李 君，高宏杰，張 艷，李 濤

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院檢驗科，北京 100091； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所黨委辦公室，北京 100700； 3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515； 4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心理科，北京 100053)

烏靈膠囊是以我國珍稀藥用真菌——烏靈菌經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)精制而成的純中藥制劑，在臨床被用于治療失眠、抑郁和焦慮等[1-2]。既往對烏靈膠囊的研究主要集中在藥理方面[3-5]，而關(guān)于成分鑒別和含量測定等方面的研究有限。研究結(jié)果顯示，烏靈菌粉富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素、粗多糖及核苷等[6-7]?！吨腥A人民共和國藥典》記載烏靈菌的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中目前只有腺苷及甘露醇類物質(zhì)的含量測定。而菌類植物內(nèi)源性成分眾多且復(fù)雜，烏靈菌的藥理功效來自于各種成分的協(xié)同作用。過往單純將烏靈菌中腺苷、染料木素及甲基蜂蜜曲霉素等有限成分作為質(zhì)量控制監(jiān)測指標(biāo)[8-9]，無法反映烏靈菌整體成分信息，不能有效監(jiān)控烏靈菌不同批次間成分含量差異，難以保證藥效的重復(fù)性。本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)對烏靈膠囊中不同類型的主要組分進行含量測定，為烏靈膠囊內(nèi)源性成分的整體質(zhì)量控制和藥效成分研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200系列快速高分辨液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(Triple-TOF 5600 PLUS，美國AB SCIEX公司)。Adventurer AR1140型十萬分之一電子分析天平(美國OHAUS公司)；Milli-Q Plus純化水儀器 (Millipore公司)；SB-5200 DTD型超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；MS3型旋渦混合器(德國IKA公司)；Captiva 96孔板過濾裝置(美國安捷倫科技有限公司)；SpeedVac SPD121P型離心濃縮儀(美國Thermo公司)。

1.2 藥品與試劑

烏靈膠囊(批號：190558-191009；浙江佐力藥用有限責(zé)任公司)；腺苷對照品(批號：110867-201809)、染料木素對照品(批號：111853-201607)及5-甲基蜂蜜曲霉素對照品(批號：11872-201532)均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均>98%；鳥苷(批號：SLBR2025V)、尿苷(批號：SLBR2327V)、尿酸(批號：SLBR4791V)、膽堿(批號：SLBR5231V)、左旋肉堿(批號：SLBR7143V)、多巴胺(批號：SLBR3951V)、甘氨酸(批號：SLBL4867V)、蛋氨酸(批號：SLBK1781V)、酪氨酸(批號：BCBQ3889V)、組氨酸(批號：SLBR4399V)、蘇氨酸(批號：SLBK2266V)、丙氨酸(批號：BCBQ3887V)、亮氨酸(批號：BCBQ9997V)、異亮氨酸(批號：SLBN6787V)、色氨酸(批號：WXBC0573V)、賴氨酸(批號：BCBR4758V)、天冬氨酸(批號：BCBQ7264V)、天冬酰胺(批號：SLBM5873V)、纈氨酸(批號：SLBK4255V)、苯丙氨酸(批號：STBF1734V)、脯氨酸(批號：SLBQ5622V)、絲氨酸(批號：SLBN3834V)、谷氨酸(批號：SLBL3592V)、谷氨酰胺(批號：SLBP5086V)、精氨酸(批號：SLBK3324V)、?；撬?批號：BLBN1549V)及γ-氨基丁酸(批號：BCBN3020V)均購自Sigma公司。同位素腺苷(批號：PR-28063)、同位素尿苷(批號：1-23265)、氘代膽堿(批號：PR-28063)、氘代肉堿(批號：PR-15366)、氘代丙氨酸(批號：PR-17582)、氘代精氨酸(批號：PR-18725)、氘代纈氨酸(批號：I-19231)、氘代異亮氨酸(批號：PR-26535)、氘代苯丙氨酸(批號：PR-23811)及氘代色氨酸(批號：PR-14798)均購自劍橋同位素公司。甲酸、甲醇及乙腈均為色譜純，購自Fisher公司；Milli-Q純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取30種標(biāo)準(zhǔn)品和10種同位素標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇水(體積分?jǐn)?shù))溶液配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/ml的單標(biāo)儲備液。移取適量單標(biāo)儲備液混合于同一容量瓶中，獲得混合對照品儲備液。檢測時用純水逐級稀釋配制0.01～10 μg/ml系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每份混標(biāo)液中均含有0.2 μg/ml的10種同位素標(biāo)準(zhǔn)品(內(nèi)標(biāo))。

