孫少憶，馬露，劉軍，李佩佩，趙曉璐，田玉潭，馬亞男，劉敦華

(寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

葡萄是世界上產(chǎn)量最大的水果之一。國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年中國(guó)葡萄產(chǎn)量為1 366.68萬(wàn)t。葡萄酒渣是指葡萄釀酒后產(chǎn)生的殘?jiān)约皬U棄物，主要由葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗組成，占釀酒葡萄總加工質(zhì)量的20%，資源極其豐富[1]。在中國(guó)，葡萄酒渣通常作為肥料或者飼料進(jìn)行循環(huán)利用。但是，在釀酒過(guò)程中，葡萄皮和葡萄籽與發(fā)酵酒的接觸會(huì)導(dǎo)致葡萄酒渣中含有大量多酚類物質(zhì)[2]。多酚類物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易降解，在土壤中累積直接影響作物生長(zhǎng)，使得葡萄酒渣無(wú)法作為肥料長(zhǎng)期使用[3-4]。因此，如何高效提取葡萄酒渣中的多酚類物質(zhì)就成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。另一方面，植物多酚具有抗氧化、清除自由基的作用，并已應(yīng)用于鹵肉制品保鮮等多個(gè)領(lǐng)域[5-6]。對(duì)提取得到的葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行研究，將有利于擴(kuò)大葡萄酒渣的應(yīng)用范圍，使資源得到最大化利用。

提取多酚類物質(zhì)的傳統(tǒng)方法包括機(jī)械攪拌固液萃取法和索氏萃取法，但提取時(shí)間較長(zhǎng)，可能導(dǎo)致目標(biāo)化合物的水解和氧化[7]。而一些非傳統(tǒng)方法，如超聲波輔助和微波萃取法，則可以避免這類問(wèn)題，從而高效提取多酚類物質(zhì)[8-10]。超聲波輔助提取法利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，加強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放與擴(kuò)散，從而加速有效成分的浸出，目前已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，不僅滿足消費(fèi)者對(duì)食品和副產(chǎn)品加工的需求，同時(shí)符合“綠色化學(xué)”的原則。該方法可以避免或最低限度使用有機(jī)溶劑，強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程，提高動(dòng)力學(xué)和萃取率，從而減少處理時(shí)間、處理溫度和能耗[11-12]。但是，采用超聲波輔助提取葡萄酒渣仍存在提取率較低的問(wèn)題[13-14]，不足以改善葡萄酒渣資源得不到合理利用的現(xiàn)狀。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法，結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)葡萄酒渣中的多酚類物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，然后篩選純化樹(shù)脂，鑒定多酚類物質(zhì)種類，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為葡萄酒渣的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，以期通過(guò)合理利用資源提高葡萄產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄酒渣由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，自然風(fēng)干。福林酚，北京百奧萊博科技有限公司；2,2′-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；樹(shù)脂(D101、NKA-2、DM130、S-8、NKA-9、HPD-100、X-5、DM301)，天津巴斯夫樹(shù)脂科技有限公司；沒(méi)食子酸、阿魏酸、4-香豆酸、綠原酸標(biāo)品(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對(duì)香豆酸標(biāo)品(色譜純)，成都曼思特生物科技有限公司；蘆丁、表兒茶素標(biāo)品(色譜純)，成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、甲酸(色譜純)，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；其他均為分析純，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

大孔吸附樹(shù)脂柱(φ28 mm×300 mm)，北京康維科電科技有限公司；數(shù)控超聲波清洗器KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)T6型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；臺(tái)式離心機(jī)5417R型，德國(guó)Eppendorf公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子天平ME230E型，Mettler(上海)有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)SE-150型，北京科一電器有限公司；超高效液色譜儀Agilent 1 290 Infinty，美國(guó)安捷倫公司；色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS C18 column型，美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚類物質(zhì)的提取 葡萄酒渣粉碎后取適量加入適宜體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，置于超聲波清洗器中超聲一定時(shí)間后，過(guò)濾移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL。

1.3.2 多酚類物質(zhì)含量測(cè)定 在0.5 mL樣液中加入1 mL福林酚溶液，反應(yīng)4 min后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%的碳酸鈉溶液，定容至10 mL，置于暗處1 h，于760 nm處測(cè)吸光值，以空白試劑為對(duì)照組。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照福林酚法[15]并略作修改，得到回歸方程y=0.1x+0.058 4(R2=0.998 8)。將測(cè)得的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程中計(jì)算葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量。

X=C×T×V/M

(1)

