方超，張智明，李建華，何世民

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是豬的一種以腹瀉、嘔吐、后期脫水以至死亡為臨床癥狀，由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、高度傳染性腸道疾病。哺乳仔豬的死亡率高是本病的典型特征，死亡率可達(dá)到50%～100%，是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要疾病[1-5]。2010年冬季以來(lái)，豬流行性腹瀉出現(xiàn)變異株，導(dǎo)致PEDV CV777株疫苗免疫效果不理想，不能對(duì)免疫豬提供良好的保護(hù)，因此，開發(fā)豬流行性腹瀉變異株疫苗有著十分迫切的現(xiàn)實(shí)意義[6-10]。

1 材 料

Vero細(xì)胞、MDBK細(xì)胞和PK-15細(xì)胞，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心傳代保存；豬流行性腹瀉ZF株F1代，由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清，購(gòu)自CLARK公司；胰酶，購(gòu)自GIBCO公司；PBS溶液，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制保存；中和抗體效價(jià)≥1∶32的豬流行性腹瀉陽(yáng)性血清，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心制備、標(biāo)定和保存；4～6周齡PEDV血清中和抗體陰性的斷奶仔豬3頭；牛病毒性腹瀉病毒熒光抗體和豬瘟病毒熒光抗體，由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 病毒培養(yǎng)和傳代

2.1.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代

將凍存的Vero細(xì)胞從液氮中取出后，立即置于37℃水浴中快速融化。待細(xì)胞完全解凍后，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用吸管吸取新配置的細(xì)胞培養(yǎng)液，將沉淀輕輕懸起并分散均勻后轉(zhuǎn)至含有10 mL細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)復(fù)蘇狀態(tài)，可在復(fù)蘇后24 h進(jìn)行1次換液。待細(xì)胞形成單層后棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS溶液輕輕清洗細(xì)胞表面2次后，加入0.25%的胰酶短暫消化后棄去胰酶，用適量的細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹打分散均勻，然后按照1∶3～1∶5比例進(jìn)行傳代，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.1.2 PEDV的接種與收獲

待細(xì)胞形成單層后，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS輕輕清洗表面2次后，按照2%的接種比例接種含有終濃度為10μg·mL-1胰酶的PEDV ZF株，置37℃培養(yǎng)箱中吸附1 h，期間每隔15 min輕輕晃動(dòng)1次，最后補(bǔ)加含有終濃度為10μg·mL-1胰酶的無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)相同條件的不接毒Vero細(xì)胞作為空白對(duì)照，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，逐日觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，收獲培養(yǎng)物，-20℃凍融2次后，備用。按照相同的方法將PEDV ZF株從F1代連續(xù)繼代15次，各代次病毒在收獲后，均-20℃凍融2次后，備用。

2.1.3 病毒含量的測(cè)定

將細(xì)胞懸液按每孔100μL的量接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48～72 h，待細(xì)胞形成單層后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。將收獲的病毒液用含有終濃度為10μg·mL-1胰酶的無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行10×的倍比稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6孔，每孔100μL。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照6孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，逐日觀察細(xì)胞病變。按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。正常細(xì)胞對(duì)照孔應(yīng)不產(chǎn)生CPE。

2.2 病毒鑒定

2.2.1 血清學(xué)鑒定

將PEDV病毒液，按照2.1.3病毒含量的測(cè)定結(jié)果，用含終濃度為10μg·mL-1胰酶的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋成200 TCID50/0.1 mL，分別與等量的豬流行性腹瀉陽(yáng)性血清、陰性血清混合，置37℃水浴作用1 h后，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中形成細(xì)胞單層的6個(gè)孔內(nèi)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)病變。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

引物的設(shè)計(jì)與合成。參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《豬流行性腹瀉病毒RT-PCR診斷技術(shù)》（GB/T 34757—2017）中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行引物合成及PCR檢驗(yàn)，擴(kuò)增315 bp長(zhǎng)的片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物為5"-TAT?GGCTTGCATCACTCTTA-3"，下游引物為5"-TT?GACTGAACGAACCAACACG-3"，按照試劑盒提供的提取核酸的步驟進(jìn)行操作，將上述提取的核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄（20μL體系）：模板8.0 mL，通用引物1.0μL，5×Buffer 4.0μL，RNA酶抑制劑1.0μL，DTT 1.0μL，M-MLV 1.0μL，無(wú)RNA酶水3.0μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：將模板與反轉(zhuǎn)錄通用引物混合，置70℃水浴5 min，冰浴后迅速冷卻，加入反轉(zhuǎn)錄體系的其他試劑，置42℃反轉(zhuǎn)錄1 h，然后再95℃終止反應(yīng)，即得。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，滅菌去離子水17.0μL，DNA模板1.0μL，Taq酶0.5μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃終止循環(huán)。將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在電壓5～10 V·cm-1條件下作用30 min，同時(shí)與DL 2000 DNA Marker進(jìn)行比較，即可得出試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 病毒的純凈性檢測(cè)

