任偉超 徐姣 樊銳鋒 劉美琦 于欣欣 王思嘉 馬偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是一種在液流系統(tǒng)中快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的技術(shù)[1]。目前已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)及基因組大小測(cè)定的研究中。已經(jīng)在廣金錢草[2]、苔蘚[3]、蘭屬[4]、黃芩[5]、紫草[6]等植物基因組大小測(cè)定中有所應(yīng)用。

柳屬植物染色體倍性差異較大，包括二倍體、四倍體、六倍體，甚至十二倍體等，其中灌木類以二倍體為主，喬木類多為異源多倍體[7-9]。劉麗[10]以二倍體杞柳為對(duì)照，測(cè)定紅葉腺柳為二倍體，金絲垂柳、垂爆柳、旱柳、圓頭柳、漳河柳、黑柳、垂109為四倍體，竹柳、蘇柳J799為六倍體。張健等[11]測(cè)定旱柳的3個(gè)品種(沿江柳、9901柳、海柳1號(hào))均為四倍體，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀推測(cè)旱柳的基因組大小為670 Mb左右。有關(guān)柳屬倍性研究、DNA占染色體數(shù)量比例測(cè)定、染色體核型分析等細(xì)胞遺傳學(xué)的研究較少。

本研究以6種柳屬植物的圓頭柳(Salixcapitata)、烏柳(Salixcheilophila)、五蕊柳(Salixpentandra)、三蕊柳(Salixtriandra)、垂柳(Salixtriandra)、杞柳(Salixintegra)為研究對(duì)象，選取大豆(Glycinemax)、黃瓜(Cucumissativus)作為標(biāo)準(zhǔn)品；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，采用單細(xì)胞液測(cè)量、混合細(xì)胞液測(cè)量2種測(cè)量方法對(duì)部分柳屬植物染色體倍性測(cè)定和基因組大小進(jìn)行評(píng)估，分析不同種柳屬或同一種不同倍性的柳屬與其基因組大小之間的關(guān)聯(lián)性。旨在為柳屬細(xì)胞標(biāo)記鑒定、從分子水平為柳屬植物的分類及柳屬全基因組測(cè)序提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料取自哈爾濱市柳屬的無(wú)性系水培苗。培養(yǎng)條件——溫度25 ℃，光照期12 h，暗期12 h，光照度3 300 lx，培養(yǎng)20 d；取材部位為選取無(wú)病蟲(chóng)害且生長(zhǎng)特性好的新鮮嫩葉，用于染色體倍性測(cè)試和基因組大小測(cè)試(見(jiàn)表1)。

1.2 染色體倍性測(cè)試及基因組大小測(cè)試方法

標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：要求待測(cè)樣基因的大小，在標(biāo)準(zhǔn)品基因組大小范圍內(nèi)為原則。目前已知柳屬植物的基因大小范圍342～841 Mb，按照要求，為了保證測(cè)試效果，本研究選取大豆(基因1 150 Mb)、黃瓜(基因350 Mb)作為標(biāo)準(zhǔn)品。

單細(xì)胞懸液的制備：分別取1 g柳屬待測(cè)樣新鮮葉片，放入2 mL細(xì)胞裂解液中，用鋒利的刀片將其切碎，經(jīng)0.7 mm的濾膜過(guò)濾后試管收集濾液，放入離心機(jī)在1 000 r/min速度下離心5 min，棄掉上清液，收集沉淀細(xì)胞核。

表1 用于染色體倍性測(cè)試和基因組大小測(cè)試的材料

混合液制備：先用碘化丙啶染液對(duì)細(xì)胞核重懸，將細(xì)胞核懸液DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，溫度4 ℃下暗處染色20 min，再將2種以上的染液混合在一起，形成混合液。用流式細(xì)胞儀對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行基因組大小鑒定。

樣品上機(jī)檢測(cè)：調(diào)整參數(shù)，將標(biāo)準(zhǔn)品的橫坐標(biāo)固定。通過(guò)單獨(dú)上樣檢測(cè)，估算兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的粒子數(shù)，并檢查樣品質(zhì)量；按比例與待測(cè)樣混勻后進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)出現(xiàn)峰的橫坐標(biāo)的位置，并結(jié)合大豆和黃瓜的基因組大小，通過(guò)公式計(jì)算，判斷待測(cè)樣柳屬各品種的基因組大小。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品杞柳和待測(cè)樣的圖中峰值的相對(duì)位置，確定待測(cè)柳屬的染色體倍性，用公式計(jì)算染色體倍性水平，待測(cè)柳屬倍性水平=標(biāo)準(zhǔn)品杞柳倍性水平(待測(cè)柳屬G1峰熒光均值/柳屬標(biāo)準(zhǔn)品G1峰熒光均值)。CellQuest軟件(美國(guó)BD公司)數(shù)據(jù)下載，ModFit軟件(Yerity Software House公司)處理圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體倍性鑒定

