李高志，張麗君，王藝璇，徐麗群，胡澤兵，石 菲，張 舒，曹新生

空軍軍醫(yī)大學(xué) 航空航天醫(yī)學(xué)系，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，陜西西安 710032

骨質(zhì)疏松的治療和骨折修復(fù)是臨床關(guān)注的熱點，如何促進(jìn)和維持骨的生成是需要重點解決的問題。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼的生長發(fā)育和修復(fù)重建過程中，血管新生與骨形成密切相關(guān)[1-3]。骨骼中的血管系統(tǒng)能夠運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和代謝廢物，同時骨骼內(nèi)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能和新骨形成[4-5]。相應(yīng)的，成骨細(xì)胞也可以分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管新生[6-7]。因此，探究微血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控，將為促進(jìn)骨骼的生長發(fā)育和修復(fù)重建提供新的思路。細(xì)胞共培養(yǎng)指兩種或多種細(xì)胞在同一種培養(yǎng)條件下共同培養(yǎng)，可更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，這種方法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞間相互調(diào)控的研究[8]。構(gòu)建微血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，可以更加真實地模擬骨骼生長發(fā)育和修復(fù)重建過程中骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞的相互作用，也是血管化組織工程骨中常見的細(xì)胞組合類型[9]。本研究選取小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1和小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3作為研究材料，采用非接觸共培養(yǎng)的方式建立MC3T3-E1/bEnd.3共培養(yǎng)體系，旨在觀察bEnd.3細(xì)胞通過旁分泌途徑對MC3T3-E1細(xì)胞增殖和凋亡功能的影響。

材料和方法

1 材料 小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，青-鏈霉素雙抗溶液(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(Millipore公司)，Transwell小 室(0.4μm孔 徑，Millipore公 司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，Annexin VFITC/PI試劑盒(BioVision公司)，PI試劑盒(碧云天公司)，M-PER哺乳動物蛋白抽提試劑(Thermo Fisher Scientific公司)，細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)一抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology公司)，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology公司)，Caspase-3一抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology公 司)，GAPDH一 抗(1∶5 000，Proteintech公司)，二抗(1∶5 000, ZSGBBIO公司)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(Merck Millipore公司)，PBS緩沖溶液(Gibco公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)，化學(xué)發(fā)光儀( Tanon-4 200，上海天能科技有限公司)。

2 MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37℃孵箱中，保持5% CO2濃度，每2 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到約90%時，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代處理。選取復(fù)蘇后3 ～ 6代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培 養(yǎng)或共培養(yǎng)。

3 bEnd.3細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37℃孵箱中，保持5% CO2濃度，每2 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到約80%時，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代處理。選取復(fù)蘇 后3 ～ 6代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。

4 MC3T3-E1/bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立 取復(fù)蘇后3 ～ 6代生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×105/mL后將1 mL細(xì)胞懸液均勻接種于6孔板。利用孔徑0.4 μm的Transwell小室建立非接觸的細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。取復(fù)蘇后3 ～ 6代生長狀態(tài)良好的bEnd.3細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×105/mL后 將1 mL細(xì) 胞 懸 液 均 勻 接 種于Transwell小室內(nèi)底面。然后將接種有bEnd.3細(xì)胞的Transwell小室插入接種有MC3T3-E1細(xì)胞的6孔板中，建立MC3T3-E1和bEnd.3的1∶1比例的細(xì)胞共培養(yǎng)體系。單獨(dú)培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞，孔中不置入小室。兩者均使用共培養(yǎng)培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基與α-MEM培養(yǎng)基混合，比例為1∶1，含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液)，置于37℃孵箱中，保持5% CO2濃度，每2 d換 液1次。

5 實驗分組 對照組：單獨(dú)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞；共培養(yǎng)組：MC3T3-E1細(xì)胞 + bEnd.3細(xì)胞，實 驗重復(fù)3次。

6 CCK-8法檢測MC3T3-E1細(xì)胞活性 分別于0 h、24 h、48 h、72 h移去小室，取出兩組細(xì)胞，棄上清液，每孔中加入1 mL新鮮培養(yǎng)基和CCK-8試劑100 μL，于37℃孵箱中孵育2 h，然后將反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光值。以6孔板的每孔細(xì)胞作為1 次生物學(xué)重復(fù)，本實驗共進(jìn)行了3次重復(fù)。

7 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測MC3T3-E1細(xì)胞周期 在細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，移去小室，取出兩組細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清后，PBS洗滌，離心(1 000 r/min，5 min)，棄掉PBS后，加入1 mL PBS和2 mL無水乙醇固定，4℃過夜。取出固定好的細(xì)胞，參照試劑盒說明書配置反應(yīng)溶液，加入細(xì)胞，避光10 min后，流式細(xì)胞儀檢測并分析MC3T3-E1細(xì)胞 周期分布。