2.2 供試品溶液的制備

精確稱取烏靈菌粉20 mg， 加入80%甲醇溶液1 ml，超聲(功率為300 W，頻率為40 kHz) 提取30 min， 4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至離心管，離心濃縮至干。復(fù)溶溶劑選用2%乙腈(含0.2 μg/ml的10種同位素標(biāo)準(zhǔn)品)，每份干燥樣品以200 μl復(fù)溶，渦旋混勻，96孔板過濾于收集盤，待上機檢測。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件：色譜柱為UPLC HSS T3柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司)；流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液，A相為水(含有0.1%甲酸)，B相為乙腈(梯度洗脫過程中A相比例變化如下：0 min，98%；6 min，50%；8 min，30%；10 min，0%；13 min，0%；13.1 min，98%；16 min，98%)；進樣量為5 μl；流速為0.35 ml/min；柱溫為40 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件：正離子電離模式，電噴霧電壓5 500 V，霧化氣溫度500 ℃，解簇電壓80 V，氣簾氣35 psi，霧化氣50 psi，輔助氣60 psi，高分辨全掃描模式，掃描范圍m/z70～600，平行設(shè)定信息依賴采集(information dependent acquisition，IDA)功能，二級質(zhì)譜掃描范圍m/z40～600，每個掃描周期選定10個最強母離子觸發(fā)二級質(zhì)譜，碰撞能量(CE)設(shè)為(30±15) eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)提取與定量結(jié)果輸出采用AB SCIEX公司的Analyst 1.7.1、PeakView 2.2和MultiQuant 3.0.2軟件。

2.5 方法專屬性考察

以本研究建立的LC-MS方法，分析白溶劑、加入混標(biāo)的烏靈菌粉提取液，結(jié)果顯示，所有目標(biāo)成分均的分離不受背景與基質(zhì)的干擾，見圖1。

2.6 線性范圍與定量限

取來自于10個不同批次的混合烏靈菌粉作為混合基質(zhì)，以“2.2”項下制備方法提取并揮干，用“2.1”項制備的系列混標(biāo)液各200 μl復(fù)溶混合基質(zhì)，同時平行制備空白基質(zhì)(含0.2 μg/ml的10種同位素標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)標(biāo))。依照“2.3”項下參數(shù)條件進行分析。用加標(biāo)的混合基質(zhì)中各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積扣除空白基質(zhì)中對應(yīng)的內(nèi)源性成分峰面積后，與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)(Y)，以檢測目標(biāo)成分濃度為橫坐標(biāo)(X)，采用加權(quán)最小二乘法擬合(權(quán)重1/X2)，得出各檢測成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(信噪比S/N≥3)和定量限(信噪比S/N≥10)，結(jié)果表明，所有目標(biāo)成分線性關(guān)系良好，見表1。

表1 烏靈混合基質(zhì)中各標(biāo)準(zhǔn)品組分的線性回歸方程、定量限、檢出限及定量限Tab 1 Linear regression equation, limit of quantification, limit of detection and limit of quantification of each standard components in Wuling mixed matrix

2.7 精密度試驗

烏靈菌粉提取基質(zhì)中分別加入低、中及高3個質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μl，所含內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度均為0.2 μg/ml，每個濃度平行6份，按“2.3”項下儀器條件分析，連續(xù)進樣5 d，計算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果表明，所有組分日內(nèi)及日間精密度的RSD均<10%，見表2。

2.8 提取回收率

精密稱取10個批次的混合烏靈菌粉，分別加入低、中及高3個質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)液，每個濃度平行6份，按照“2.2”項下方法處理樣品，作為處理前加標(biāo)樣品。同時平行處理相同份數(shù)的未加標(biāo)烏靈菌粉，在復(fù)溶樣品時，加入低、中及高3個質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)液，每個濃度平行6份，作為后加標(biāo)樣品。所有樣品均按照“2.3”項下儀器條件檢測，提取回收率=(后加標(biāo)濃度-前加標(biāo)濃度)/已知濃度×100%，結(jié)果見表2。

2.9 穩(wěn)定性試驗

精密稱取10個批次的混合烏靈菌粉，分別加入低、中及高3個質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)液，每個濃度6份平行，按照“2.2”項下方法處理樣品，分別考察室溫(25 ℃)放置24 h，經(jīng)過3次凍融后各成分的穩(wěn)定性。按照“2.3”項下儀器條件檢測不同階段所有成分與0時刻濃度的比值變化，結(jié)果顯示，所有變化率均<10%，表明上述樣品處理與存放條件下，樣品比較穩(wěn)定，測定準(zhǔn)確。

