王淑菁,付瑞,秦驍,劉朝陽,胡雅靈,王增,韓斌,王魁,岳秉飛
1.中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京100050;2.上海生物制品研究所,上海201403;3.北京科興生物制品有限公司,北京100085;4.華蘭生物疫苗有限公司,河南新鄉(xiāng)453000
疫苗生產(chǎn)過程中,不論是用胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化,還是用雞胚傳代培養(yǎng),均存在外源性病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。外源性病毒污染不僅影響疫苗的使用效果,且由于部分外源病毒的致病性,可能引起嚴(yán)重的生物安全問題[3-4]。降低潛在的外源病毒污染,保證疫苗的安全可靠是生物制品行業(yè)及管理部門的重要職責(zé)?!吨袊?guó)藥典》三部(2015 版)中流感全病毒滅活疫苗及流感病毒裂解疫苗,均屬雞胚培養(yǎng)流感疫苗,規(guī)定這兩種疫苗的種子批毒種需排除3 種外源性禽病毒[禽腺病毒Ⅰ型、Ⅲ型和禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)]污染[5],禽腺病毒Ⅰ型即雞胚致死孤兒病毒(chicken embryo lethal orphan virus,CELO)、禽腺病毒Ⅲ型即減蛋綜合征病毒(egg drop syndrome virus,EDS)及 ALV 本身引起禽類的傳染病并不嚴(yán)重,但往往引起雞群隱性感染,并能垂直感染雞胚,將給生物制品行業(yè)帶來嚴(yán)重危害[6]。周斌等[7]使用電鏡觀察及PCR 擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)鴨肝炎病毒雞胚尿囊液種毒中污染了高濃度的CELO。胡曉苗等[8]調(diào)查活毒疫苗中ALV 的污染情況,隨機(jī)抽取國(guó)內(nèi)外公司生產(chǎn)的的活毒疫苗,ALV 檢出率為28.57%?!吨袊?guó)藥典》三部(2015 版)規(guī)定的檢測(cè)方法是將流感毒種中和后,在雞胚成纖維細(xì)胞及雞胚肝細(xì)胞上連傳3 代培養(yǎng),再進(jìn)行血清學(xué)方法檢測(cè)?,F(xiàn)行方法檢測(cè)周期長(zhǎng),至少需4 周;檢測(cè)步驟繁瑣,需制備原代雞胚肝細(xì)胞。因此,急需建立快檢方法,提高檢測(cè)效率,縮短檢測(cè)時(shí)間,以滿足目前季節(jié)性流感疫苗批簽發(fā)和應(yīng)急檢驗(yàn)的要求。
熒光定量PCR(Q-PCR)具有特異型強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度好、快速等優(yōu)點(diǎn),是目前病毒檢測(cè)的最適方法[9-11]。中國(guó)食品藥品檢定研究院(簡(jiǎn)稱中檢院)自開展外源性病毒檢測(cè)工作以來,已建立了流感疫苗毒種中3 種外源性禽病毒的Q-PCR 檢測(cè)方法。中檢院作為方法建立實(shí)驗(yàn)室,組織3 家流感疫苗企業(yè)(上海生物制品研究所、北京科興生物制品有限公司及華蘭生物疫苗有限公司)為方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室,從方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性、病毒污染模擬試驗(yàn)及盲樣檢測(cè)等方面,進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證?,F(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 病毒及載體 CELO、ALV 及小鼠腺病毒(mouse adenovirus,MAdV)均購(gòu)自 ATCC(編號(hào)分別為 VR-432、VR-247 和 VR-550);EDS 購(gòu)自獸藥監(jiān)察所(編號(hào):AV114);小鼠白血病病毒由中檢院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)室分離保存;H1N1、H3N2 及B 型流感毒種均為北京科興生物制品有限公司送檢留樣樣品,外源性禽病毒檢測(cè)均為陰性,于-70 ℃保存;pMD19-T 載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
1.2 主要試劑及儀器 EASY Dilution(for Real Time PCR)、RNase-free Water、及 DNA / RNA 提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Taqman DNA Expression Master Mix 及 ABI 7500 fast 型和 ABI 7500型Q-PCR 儀均購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。
1.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 分別以CELO 目的序列(GenBank:U46933.1)29 763 ~ 30 208 bp、EDS 目的序列(GenBank:Y09598.1)17 569 ~ 18 086 bp 及ALV 目的序列(GenBank:DQ365814.1)79 ~ 233 bp為模板,人工合成目的基因序列,克隆至pMD19-T載體中。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品由方法建立實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一制備完成,克隆陽性樣品測(cè)序后,序列比對(duì)一致率為100%,質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備成功。
1.4 Q-PCR 擴(kuò)增 3 種外源性禽病毒的引物、探針均由上海英濰捷基公司合成,序列見表1。PCR 體系每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為:Master Mix 10 μL,無 RNA 酶水 3.75 μL,引物探針混合液 1.25 μL(引物濃度為 4 μmol / L,探針濃度為 2 μmol / L),質(zhì)粒DNA 或樣品5 μL,反應(yīng)總體系為20 μL。反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃1 min,共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。