式中：X為多酚類物質(zhì)含量；C為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的質(zhì)量濃度；T為葡萄酒渣提取液的稀釋倍數(shù)；V為葡萄酒渣提取液的總體積；M為用于葡萄酒渣提取的樣品質(zhì)量。

1.3.3 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)提取的單因素試驗(yàn) 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、葡萄酒渣乙醇料液比(以下簡(jiǎn)稱料液比)m(葡萄酒渣/g)∶V(乙醇/mL)=1∶15、超聲時(shí)間為40 min、超聲功率250 W、超聲溫度50 ℃為固定條件，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、超聲時(shí)間(10、20、30、40、60、80、100、120、140 min)、超聲功率(250、300、350、400、450 W)和超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)提取的影響。

1.3.4 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)提取的響應(yīng)面試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)共3個(gè)因素，以多酚類物質(zhì)含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示，建立模型并確立最佳工藝。

表1 葡萄酒渣中多酚類物質(zhì)提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of polyphenols extraction from grape wine pomace by response surface methodology

1.3.5 靜態(tài)吸附解吸試驗(yàn) 取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的粗提取物50 mL分別加入處理好的8種樹(shù)脂各2.0 g，在30 ℃的恒溫振蕩器中振搖24 h，以達(dá)到吸附平衡。檢測(cè)上清液的多酚類物質(zhì)含量，由公式(2)和(3)計(jì)算吸附量和吸附率。將樹(shù)脂過(guò)濾并用去離子水完全洗滌，然后進(jìn)行解吸測(cè)試，在50 mL錐形瓶中加入50 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，在恒溫振蕩器靜態(tài)解吸24 h，以達(dá)到解吸平衡。解吸后，采用福林酚比色法檢測(cè)溶液中的多酚類物質(zhì)含量，根據(jù)公式(4)計(jì)算解吸率，根據(jù)公式(5)計(jì)算提取率。

Q1=(C0-Cr) ×V1/m

(2)

Q2=(C0-Cr)/C0×100

(3)

P=(V2×C)/(m×Q1) ×100

(4)

E=C/C0×100

(5)

式中：Q1為吸附量；Q2為吸附率；C0為葡萄酒渣多酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度；Cr為吸附后濾液中多酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度；V1為葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的粗提取物體積；m為樹(shù)脂質(zhì)量；P為解吸率；C為解吸后溶液中葡萄酒渣多酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度；V2為解吸液體積；E為提取率。

1.3.6 超高效液相色譜測(cè)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的種類 參考焦陽(yáng)[16]的方法略作修改。標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為1 g·L-1。色譜條件：C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)，二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)為280 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積為3 μL，流速300 μL·min-1，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1 %甲酸(A)、甲醇(B)。梯度洗脫程序?yàn)?～3 min，體積分?jǐn)?shù)95%～80%(A)；3～8 min，體積分?jǐn)?shù)80%～80%(A)；8～12 min，體積分?jǐn)?shù)80%～70%(A)；12～13 min，體積分?jǐn)?shù)70%～60%(A)；13～15 min，體積分?jǐn)?shù)60%～60%(A)；15～17 min，體積分?jǐn)?shù)60%～50%(A)；17～19 min，體積分?jǐn)?shù)50%～20%(A)；19～22 min，體積分?jǐn)?shù)20%～95%(A)。

1.3.7 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)抗氧化活性研究 以質(zhì)量濃度為0.2、1.0、2.0、3.0、4.0 g·L-1的葡萄酒渣多酚類物質(zhì)為研究對(duì)象，分別參照Z(yǔ)HAO等[17]、KUANG等[18]、CAO等[19]、鄭加嘉等[20]和PATIAL等[21]的方法，略加修改，檢測(cè)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)清除 DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基能力以及還原能力。參考DONG等[22]的方法，以相同質(zhì)量濃度的維生素C作為對(duì)照。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(6)

式中：Ai為樣品溶液與DPPH溶液混合后在517 nm處吸光度；Aj為樣品溶液與甲醇混合后在517 nm處吸光度；A0為甲醇在517 nm處吸光度。

ABTS+自由基清除率=[A0-(Ai-Ai0)]/A0×100%

(7)

式中：Ai為樣品溶液與ABTS+溶液混合后在734 nm處吸光度；A0為蒸餾水與ABTS+溶液混合后在734 nm處吸光度；Ai0為樣品溶液與蒸餾水混合后在734 nm處吸光度。

羥基自由基清除率=(Ai-A0)/A0×100%

(8)

式中：Ai為加樣品溶液在510 nm處吸光度；A0為不加樣品溶液在510 nm處吸光度。

超氧陰離子自由基清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(9)