利用流式細(xì)胞儀測(cè)定杞柳DNA占染色體數(shù)量比例時(shí)，將出現(xiàn)最高峰G1設(shè)定在橫坐標(biāo)數(shù)值為45附近處，以杞柳DNA占染色體數(shù)量比例的熒光強(qiáng)度(橫坐標(biāo))為對(duì)照，計(jì)算二者倍性系數(shù)，進(jìn)而得到待測(cè)樣品的染色體倍性。杞柳在橫坐標(biāo)45.51處出現(xiàn)1個(gè)主峰(見(jiàn)圖1)。

二倍體柳屬品種：流式細(xì)胞儀測(cè)定，烏柳均在橫坐標(biāo)46處左右出現(xiàn)了主峰，烏柳的G1峰位置在橫坐標(biāo)45.26處，倍數(shù)關(guān)系為0.99，表明烏柳的倍性約為杞柳倍性的1倍，即烏柳為二倍體，染色體倍性測(cè)試出峰位置(見(jiàn)圖2)。

圖1 流式細(xì)胞儀測(cè)定的杞柳標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 流式細(xì)胞儀測(cè)定的烏柳染色體倍性

四倍體柳屬品種：流式細(xì)胞儀測(cè)定，圓頭柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳在橫坐標(biāo)90左右出現(xiàn)了主峰，與標(biāo)準(zhǔn)品二倍體杞柳出現(xiàn)主峰的位置(45.51)比較，做倍性分析。圓頭柳的G1峰位置在95.63，倍數(shù)關(guān)系為2.10；五蕊柳的G1峰位置在橫坐標(biāo)84.34處，倍數(shù)關(guān)系為1.85；三蕊柳的G1峰位置在橫坐標(biāo)89.15處，倍數(shù)關(guān)系為1.96；垂柳的G1峰位置在橫坐標(biāo)83.71處，倍數(shù)關(guān)系為1.84。說(shuō)明4種柳的倍性約為杞柳染色體倍性(二倍體)的2倍，即圓頭柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳均為四倍體，它們?cè)谌旧w倍性測(cè)試中出峰的位置見(jiàn)圖3。

2.2 柳屬基因組大小預(yù)測(cè)

以黃瓜(基因350 Mb)、大豆(基因1 150 Mb)為對(duì)照品，首先測(cè)試黃瓜細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，設(shè)置DNA占染色體數(shù)量比例定為橫坐標(biāo)50處左右，以此為對(duì)照，測(cè)定大豆的DNA占染色體數(shù)量比例。測(cè)定結(jié)果：黃瓜的G1峰位置在橫坐標(biāo)50.95處(如圖4A)，大豆的G1峰位置在橫坐標(biāo)170.23處(如圖4B)。

圖3 流式細(xì)胞儀測(cè)定的四倍體柳屬植物

圖4 流式細(xì)胞儀測(cè)定黃瓜、大豆DNA占染色體數(shù)量比例

圓頭柳基因組大?。簣A頭柳的G1峰位置在橫坐標(biāo)95.63處(見(jiàn)圖5A)。分別以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，圓頭柳基因組大小分別為656.93、646.03 Mb。此種方法獲得圓頭柳基因組大小范圍為646.03～656.93 Mb。對(duì)圓頭柳、黃瓜、大豆3者的混合樣進(jìn)行測(cè)定(見(jiàn)圖5B)。以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，圓頭柳基因組大小為659.57、628.22 Mb。結(jié)合以上2種方法，測(cè)得圓頭柳基因組大小范圍628.22～659.57 Mb。本研究預(yù)測(cè)，二倍體圓頭柳的基因組大小約為640 Mb。

烏柳基因組大?。簽趿腉1峰位置在橫坐標(biāo)45.26處(見(jiàn)圖6A)。分別以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，烏柳基因組大小分別為310.91、305.76 Mb；此種方法獲得烏柳基因組大小范圍為305.76～310.91 Mb。試驗(yàn)結(jié)果表明，烏柳基因組大小與黃瓜較近，因此，只用大豆與烏柳的混合樣品測(cè)試(見(jiàn)圖6B)。以大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，烏柳基因組大小為290.69 Mb。結(jié)合以上2種方法測(cè)得，烏柳基因組大小范圍290.69～310.91 Mb。本研究預(yù)測(cè)，二倍體烏柳的基因組大小約為300 Mb。