2.10 樣品測定

取10批烏靈菌粉，按照“2. 2”項下供試品制備方法制備成供試品，按照“2.3”項下儀器條件測定，結(jié)果見表2。

表2 精密度、提取回收率結(jié)果及10個批次烏靈菌粉中多組分含量檢測結(jié)果Tab 2 Precision, recovery tests,and multi-component contents of 10 batches of samples

3 討論

烏靈菌是我國珍稀藥用真菌。烏靈菌粉富含染料木素、5-甲基蜂蜜曲霉素、氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素及粗多糖等多種營養(yǎng)成分[10]。其中許多組分具有很好的藥理活性和潛在的藥用價值。例如，多巴胺是一種神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，其體內(nèi)水平過低與抑郁癥發(fā)病密切相關(guān)[11]。但是對于烏靈菌(烏靈膠囊)的分析，未見有關(guān)這類成分的研究報道。因此，有必要建立烏靈菌膠囊多組分監(jiān)測的質(zhì)量控制方法，以確保不同批次間藥效的重復(fù)性。

單純依賴色譜、光譜手段檢測藥品中指標(biāo)成分的含量，易受異構(gòu)體等雜質(zhì)干擾，且無法實現(xiàn)多組分的同時確檢測。質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢，結(jié)合液相色譜(liquid chromatography, LC)或氣相色譜(gas chromatography, GC)聯(lián)用手段，已成為當(dāng)前藥物質(zhì)量控制的首選方法[12-15]。三重四極桿質(zhì)譜儀(triple quadrupole, QqQ)被認(rèn)為是藥物定量檢測的最佳技術(shù)[16-17]。但是QqQ對標(biāo)準(zhǔn)品依賴性較強，易受雜質(zhì)干擾[18]。當(dāng)需要對中藥的化學(xué)成分進行整體質(zhì)量控制時，LC-QqQ則無法監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)品以外的成分。本研究采用的四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(高分辨質(zhì)譜)恰好能夠彌補這一不足，可以更好地區(qū)分這些干擾組分，通過獲得中藥整體內(nèi)源性成分的精確分子量、一級、二級質(zhì)譜，與數(shù)據(jù)庫比對，即可同時獲得定性、定量信息，無需使用標(biāo)準(zhǔn)品。本研究在采用高分辨全掃描方法獲得組分定量信息的同時，結(jié)合信息依賴采集技術(shù)進一步減少假陽性發(fā)生的概率[18-19]。與已報道高效液相-熒光檢測相比，本方法不僅可以增加氨基酸譜的覆蓋度[8]，包括色氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺及?；撬幔€可以分離前者無法區(qū)分的組氨酸與甘氨酸等。

中藥質(zhì)量控制分析，需要同時獲得整體內(nèi)源性組分的定性、定量信息[20]。因此，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，開展了烏靈膠囊多組分含量研究。結(jié)果表明，肉堿、多巴胺、黃酮、核苷酸及氨基酸等組分含量較高，提示需要同時監(jiān)控烏靈膠囊多組分含量，以確保不同批次的藥效可重復(fù)性。本研究為烏靈膠囊更加嚴(yán)格的質(zhì)量控制提供了技術(shù)方法支撐，并為更深入地研究其功效成分提供了依據(jù)。

A. 空白溶劑；B—E. 混合標(biāo)準(zhǔn)品加入烏靈菌粉提取液；1—30號分別為賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、纈氨酸、腺苷酸、尿酸、尿苷、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、絲氨酸、?；撬?、甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、左旋肉堿、異亮氨酸、亮氨酸、多巴胺、色氨酸、膽堿、腺苷、尿苷、染料木素及5-甲基蜂蜜曲霉素A.blank solvents; B to E.mix standards were spiked into extracted solvents of Wuling powder; No.1 to No.30 indicates lysine, arginine, asparagine, aspartic acid, proline, valine, adenylate, uric acid, uridine, tyrosine, phenylalanine, histidine, serine, bovine Sulfonic acid, glycine, glutamic acid, threonine, methionine, alanine, γ-aminobutyric acid, L-carnitine, isoleucine, leucine, dopamine, tryptophan, choline, adenosine, guanosine, genistein and 5-methylellein圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流色譜圖Fig 1 Extracted ion chromatograms of standard references