式中：Ai為樣品溶液與鄰苯三酚溶液混合后在299 nm處吸光度；Aj為樣品溶液與蒸餾水混合后在299 nm處吸光度；A0為不加樣品溶液在299 nm處吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖形繪制，利用SPSS進(jìn)行顯著性分析，利用Design-Expert 8軟件進(jìn)行軟件響應(yīng)面分析，IC50指自由基清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的質(zhì)量濃度，利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響 如圖1所示，葡萄酒渣中提取的多酚類物質(zhì)含量隨乙醇的體積分?jǐn)?shù)增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，提取的多酚類物質(zhì)含量最高，為100.3 mg·g-1。

注：圖中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著，P<0.05。下同。Note：Different lowercase letters indicated the significant difference,P<0.05.The same as below.圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction of polyphenols content from grape wine residue

2.1.2 料液比對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響 如圖2所示，葡萄酒渣中提取的多酚類物質(zhì)含量隨料液比的增大而不斷升高，當(dāng)m(葡萄酒渣/g)∶V(乙醇/mL)=1∶10時(shí)，提取出的葡萄酒渣中的多酚類物質(zhì)含量最高，為83.4 mg·g-1，隨后提取的多酚類物質(zhì)含量逐漸降低。

圖2 料液比對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of wine residue and liquid ratio of ethanol on extraction of polyphenols content from grape wine residue

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響 如圖3所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，從葡萄酒渣中提取的多酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，直到120 min時(shí)達(dá)到最高，為147.4 mg·g-1，隨后開(kāi)始降低。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of polyphenol content from grape wine residue

2.1.4 超聲功率對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響 如圖4所示，在超聲功率為250 W時(shí)，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的含量達(dá)到最高，為112.0 mg·g-1，隨著超聲功率增大，葡萄酒渣中提取的多酚類物質(zhì)含量顯著開(kāi)始降低。因此，選擇超聲功率250 W進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 超聲功率對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of polyphenol content from grape wine residue

2.1.5 超聲溫度對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響 如圖5所示，隨著超聲溫度升高，葡萄酒渣中提取多酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度為70 ℃時(shí)，多酚類物質(zhì)含量最高，為90.6 mg·g-1，繼續(xù)升高超聲溫度，葡萄酒渣中多酚類物質(zhì)含量開(kāi)始降低。因此，選擇超聲溫度70 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 超聲溫度對(duì)提取葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響 Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on extraction of polyphenol content from grape wine residue

2.2 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)提取的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)3個(gè)因素，以多酚類物質(zhì)含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface methodology design and results of polyphenols content from grape wine residue

2.2.2 多酚類物質(zhì)含量的響應(yīng)面分析 通過(guò)方差分析和多元回歸擬合分析，得到葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型為：X=1 450.104 67-11.770 38A-21.380 42B-16.344 35C+0.090 283AB-0.145 24AC+0.229 73BC+0.356 04A2-0.503 12B2+0.080 884C2

回歸結(jié)果方差分析如下表3：

表3 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for polyphenol content from grape wine residue

由表3可知，多酚類物質(zhì)含量的模型極顯著(P<0.01)，失擬誤差為不顯著，模型的擬合度較高，可正確反映各影響因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系，能進(jìn)行可靠的預(yù)測(cè)。提取多酚類物質(zhì)的影響程度表現(xiàn)為C(超聲時(shí)間)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>B(料液比)，模型的確定系數(shù)、校正確定系數(shù)分別為R2=0.933 2，RAdj2=0.847 3，說(shuō)明該回歸模型能反映84.73%響應(yīng)值的變化。模型的變異系數(shù)為3.32，遠(yuǎn)小于10%，說(shuō)明多酚類物質(zhì)含量的模型可靠度和準(zhǔn)確性較高。

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)之間的交互作用對(duì)葡萄酒渣提取多酚類物質(zhì)含量的影響。三維響應(yīng)面坡度越陡峭，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于試驗(yàn)因素的改變?cè)矫舾衃23]。由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)與超聲時(shí)間(C)對(duì)多酚類物質(zhì)含量的交互最顯著，坡度相對(duì)最陡，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)的增大多酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)與料液比(B)，隨著料液比的增大呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而料液比(B)的響應(yīng)面坡度最緩，交互作用最不顯著。

圖6 不同交互作用對(duì)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)含量的影響Fig.6 Effects of different interaction on polyphenol content from grape wine residue

通過(guò)Design-Expert 8.0分析得出，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為47.47%，料液比m(葡萄酒渣/g)∶V(乙醇/mL)=1∶10.16，超聲時(shí)間為108.54 min時(shí)，理論值多酚類物質(zhì)含量達(dá)到151.9 mg·g-1?？紤]實(shí)際生產(chǎn)需要，將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)47%，料液比m(葡萄酒渣/g)∶V(乙醇/mL)=1∶10，超聲時(shí)間108 min，在此工藝下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到多酚類物質(zhì)含量為145.6 mg·g-1，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值接近，說(shuō)明該回歸模型可應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中。

