高國(guó)杰 夏艷 胡江天

軟骨聯(lián)合(synchondrosis)是顱底的生長(zhǎng)中心，以軟骨內(nèi)成骨的方式實(shí)現(xiàn)顱底的縱向生長(zhǎng)，進(jìn)而影響著頜面部的形態(tài)[1-3]。認(rèn)識(shí)顱底軟骨聯(lián)合生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制對(duì)深入理解頜面發(fā)育畸形的病因和矯治機(jī)制有重要意義。早期的觀點(diǎn)認(rèn)為顱底軟骨聯(lián)合的生長(zhǎng)受基因主導(dǎo)，而近年來(lái)的研究顯示適宜的牽張力刺激也能增強(qiáng)顱底軟骨聯(lián)合細(xì)胞(SOSCs)的增殖和基質(zhì)合成，從而促進(jìn)軟骨組織的生長(zhǎng)[4]。

通常情況下，氧為細(xì)胞生存和代謝活動(dòng)所必需，而氧供給依賴(lài)于血液循環(huán)。顱底軟骨聯(lián)合因缺乏血管而處于低氧狀態(tài)，軟骨細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的機(jī)制尚不完全明了。近年來(lái)的研究顯示，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，Hif-1α)對(duì)軟骨在低氧條件下的生長(zhǎng)和表型維持具有重要意義[5]。Hif-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，低氧條件下廣泛表達(dá)于包括軟骨在內(nèi)的多種組織[6]，調(diào)控著細(xì)胞的代謝、生存和多種基因的轉(zhuǎn)錄[7]。

在軟骨組織，Hif-1α能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖、分化關(guān)鍵調(diào)控因子Sox9和II型膠原的表達(dá)[5，8]；而適宜的牽張力刺激也能促進(jìn)這兩個(gè)因子在顱底軟骨聯(lián)合細(xì)胞的表達(dá)[9]。這些研究結(jié)果提示，HIF-1α可能處于軟骨細(xì)胞增殖、分化調(diào)控信號(hào)鏈的上游位置，且與張應(yīng)力具有相似的作用效果。但HIF-1α是否參與介導(dǎo)牽張力對(duì)顱底軟骨聯(lián)合細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)尚不清楚。本研究擬觀察張應(yīng)力作用下體外培養(yǎng)顱底軟骨聯(lián)合細(xì)胞增殖及HIF-1α表達(dá)的變化，為進(jìn)一步探究該問(wèn)題提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取1 d齡C57BL/6小鼠10只(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，按前期研究的方法獲取SOSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)[10]。Hif-1α在常規(guī)培養(yǎng)條件下會(huì)因快速降解而難以檢測(cè)。為了解Hif-1α在培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法用含氯化鈷(CoCl2·6H2O，Sigma公司，美國(guó))的培養(yǎng)基對(duì)第二代細(xì)胞進(jìn)行了模擬低氧培養(yǎng)和免疫組織化學(xué)染色。方法為；待細(xì)胞爬片生長(zhǎng)至約60%滿(mǎn)底時(shí)更換含100 μmol/L氯化鈷的培養(yǎng)基； 3 h后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，按Hif-1α抗體(1 ∶100稀釋?zhuān)珹bcam公司，美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 張應(yīng)力加載

將第二代SOSCs以1×105/mL的密度等量接種于6 孔BioFlex加力培養(yǎng)板(Flexcell公司，美國(guó))。待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%滿(mǎn)底時(shí)，按前述方法更換含100 μmol/L氯化鈷的培養(yǎng)基模擬低氧培養(yǎng)。 3 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用計(jì)算機(jī)控制張力測(cè)試機(jī)(FX5K型，F(xiàn)lexcell公司，美國(guó))對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加載循環(huán)張應(yīng)力，牽張形變率(elongation%)分別為3%、6%、9%，頻率為1 Hz，持續(xù)時(shí)間為1 h；對(duì)照組細(xì)胞不加力，按相同條件培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