1.5 實(shí)驗(yàn)室間方法的驗(yàn)證
1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算拷貝數(shù)后進(jìn)行10 倍系列稀釋,以不同稀釋倍數(shù)(1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104及 1 × 103copies / μL)的質(zhì)粒為模板進(jìn)行Q-PCR 擴(kuò)增。以病毒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),循環(huán)閾值(Ct)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線參數(shù)合格標(biāo)準(zhǔn):Slope 在-3 ~ -3.5 之間、R2> 0.99、擴(kuò)增效率(Eff)為90% ~110%。按下式計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。
拷貝數(shù)(copies / μL)=(6.02 × 1023)× 10-9(ng / μL)/(DNA length × 2 × 320)
1.5.2 靈敏度 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1 × 108~1 ×100copies / μL,每個(gè)樣品檢測(cè) 3 次。
表1 3 種外源性禽病毒的引物、探針序列Tab.1 Primers and probes of three extraneous avian viruses
1.5.3 特異性 CELO 選擇 EDS、MAdV、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型為特異性驗(yàn)證對(duì)照;EDS 選擇CELO、MAdV、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型為特異性驗(yàn)證對(duì)照;ALV 選擇小鼠白血病病毒、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型為特異性驗(yàn)證對(duì)照。每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。
1.5.4 重復(fù)性 分別對(duì) CELO、EDS 及 ALV 的 1 ×105和 1 × 104copies / μL 質(zhì)粒進(jìn)行試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間的檢測(cè),試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間拷貝數(shù)和Ct 的CV。
1.5.5 病毒污染模擬試驗(yàn) 將CELO、EDS 及ALV分別用PBS 從1 × 100開始進(jìn)行倍比稀釋。取不同濃度梯度的病毒,分別摻入10% H1N1 流感病毒后進(jìn)行Q-PCR 檢測(cè),模擬外源性禽病毒污染。CELO及EDS 摻入流感病毒的濃度梯度均為1 × 10-1~1 × 10-8;ALV 摻入流感病毒的濃度梯度為 1 × 10-1~1 × 10-6。
1.5.6 盲樣檢測(cè) 將CELO、EDS 及ALV 隨機(jī)摻入H1N1 流感病毒中,發(fā)給3 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行外源性禽源病毒檢測(cè),共12 個(gè)盲樣。盲樣1 ~4 含CELO;盲樣 5 ~ 8 含 EDS;盲樣 9 ~ 12 含 ALV。
2.1 CELO 結(jié)果顯示,4 家實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、靈敏度、特異性、重復(fù)性、病毒污染模擬試驗(yàn)及盲樣檢測(cè)結(jié)果均一致。標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Slope 在-3.250 ~-3.495 之間,R2值為 0.993 ~ 1,Eff 為 93.263% ~103.105%,均符合定量檢測(cè)的要求;靈敏度均達(dá)1 ×100copies / μL;特異性僅 CELO 檢出,其他病毒均未檢出;試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間的CV 為0.02% ~10.66%,均小于15%;檢出CELO 病毒摻入最低檢測(cè)限均為1 × 10-7,拷貝數(shù)為 15 ~ 23.16 copies / μL;盲樣 4 均為陽性樣品,盲樣1 ~3 均為陰性樣品。見表2。
2.2 EDS 結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù):4 家實(shí)驗(yàn)室Slope 在-3.368 ~ -3.471 之間,R2為 0.997 ~ 1,Eff為94.119% ~98.129%,均符合定量檢測(cè)要求;靈敏度:方法建立實(shí)驗(yàn)室靈敏度為 1 × 101copies / μL,3 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室靈敏度均為 1 × 100copies / μL;特異性:4 家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均一致,僅EDS 檢出,其他病毒均未檢出;重復(fù)性:4 家實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間的CV 為0.09% ~9.83%,均小于10%;病毒污染模擬試驗(yàn):方法建立實(shí)驗(yàn)室及2 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢出EDS 病毒摻入最低檢測(cè)限均為1 × 10-5,拷貝數(shù)為 12.7 ~ 73.72 copies / μL,1 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢出病毒摻入最低檢測(cè)限為1 × 10-4,拷貝數(shù)為47.98 copies / μL;盲樣檢測(cè):4 家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均一致,盲樣6 均為陽性樣品,盲樣5、7 及8 均為陰性樣品。見表3。