2.3 靜態(tài)吸附解吸試驗(yàn)結(jié)果分析

8種樹(shù)脂對(duì)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的吸附解吸效果如圖7所示。HPD-100吸附率最高，達(dá)到91.75%，而D101吸附率為89.85%，無(wú)顯著差異；同時(shí)，D101解吸率最高，達(dá)到60.62%，推測(cè)是D101比表面積更大。綜合吸附解吸試驗(yàn)考慮，選擇D101對(duì)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)進(jìn)行純化，多酚類物質(zhì)提取率可達(dá)到89%以上。

2.4 超高效液相色譜鑒定葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的種類

由圖8可知，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)中鑒定出7種物質(zhì)，出峰順序依次為沒(méi)食子酸、蘆丁、對(duì)香豆酸、4-香豆酸、阿魏酸、表兒茶素和綠原酸，含量由高到低依次是對(duì)香豆酸、蘆丁、阿魏酸、沒(méi)食子酸、表兒茶素、綠原酸、4-香豆酸。其中，表兒茶素屬于黃烷醇類化合物，蘆丁屬于黃酮醇類化合物，沒(méi)食子酸屬于羥基苯甲酸類化合物，對(duì)香豆酸、4-香豆酸、阿魏酸、綠原酸屬于羥基肉桂酸類化合物，在葡萄酒渣中羥基肉桂酸類化合物的種類最多。

注：圖中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著，P<0.05。解吸率與吸附率分別進(jìn)行對(duì)比。Note：Different lowercase letters indicated the significant difference,P<0.05.The analytical and adsorption rates were compared respectively.圖7 8種樹(shù)脂對(duì)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的吸附解吸效果Fig.7 Adsorption and desorption of polyphenols from wine residue by 8 resin

圖8 超高效液相色譜鑒定葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的種類Fig.8 Identification of polyphenols in wine residue by ultra-high performance liquid chromatography

2.5 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)抗氧化活性

2.5.1 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除作用 如圖9所示，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)在質(zhì)量濃度小于1.0 g·L-1時(shí)與DPPH自由基的清除率呈線性關(guān)系，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而升高，在1.0 g·L-1時(shí)達(dá)到最大值96.195%，之后變化趨勢(shì)緩慢基本不變，IC50為0.807 6 g·L-1，而維生素C的IC50為0.553 6 g·L-1。在0.2～1.0 g·L-1時(shí)，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力大于維生素C，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，表明葡萄酒渣多酚類物質(zhì)有較好的DPPH自由基清除能力。

2.5.2 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)ABTS+自由基清除率分析 用于測(cè)定抗氧化劑活性的ABTS+自由基清除能力方法的工作機(jī)理與DPPH自由基清除能力方法相同，但是由于ABTS+試劑在水性和有機(jī)溶劑中的溶解性和快速性，使得ABTS方法比DPPH方法更可靠。ABTS+可與親脂性和親水性抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)[24]。由圖10可知，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)清除ABTS+自由基的能力在0.2～2.0 g·L-1呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，此時(shí)ABTS+自由基清除能力均高于維生素C，在3.0 g·L-1時(shí)ABTS+清除率達(dá)到98.316%，IC50為1.011 g·L-1。在3.0 g·L-1之后，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的ABTS+清除能力跟維生素C基本持平。維生素C在質(zhì)量濃度小于3.0 g·L-1時(shí)與ABTS+的清除率呈良好的線性關(guān)系，之后趨于平緩，IC50為1.485 g·L-1。綜上，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)對(duì)ABTS+具有較好的清除能力。

注：圖中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著，P<0.05。下同。Note：Different lowercase letters indicated the significant difference,P<0.05.The same as below.圖9 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH radical scavenging ability of polyphenols from wine residue

圖10 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)ABTS+自由基清除能力Fig.10 ABTS+radical scavenging ability of polyphenols from wine residue

2.5.3 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)羥基自由基清除率分析 羥基自由基是活性氧最集中的物質(zhì)，對(duì)鄰近的生物分子造成嚴(yán)重的破壞[25]。由圖11可知，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)清除羥基自由基的能力在0.2～1.0 g·L-1時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。在0.2 g·L-1時(shí)，對(duì)照組維生素C的羥基自由基清除率遠(yuǎn)高于葡萄酒渣多酚類物質(zhì)，維生素C的IC50為1.550 g·L-1。但在1.0 g·L-1之后，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的清除率均高于對(duì)照組維生素C，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的IC50為0.672 6 g·L-1。