根據(jù)《中國(guó)獸藥典》（2015版，三部）的規(guī)定，疫苗的制備過(guò)程中需要對(duì)毒種的純凈性進(jìn)行檢驗(yàn)。檢測(cè)的外源病毒主要包括牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖于呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒Ⅰ型（PCV-1）和Ⅱ型（PCV-2），其中BVDV、CSFV采用中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的間接免疫熒光法（IFA）進(jìn)行檢測(cè)，其余4種病毒使用PCR或RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.1 間接免疫熒光法檢測(cè)

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，用豬流行性腹瀉陽(yáng)性血清中和后，分別接種已經(jīng)形成單層的MDBK細(xì)胞和PK15細(xì)胞，37℃培養(yǎng)至少14 d（中間應(yīng)至少傳代1次），并設(shè)相應(yīng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照和BVDV陽(yáng)性、CSFV陽(yáng)性對(duì)照。最后一次傳代的細(xì)胞單層培養(yǎng)5 d左右，按照BVDV、CSFV熒光抗體檢測(cè)說(shuō)明進(jìn)行熒光抗體檢查。

2.3.2 PCR或RT-PCR法檢測(cè)

取2.2.2中提取的核酸進(jìn)行PCR或RT-PCR檢測(cè)。參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《偽狂犬病診斷技術(shù)》（GB/T 18641—2002）中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行引物合成及PCR檢驗(yàn)，擴(kuò)增217 bp長(zhǎng)的片段，上游引物為5"-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3"，下游引物為5"-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3"，退火溫度56℃；參照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬細(xì)小病毒病聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程》（SN/T 1874—2007）中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行引物合成及PCR檢驗(yàn)，擴(kuò)增445 bp長(zhǎng)的片段，上游引物為5"-CAGAATCAGCAACCTCAC-3"，下游引物為5"-TG?GTCTCTTCTGTGGTAGG-3"，退火溫度為47.9℃；參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《豬繁殖和呼吸綜合征診斷方法》（GB/T 18090—2008）中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行引物合成及PCR檢驗(yàn)，擴(kuò)增372 bp長(zhǎng)的片段，上游引物為5"-GCGGATCCATGCCAAATAA?CAAC-3"，下游引物為5"-AGCTCGAGTCATGCT?GAGGGTGA-3"，退火溫度51℃；參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法》（GB/T 21674—2008）中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行引物合成及PCR檢驗(yàn)，PCV-1型652 bp，PCV-2型1 154 bp長(zhǎng)的片段，P1 5"-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3"，P2 5"-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3"，P3 5"-ACCCCCGCCACCGCTACC-3"，退火溫度62℃。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.4 無(wú)菌檢驗(yàn)與支原體檢驗(yàn)

根據(jù)《中國(guó)獸藥典》對(duì)病毒液進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和支原體檢驗(yàn)。

2.5 病毒的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

在疫苗的制備過(guò)程中，病毒的遺傳穩(wěn)定性非常重要，因此對(duì)PEDV進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。取2.1.2中連續(xù)培養(yǎng)傳代的PEDV ZF株F6代、F11代和F16代病毒液，按照2.2.2中所述的核酸提取以及反轉(zhuǎn)錄方法進(jìn)行核酸提取和反轉(zhuǎn)錄，對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行病毒的遺傳穩(wěn)定性分析。由于PEDV S蛋白是重要的免疫原性蛋白，因此選擇S基因的部分序列進(jìn)行。參照李衡[11]的研究結(jié)果合成擴(kuò)增PEDV S部分基因的引物，上游引物為5"-GGTAAGTTGCTAGTGCG?TAA-3"，下游引物為5"-CAGGGTCATCACAATA?AAGAA-3"，目的片段大小為1 461 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，滅菌去離子水17.0μL，DNA模板1.0μL，Taq酶0.5μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃終止循環(huán)。將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在電壓5～10 V·cm-1條件下作用30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并切割目的片段，直接送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果用DNA Stars軟件進(jìn)行分析。

2.6 病毒致病力的測(cè)定

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，根據(jù)病毒含量測(cè)定的結(jié)果稀釋到1×106.0TCID50·mL-1，備用，進(jìn)行病毒致病力的測(cè)定。用4～6周齡的PEDV血清抗體陰性的斷奶仔豬2頭，每頭豬經(jīng)口服2.0 mL備好的PEDV病毒液。同時(shí)另設(shè)1頭豬作為不接毒空白對(duì)照，相同條件隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)開始后觀察14 d，每天就試驗(yàn)豬的精神狀態(tài)、采食量、腹瀉情況、死亡等臨床癥狀進(jìn)行觀察和記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒培養(yǎng)和傳代的結(jié)果

PEDV ZF株接種Vero細(xì)胞后，在24 h左右Vero細(xì)胞出現(xiàn)膨大、變圓等輕微的細(xì)胞病變，隨著接毒時(shí)間的延長(zhǎng)，病變逐漸明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、膨大、出現(xiàn)空泡以及細(xì)胞脫落，最終使得細(xì)胞單層裂解。待細(xì)胞病變達(dá)到80%及以上時(shí)，收獲培養(yǎng)物；相同條件培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞僅出現(xiàn)細(xì)胞顆粒增多等細(xì)胞老化的現(xiàn)象，結(jié)果見圖1。