8 Annexin V-FITC/PI雙 染 流 式 細(xì) 胞 術(shù) 檢測MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率 在細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，移去小室，取出兩組細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清后，PBS洗滌，離心(1 000 r/min，5 min)，棄掉PBS后，加入PBS溶液重懸細(xì)胞，參照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒配置反應(yīng)溶液，標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì) 胞儀檢測MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率。

9 Western blotting檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況 在細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，移去小室，胰酶消化后，收集細(xì)胞并裂解，提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行BCA定量。按30～50 μg的蛋白量加樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗(PCNA為1∶1 000，Bax為1∶1 000，Caspase-3為1∶1 000，GAPDH為1∶5 000)，4℃孵育過夜后，洗膜，山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光后，使用凝膠成像儀觀察拍照，利用Image J軟件 進(jìn)行定量分析。

10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS22.0進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，以 xˉ ±s表示，兩樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計 學(xué)意義。

結(jié) 果

1 共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖 在共培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h的4個時間點，對兩組MC3T3-E1細(xì)胞樣本進(jìn)行CCK-8檢測(圖1)。從生長曲線可以看出，對照組和共培養(yǎng)組MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活性均隨著時間延長而增加，但共培養(yǎng)組MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活性增加更明顯，并且在共培養(yǎng)48 h和72 h兩個時間點兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜ 0.05)。PI單染流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果表明(圖2)，與bEnd.3共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1細(xì)胞周期中3個時期的比例出現(xiàn)顯著變化。與對照組相比，共培養(yǎng)組MC3T3-E1細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例顯著下降(P ＜ 0.01)，S期的細(xì)胞比例顯著增高(P ＜ 0.01)，G2/M期的細(xì)胞比例顯著增高(P ＜ 0.05)，結(jié)果提示共培養(yǎng)條件下bEnd.3能夠顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖功能。Western blotting的結(jié)果證實(圖3)，與bEnd.3共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1細(xì)胞的PCNA蛋白表達(dá)水平顯著升高(P ＜ 0.01)，表明MC3T3-E1細(xì)胞的增殖 能力較對照組顯著增強(qiáng)。

圖 1 CCK-8檢測共培養(yǎng)條件下，bEnd.3對MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響 (aP＜0.05，vs 對照組)Fig.1 Effect of coculture with bEnd.3 on cell viability of MC3T3-E1 by CCK-8 assay (aP＜0.05, vs control group)

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測共培養(yǎng)條件下，bEnd.3對MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響 (aP＜0.05，bP ＜0.01，vs 對照組)F ig.2 Effect of coculture with bEnd.3 on MC3T3-E1 cell cycle by flow cytometry (aP＜0.05, bP ＜0.01, vs control group)

2 共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制成骨細(xì)胞的凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明(圖4)，與bEnd.3共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降(P ＜ 0.05)。采用Western blotting檢測凋亡相關(guān)因子Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)變化(圖5)，結(jié)果顯示，與對照組相比，共培養(yǎng)組MC3T3-E1細(xì)胞Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平顯著降低(P ＜ 0.05)。上述結(jié)果提示，在Transwell共培養(yǎng)條件下，bEnd.3能夠抑制MC3T3-E 1細(xì)胞的凋亡。

圖 3 Western blotting檢測PCNA蛋白的表達(dá) (bP＜0.01，vs 對照組)Fig.3 PCNA protein expression detected by Western blotting(bP＜0.01, vs control group)

圖 4 流式細(xì)胞儀檢測共培養(yǎng)條件下，bEnd.3對MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響 (aP＜0.05， vs 對照組)F ig.4 Effect of coculture with bEnd.3 on apoptosis of MC3T3-E1 by flow cytometry (aP＜0.05, vs control group)

圖 5 Western blotting 檢測共培養(yǎng)條件下MC3T3-E1細(xì)胞中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá) (aP＜0.05，vs 對照組)F ig.5 Western blotting detection of Bax and Cleaved Caspase-3 protein expression (aP＜0.05, vs control group)

討 論

在骨骼的生長發(fā)育及修復(fù)重建中，血管新生與骨形成是兩個密切相關(guān)的過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼愈合過程中，成骨細(xì)胞選擇性地分布于骨內(nèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍，提示成骨細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間可能通過細(xì)胞間通訊調(diào)控血管新生與骨形成[3-4,10]。