加力結(jié)束后收集各組細(xì)胞，依次用70%乙醇溶液4 ℃固定細(xì)胞12 h；用RNA酶(50 μg/mL)37 ℃消化RNA 30 min；用碘化丙啶(100 μg/mL)冰上避光反應(yīng)30 min；隨即用流式細(xì)胞儀(FACS，BD公司，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞周期，根據(jù)細(xì)胞周期計(jì)算增殖指數(shù)(proliferative index，PI)，計(jì)算公式如下:

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%

1.4 Western blotting檢測(cè)

加力結(jié)束時(shí)即刻用含蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液(上海碧云天公司)于冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。各樣品取等量蛋白(50 μg)進(jìn)行5% SDS-PAGE凝膠電泳；分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5% BSA封閉非特異性蛋白，洗膜后分別加入1 ∶1 000稀釋的兔抗小鼠Hif-1α抗體(Abcam公司，美國(guó))和兔抗小鼠β-actin抗體(Abcam公司，美國(guó))4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法獲取蛋白印跡圖像；用圖像分析軟件(IPP6.0，Media Cybernetics公司，美國(guó))測(cè)量各印跡條帶的灰度值，用于計(jì)算Hif-1α的相對(duì)表達(dá)量；檢測(cè)重復(fù)3 次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)小鼠SOSCs中Hif-1α的表達(dá)

用含100 μmol/L氯化鈷的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)到Hif-1α在培養(yǎng)細(xì)胞廣泛表達(dá)，陽(yáng)性著色見(jiàn)于胞漿和胞核，且胞核著色較胞漿深而密集(圖1)。

圖1 小鼠SOSCs中Hif-1α的表達(dá)(ICH，DAB顯色，×200)

2.2 牽張力對(duì)體外培養(yǎng)小鼠SOSCs增殖的影響

頻率為1 Hz的循環(huán)張應(yīng)力刺激1 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖指數(shù)都較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；其中，牽張形變率為6%時(shí)細(xì)胞增殖指數(shù)較對(duì)照組增加最多(14.1%)，牽張形變率為3%和9%時(shí)增殖指數(shù)分別較對(duì)照組增加9.9%和8.7%(表1)。

2.3 牽張力對(duì)體外培養(yǎng)小鼠SOSCs中Hif-1α表達(dá)的影響

表1 循環(huán)張應(yīng)力刺激后小鼠SOSCs的增殖指數(shù)

張應(yīng)力刺激1 h后各組細(xì)胞Hif-1α的蛋白免疫印跡見(jiàn)圖2A。 圖像測(cè)量分析結(jié)果(圖2B)顯示：Hif-1α的相對(duì)表達(dá)量在牽張形變率為6%時(shí)最高(2.2)，3%牽張形變率時(shí)為1.54，9%牽張形變率時(shí)為1.37； 各實(shí)驗(yàn)組Hif-1α的相對(duì)表達(dá)量都較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

A： 蛋白免疫印跡; B： Hif-1α相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

顱底軟骨聯(lián)合因缺乏血管而處于低氧狀態(tài)，軟骨組織在低氧條件下維持表型和生長(zhǎng)的機(jī)制尚不完全明確。近年來(lái)，隨著低氧誘導(dǎo)因子的發(fā)現(xiàn)和研究的深入，對(duì)該問(wèn)題的認(rèn)識(shí)得到了推進(jìn)。在已知的低氧誘導(dǎo)因子三個(gè)成員中，Hif-1α與軟骨組織的關(guān)系密切。該因子包含α和β兩個(gè)亞基，其中Hif-1α不僅能通過(guò)糖酵解途徑為軟骨細(xì)胞提供能量，還能通過(guò)與基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、分化關(guān)鍵調(diào)控因子Sox9的表達(dá)。Hif-1α蛋白在常氧條件下不穩(wěn)定，原因在于其含有氧依賴(lài)的降解結(jié)構(gòu)域(oxygen dependence degradation domain，ODDD)，常氧條件下，脯氨酸羥化酶(prol-hydroxylas，PHD)使該結(jié)構(gòu)域的脯氨酸羥基化，促進(jìn)Hif-1α與腫瘤抑制因子VHL(von hippel-lindau)結(jié)合，繼而通過(guò)pVHL介導(dǎo)的泛素化-蛋白酶途徑在數(shù)分鐘內(nèi)快速降解[12]。在低氧條件下，PHD被抑制，Hif-1α得以穩(wěn)定表達(dá)并與Hif-1β結(jié)合，在Hif-1β的輔助下進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