3.2 病毒含量的測(cè)定結(jié)果

將PEDV ZF株F1代在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代15次，每個(gè)代次均進(jìn)行病毒含量的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，PEDV ZF株在連續(xù)傳代的過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性穩(wěn)定，各個(gè)代次的病毒含量無(wú)明顯差異。

圖1 PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

表1 PEDV ZF株不同培養(yǎng)代次病毒含量測(cè)定結(jié)果

3.3 病毒鑒定

3.3.1 病毒的血清學(xué)鑒定結(jié)果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，進(jìn)行病毒的血清學(xué)鑒定。結(jié)果表明該代次PEDV ZF株可被豬流行性腹瀉病毒陽(yáng)性血清完全中和，接種的Vero細(xì)胞觀察5 d不產(chǎn)生細(xì)胞病變，病毒特異，結(jié)果見表2。

表2 血清學(xué)鑒定結(jié)果

3.3.2 病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，進(jìn)行PEDV的RT-PCR法鑒定，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明PCR能擴(kuò)增出片段大小為315 bp左右的條帶，與引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的條帶的大小一致。

3.4 病毒的純凈性鑒定結(jié)果

3.4.1 間接免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，用豬流行性腹瀉陽(yáng)性血清中和后，分別接種已經(jīng)形成單層的MDBK細(xì)胞和PK15細(xì)胞，進(jìn)行外源病毒BVDV和CSFV的檢測(cè)。結(jié)果表明，PEDV病毒液中BVDV、CSFV兩種外源病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，結(jié)果見圖3和圖4。

圖2 PEDV RT-PCR鑒定結(jié)果

圖3 BVDV間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

圖4 CSFV間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

3.4.2 PCR或RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液提取的核酸，進(jìn)行病毒液中PRV、PPV、PRRSV和PCV的PCR或RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在PEDV病毒液中，PRV、PPV、PRRSV和PCV的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，結(jié)果見圖5。

圖5 PEDV外源病毒檢測(cè)結(jié)果

3.5 PEDV病毒液無(wú)菌檢驗(yàn)及支原體檢驗(yàn)結(jié)果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液按照《中國(guó)獸藥典》要求進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)及支原體檢驗(yàn)。結(jié)果見表3和表4。結(jié)果表明PEDV病毒液沒有被細(xì)菌、霉菌、支原體等污染。

3.6 病毒的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

分別取PEDV ZF株培養(yǎng)收獲的F6代、F11代和F16代病毒液，進(jìn)行PEDV S蛋白部分基因的擴(kuò)增，結(jié)果見圖6。

表3 無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

表4 支原體檢驗(yàn)結(jié)果

圖6 PEDV S蛋白部分基因的擴(kuò)增結(jié)果

將擴(kuò)增的片段經(jīng)膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用DNA Star軟件包MegAlign的Clustal W進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果PEDV ZF株F6代、F11代和F16代的S蛋白部分基因的同源性在99.8%以上，病毒的遺傳穩(wěn)定性良好。結(jié)果見圖7。

圖7 PEDV ZF株不同代次S蛋白部分基因序列比對(duì)結(jié)果

3.7 病毒致病力的測(cè)定結(jié)果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液對(duì)4～6周齡的PEDV血清抗體陰性的斷奶仔豬進(jìn)行攻毒，進(jìn)行病毒致病力的測(cè)定，并在攻讀后每天對(duì)試驗(yàn)豬的精神狀態(tài)、采食量、腹瀉情況、死亡等臨床癥狀進(jìn)行觀察和記錄。結(jié)果攻毒的2頭豬在24 h后出現(xiàn)輕微的腹瀉、精神不振以及食欲減退等癥狀。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，攻毒的2頭豬臨床癥狀加重，出現(xiàn)水樣腹瀉、肛門及后肢糞便污染嚴(yán)重、四肢無(wú)力、站立不穩(wěn)以及被毛粗糙、沒有光澤等癥狀，7 d內(nèi)有1頭豬出現(xiàn)死亡，對(duì)死亡豬進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)腸壁變薄、變透亮、出血，腸道內(nèi)充滿氣體并含大量黃色內(nèi)容物，見圖8。未攻毒對(duì)照仔豬食欲正常，精神狀態(tài)良好。

圖8 攻毒豬剖檢結(jié)果

4 結(jié)論

為了能更好地應(yīng)對(duì)由PEDV變異株感染引起的豬流行性腹瀉，本試驗(yàn)對(duì)已經(jīng)分離鑒定的PEDV變異株進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性、病毒含量、純凈性、遺傳穩(wěn)定性及致病力的檢驗(yàn)，證明該毒株的細(xì)胞適應(yīng)性好、病毒含量高、病毒純凈、遺傳穩(wěn)定以及致病力良好，可以作為制備預(yù)防PEDV變異株滅活疫苗的候選疫苗株，為后期疫苗的制備做好鋪墊。