細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)為探究成骨細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互調(diào)控，并構(gòu)建血管化組織工程骨提供了便利條件。目前，根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌?，可以采用兩種方式建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系[11-12]。一是直接接觸共培養(yǎng)，即將兩種細(xì)胞接種于同一載體上，不同種類的細(xì)胞之間可以直接接觸。這種方法能夠觀察兩個相鄰細(xì)胞之間的直接相互作用[13]，如細(xì)胞間黏附和縫隙連接。二是間接接觸共培養(yǎng)，通常采用Transwell小室來進(jìn)行實驗，通過培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的交流來實現(xiàn)細(xì)胞之間的交流，從而使細(xì)胞擁有共同的培養(yǎng)環(huán)境[14]。這種方法能夠觀察兩種細(xì)胞之間的旁分泌相互作用。其中，Transwell小室共培養(yǎng)技術(shù)是較為成熟且應(yīng)用較多的實驗方法。在內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，內(nèi)皮細(xì)胞根據(jù)脈管來源可以分為大血管內(nèi)皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞兩種類型[15-16]。大血管內(nèi)皮細(xì)胞中最常用的是臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)[17]。Han 等[18]構(gòu)建HUVEC/MC3T3-E1共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)目顯著提高，成骨分化功能顯著增強(qiáng)。此外，Dariima等[19]利用原代主動脈內(nèi)皮細(xì)胞與MC3T3-E1建立共培養(yǎng)體系，證實MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OCN、OPN以及Col I的表達(dá)水平顯著升高，成骨分化功能增強(qiáng)。Lee等[20]證實主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)能夠保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)，并維持其分化潛能和增殖能力。研究表明，與大血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠更加真實地模擬骨骼系統(tǒng)中微血管內(nèi)皮細(xì)胞對成骨譜系細(xì)胞的調(diào)控作用[21]。但由于骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞含量稀少，導(dǎo)致其分離純化受到很大制約。目前，在體外細(xì)胞學(xué)實驗中，微血管內(nèi)皮細(xì)胞通常從非骨組織中獲取，作為骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞的替代細(xì)胞。Laranjeira等[22]把人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human dermal microvascular endothelial cells，HDMEC)與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，HMSC)按照4：1的比例混合，構(gòu)建HDMEC/HMSC共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)HMSC的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)目顯著增多，其成骨分化功能顯著增強(qiáng)。Ribeiro等[16]利用HDMEC與HMSC建立直接共培養(yǎng)體系，證實在雙磷酸鹽的誘導(dǎo)下，共培養(yǎng)組HMSC的ALP、OCN、OPG和BMP-2表達(dá)水平顯著升高，且ALP活性顯著增強(qiáng)。

本研究利用Transwell小室，構(gòu)建bEnd.3/MC3T3-E1共培養(yǎng)體系。bEnd.3是一種小鼠腦組織來源的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。研究表明，其具備多種典型的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征，是微血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究中可靠的細(xì)胞模型[23-24]。已有研究表明，bEnd.3微血管內(nèi)皮細(xì)胞與骨骼細(xì)胞的功能密切相關(guān)。Song等[25]以bEnd.3細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)bEnd.3細(xì)胞來源的外泌體能夠抑制破骨細(xì)胞形成，從而抑制骨吸收，且具有良好的骨靶向性和生物相容性。但bEnd.3細(xì)胞與成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)研究尚未見報道。本研究首次采用非接觸共培養(yǎng)的方式建立MC3T3-E1/bEnd.3共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞相比，共培養(yǎng)組MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)，且S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，PCNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。同時，共培養(yǎng)組MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降，Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平降低。這些結(jié)果表明，在非接觸共培養(yǎng)條件下，bEnd.3細(xì)胞能夠顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡。既往研究主要關(guān)注在共培養(yǎng)條件下，內(nèi)皮細(xì)胞對成骨譜系細(xì)胞分化、礦化功能的調(diào)控[15,26-27]，而較少關(guān)注對其增殖、凋亡的影響，本研究拓寬了內(nèi)皮細(xì)胞對成骨細(xì)胞功能調(diào)控的認(rèn)識。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌多種可溶性細(xì)胞因子調(diào)控成骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，如內(nèi)皮素-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和成纖維細(xì)胞生長因子等[28-31]。我們推測bEnd.3細(xì)胞可能通過旁分泌途徑調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞的增殖及凋亡，但具體的分子機(jī)制尚未闡明，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，在Transwell小室共培養(yǎng)條件下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖，并抑制其凋亡。這為防治骨質(zhì)疏松、構(gòu)建血管化組織工程骨選擇合適的微血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了理論依據(jù)，并進(jìn)一步加深了微血管內(nèi)皮細(xì)胞對成骨細(xì)胞功能調(diào)控的理解。但細(xì)胞間具體的調(diào)控機(jī)制尚未明確，值得進(jìn)一步探討。