，miR-324-3p與WNT3a在宮頸癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，且在過(guò)表達(dá)miR-324-3p的宮頸癌細(xì)胞中WNT3a mRNA的表達(dá)降低，結(jié)合雙熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)結(jié)果表明miR-324-3p可負(fù)靶向調(diào)控WNT3a。在過(guò)表達(dá)miR-324-3p的宮頸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)WNT3a的功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WNT3a可以削弱miR-324-3p抑制的宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，表明miR-324-3p通過(guò)靶向WNT3a抑制宮頸癌的惡性進(jìn)展。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要的功能蛋白，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子相互作用促進(jìn)信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)[16-17]。本文Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WNT3a可部分恢復(fù)過(guò)表達(dá)miR-324-3p宮頸癌細(xì)胞中的β-catenin蛋白，表明miR-324-3p可靶向WNT3a調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，miR-324-3p在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并靶向WNT3a抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，可能是通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用。提高miR-324-3p的表達(dá)可能是宮頸癌治療的新策略。