圖11 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)羥基自由基清除能力Fig.11 Hydroxyl radical scavenging ability of polyphenols from wine residue

2.5.4 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)超氧陰離子自由基清除率分析 超氧陰離子是氧分子的還原形式，是活性自由基的前體，自由基有可能與生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而引起組織損傷[26]。由圖12可知，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的能力在0.2～2.0 g·L-1時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的能力遠(yuǎn)大于對(duì)照組維生素C。對(duì)照組維生素C的IC50為2.678 g·L-1，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的IC50為1.130 g·L-1。

圖12 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)超氧陰離子自由基清除能力Fig.12 Superoxide anion radical scavenging ability of polyphenols from wine residue

2.5.5 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)還原能力分析 螯合是重要的生物過(guò)程，因?yàn)殍F是呼吸、氧氣運(yùn)輸以及許多酶代謝所需的金屬元素。但是，過(guò)多的鐵會(huì)催化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他成分的氧化。金屬螯合活性降低了過(guò)渡金屬的濃度，從而催化脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減少。在過(guò)渡金屬中，F(xiàn)e2+由于具有高反應(yīng)活性而被公認(rèn)為是最強(qiáng)的促氧化劑，可加速氧化反應(yīng)的發(fā)生[27]。由圖13可知，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的還原能力在0.2～3.0 g·L-1內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，吸光值最高達(dá)到3.18，總體來(lái)說(shuō)，對(duì)照組維生素C的還原能力優(yōu)于葡萄酒渣多酚類物質(zhì)。

圖13 葡萄酒渣多酚類物質(zhì)還原能力Fig.13 Reducing ability of polyphenols from wine residue

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以葡萄酒渣為研究材料，探究了影響超聲波輔助提取多酚類物質(zhì)的因素，在單因素的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化多酚類物質(zhì)提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)47%、料液比m(葡萄酒渣/g)∶V(乙醇/mL)=1∶10、超聲時(shí)間108 min、超聲溫度70 ℃以及超聲功率250 W，在此條件下得到多酚類物質(zhì)含量為145.6 mg·g-1。本研究結(jié)果優(yōu)于李文蕾等[28]傳統(tǒng)溶劑提取法的提取結(jié)果，推測(cè)是由于傳統(tǒng)溶劑提取法費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，造成試劑浪費(fèi)的同時(shí)提取物雜質(zhì)含量高，整體提取效率較低。令博等[29]采用超聲輔助法提取葡萄皮渣多酚類物質(zhì)，提取含量?jī)H為8.502 mg·g-1，推測(cè)是由于該研究中料液比過(guò)高，阻礙了能量吸收，無(wú)法達(dá)到細(xì)胞壁破裂的要求[30]，同時(shí)提取時(shí)間短，多酚類物質(zhì)不能充分且有效地從葡萄酒渣中浸出[31]。

大孔吸附樹(shù)脂純化法是利用樹(shù)脂的吸附解吸特性，從植物中分離純化多酚等物質(zhì)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于從酒渣中分離純化多酚類物質(zhì)[32]。本研究中，通過(guò)靜態(tài)吸附解吸試驗(yàn)，篩選出D101樹(shù)脂對(duì)葡萄酒渣多酚類物質(zhì)的純化效果最佳，多酚類物質(zhì)提取率達(dá)到89%以上，與郭雄飛等[33]研究結(jié)果一致。利用超高效液相色譜對(duì)葡萄酒渣中多酚類物質(zhì)的種類進(jìn)行鑒別并對(duì)其含量進(jìn)行分析，羥基肉桂酸類化合物的種類最多，酚酸含量由高到低依次是對(duì)香豆酸、蘆丁、阿魏酸、沒(méi)食子酸、原兒茶素、綠原酸和4-對(duì)香豆酸。這與LAFKA等[34]研究結(jié)果一致。

通過(guò)測(cè)定葡萄酒渣多酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除率可知，其清除能力與多酚類物質(zhì)濃度之間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，對(duì)應(yīng)的IC50值分別為0.807 6、1.011、0.672 6、1.130 g·L-1，葡萄酒渣多酚類物質(zhì)DPPH自由基清除能力略低于維生素C，而對(duì)ABTS+自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力高于維生素C。本研究結(jié)果表明從葡萄酒渣中提取的多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化活性，因此可以作為天然抗氧化劑代替人工合成抗氧化劑，具有食品保鮮工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，從而進(jìn)一步擴(kuò)大葡萄酒渣的應(yīng)用范圍。