常規(guī)體外培養(yǎng)條件時(shí)的氧濃度通常高于體內(nèi)軟骨組織的生理水平，為防止Hif-1α因降解而難以被檢測(cè)，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低氧培養(yǎng)。氯化鈷是一種細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中常用的低氧模擬劑[13]，其原理是鈷離子能通過(guò)與PHD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Hif-1α分子的ODDD來(lái)抑制Hif-1α的降解，從而模擬低氧狀態(tài)下細(xì)胞Hif-1α的表達(dá)[14]。氯化鈷對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞是否存在副作用尚不清楚，但有研究顯示適當(dāng)濃度的氯化鈷對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量和功能無(wú)明顯不利影響[15]。本研究參考相關(guān)研究，選擇含100 μmol/L氯化鈷的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，免疫組織化學(xué)染色顯示Hif-1α在培養(yǎng)細(xì)胞廣泛表達(dá)，表明所用實(shí)驗(yàn)方法可有效抑制體外培養(yǎng)小鼠蝶枕軟骨聯(lián)合細(xì)胞Hif-1α的降解，為在加載張應(yīng)力后檢測(cè)Hif-1α表達(dá)明確了實(shí)驗(yàn)條件。

力學(xué)刺激是頜面畸形矯形治療的主要手段，牽張力對(duì)頜骨生長(zhǎng)改建的積極作用已經(jīng)得到較為深入的認(rèn)知。隨著顱底與頜面的形態(tài)聯(lián)系日益受到重視，近年來(lái)有學(xué)者對(duì)軟骨聯(lián)合進(jìn)行了牽張力加載實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)有的研究表明，牽張力刺激可通過(guò)增強(qiáng)Sox9、Col2a1、Cbfa1、Vegf等多種因子的表達(dá)而促進(jìn)顱底蝶枕軟骨聯(lián)合細(xì)胞的增殖、分化和基質(zhì)合成[9,16-17]。這些研究成果顯示了牽張力刺激對(duì)顱底軟骨聯(lián)合生長(zhǎng)的積極影響，為頜面畸形力學(xué)矯治機(jī)制的相關(guān)研究帶來(lái)了新的啟示。但牽張力刺激對(duì)顱底軟骨聯(lián)合的生物學(xué)效應(yīng)及其產(chǎn)生機(jī)制還未充分明確。本研究的結(jié)果顯示，經(jīng)不同牽張形變率(3%、6%、9%)的循環(huán)張應(yīng)力刺激后細(xì)胞的增殖指數(shù)和Hif-1α表達(dá)水平都較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，表明循環(huán)張應(yīng)力對(duì)體外培養(yǎng)小鼠蝶枕軟骨聯(lián)合細(xì)胞的增殖及Hif-1α表達(dá)具有促進(jìn)作用；同時(shí)，兩者的增加程度都在牽張形變率為6%時(shí)最多，提示張應(yīng)力可能存在適宜的強(qiáng)度范圍。綜合以往的報(bào)道和本研究的結(jié)果，本研究推測(cè)增強(qiáng)Hif-1α的表達(dá)可能是張應(yīng)力促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用途徑之一。

4 結(jié) 論

綜合本研究的結(jié)果和相關(guān)研究的報(bào)道，一定強(qiáng)度的循環(huán)張應(yīng)力對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠顱底蝶枕軟骨聯(lián)合細(xì)胞的增殖和Hif-1α表達(dá)具有促進(jìn)作用；循環(huán)張應(yīng)力有可能通過(guò)上調(diào)Hif-1α的表達(dá)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。