2.3 ALV 結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù):4 家實(shí)驗(yàn)室Slope在-3.325 ~ -3.449 之間,R2為 0.997 ~ 1,Eff 為94.961%~99.876%,均符合定量檢測(cè)要求;靈敏度:方法建立實(shí)驗(yàn)室及2 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室靈敏度均為1 × 101copies / μL,1 家方法驗(yàn)證室靈敏度為 1 ×100copies / μL;特異性:4 家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均一致,僅ALV 檢出,其他病毒均未檢出;重復(fù)性:4 家實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間的CV 為0.00% ~9.63%,均小于10%;病毒污染模擬試驗(yàn),方法建立實(shí)驗(yàn)室及2 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢出ALV 摻入最低檢測(cè)限為1 ×10-4,拷貝數(shù)為 12.24 ~ 34.3 copies / μL,1 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢出病毒摻入最低檢測(cè)限為1 × 10-3,拷貝數(shù)為 352 copies / μL;盲樣檢測(cè):4 家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均一致,盲樣11 及12 為陽性樣品,盲樣9 及10 均為陰性樣品。見表4。
表2 CELO 實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證Tab.2 Interlaboratory verification results of CELO
表3 EDS 實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Interlaboratory verification results of EDS
表4 ALV 實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Interlaboratory verification results of ALV
CELO、EDS 及 ALV 的 Q-PCR 方法驗(yàn)證中,各實(shí)驗(yàn)室間在標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、特異性、重復(fù)性及盲樣檢測(cè)方面均得到一致性結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)均滿足Slope 在-3 ~ -3.5 之間、R2> 0.99、Eff 為 90% ~110%的要求;僅特異性病毒出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,其他病毒無擴(kuò)增曲線出現(xiàn);試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間Ct 和拷貝數(shù)的CV 均 < 15%。
在檢測(cè)EDS 及ALV 方法的靈敏度及病毒污染模擬試驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)室間出現(xiàn)不一致的結(jié)果。方法建立實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) EDS 的靈敏度為 1 × 101copies / μL,3 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室靈敏度均為1×100copies /μL;在病毒污染模擬試驗(yàn)中,方法建立實(shí)驗(yàn)室及2 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ALV 最低檢測(cè)限為1 × 10-4病毒摻入,1 家方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室為1 × 10-3。不同實(shí)驗(yàn)室間出現(xiàn)1 個(gè)數(shù)量級(jí)的差異,提示由于人員操作、儀器精密度等原因造成了不同實(shí)驗(yàn)室間方法靈敏度的不同,而實(shí)驗(yàn)室間方法驗(yàn)證的意義也在于此,盡可能考察方法的各個(gè)環(huán)節(jié),并設(shè)定合理的檢測(cè)流程及判定標(biāo)準(zhǔn)。在進(jìn)行方法的靈敏度限定時(shí),應(yīng)選擇4家實(shí)驗(yàn)室均能檢出的檢測(cè)限值作為判定標(biāo)準(zhǔn)。
WHO 及《歐洲藥典》9.8 均規(guī)定雞胚培養(yǎng)流感疫苗生產(chǎn)中應(yīng)進(jìn)行病毒去除/ 滅活工藝驗(yàn)證,確保無外源性病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。如無法進(jìn)行病毒去除/ 滅活工藝驗(yàn)證,則需對(duì)流感病毒種子批毒種及單價(jià)液均進(jìn)行外源性禽病毒檢測(cè),并推薦使用快速檢測(cè)方法,如PCR 方法,但未列出特異性引物或探針[12-13]。
中檢院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)室建立了3 種外源性禽病毒Q-PCR 方法,并從標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、靈敏度、特異性、重復(fù)性、病毒污染模擬試驗(yàn)、盲樣檢測(cè)方面開展實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證,獲得了一致性結(jié)果,結(jié)果表明,3種外源性禽病毒Q-PCR 檢測(cè)方法具有良好的靈敏度、特異性、重復(fù)性,可用于流感疫苗毒種外源性禽病毒的快速檢測(cè),為該快檢方法的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。