五蕊柳基因組大?。何迦锪腉1峰位置在橫坐標(biāo)84.34處(見(jiàn)圖7A)。分別以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，五蕊柳基因組大小分別為579.37、569.76 Mb；此方法獲得五蕊柳的基因組大小范圍為569.76～579.37 Mb。五蕊柳、黃瓜、大豆3者混合樣進(jìn)行測(cè)定(見(jiàn)圖7B)。以黃瓜和大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，五蕊柳基因組大小為612.54、571.18 Mb；結(jié)合以上2種方法測(cè)得，五蕊柳基因組大小范圍569.76～612.54 Mb。本研究預(yù)測(cè)，四倍體五蕊柳的基因組大小約為580 Mb。

圖5 流式細(xì)胞儀預(yù)測(cè)圓頭柳基因組大小

圖6 流式細(xì)胞儀預(yù)測(cè)烏柳基因組大小

圖7 流式細(xì)胞儀預(yù)測(cè)五蕊柳基因組大小

三蕊柳基因組大?。喝锪腉1峰位置在橫坐標(biāo)89.15處(見(jiàn)圖8A)。分別以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，三蕊柳基因組大小分別為612.41、602.25 Mb；三蕊柳的基因組大小范圍為602.25～612.41 Mb。三蕊柳、黃瓜、大豆3者混合樣(見(jiàn)圖8B)。以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，三蕊柳基因組大小為665.91、556.58 Mb。結(jié)合以上2種方法測(cè)得，三蕊柳基因組大小范圍556.58～665.91 Mb。本研究預(yù)測(cè)，四倍體三蕊柳的基因組大小約為610 Mb。

垂柳基因組大?。捍沽腉1峰位置在橫坐標(biāo)83.71處(見(jiàn)圖9A)。分別以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，垂柳基因組大小為575.04、565.51 Mb；此方法獲得垂柳基因組大小范圍為565.51～575.04 Mb。垂柳、黃瓜、大豆3者混合樣進(jìn)行測(cè)定(見(jiàn)圖9B)。以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，垂柳基因組大小為629.09、566.89 Mb。結(jié)合以上2種方法測(cè)得，垂柳基因組大小范圍565.51～629.09 Mb。四倍體垂柳的基因組大小約為580 Mb。

圖8 流式細(xì)胞儀預(yù)測(cè)三蕊柳基因組大小

圖9 流式細(xì)胞儀預(yù)測(cè)垂柳基因組大小

杞柳基因組大?。鸿搅腉1峰位置在橫坐標(biāo)45.51處(見(jiàn)圖10A)。以黃瓜、大豆為標(biāo)準(zhǔn)品，杞柳基因組大小為312.63、307.45 Mb；此方法獲得杞柳基因組大小范圍為307.45～312.63 Mb。用流式細(xì)胞儀對(duì)杞柳、大豆混合樣進(jìn)行測(cè)定，杞柳基因組大小為285.51 Mb。結(jié)合以上2種方法測(cè)得，杞柳基因組大小范圍為285.51～312.63 Mb。因此，二倍體杞柳的基因組大小約為300 Mb。

圖10 流式細(xì)胞儀預(yù)測(cè)杞柳基因組大小

3 結(jié)論與討論

柳屬植物種質(zhì)資源豐富，針對(duì)柳屬植物的物種鑒定也從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定逐步發(fā)展到依據(jù)葉片圖像數(shù)字化信息的識(shí)別[12]。柳屬植物具有作為我國(guó)重要的綠化及造林樹(shù)種被廣泛應(yīng)用，也具有極高的藥用價(jià)值[13]。柳屬植物具有生長(zhǎng)迅速、更新快的特點(diǎn)，可以吸收土壤中的污染物，進(jìn)而降低土壤污染[14-17]。柳屬的倍性研究，對(duì)柳屬全基因組測(cè)序有著重要意義。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)柳屬無(wú)性系的倍性進(jìn)行檢測(cè)，以已知二倍體杞柳為對(duì)照，測(cè)定6種柳屬植物無(wú)性系水培苗，依據(jù)與杞柳二倍體的倍數(shù)關(guān)系，確定待測(cè)樣品的倍性。對(duì)6種柳屬進(jìn)行總DNA占染色體數(shù)量比例的測(cè)試，標(biāo)準(zhǔn)品為黃瓜(基因350 Mb)[18]、大豆(基因1 150 Mb)[19]，采用2種方式進(jìn)行測(cè)定(單細(xì)胞液測(cè)量和混合細(xì)胞液測(cè)量)，獲得不同基因組大小的數(shù)值范圍。

烏柳為二倍體；圓頭柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳為四倍體；結(jié)合柳屬形態(tài)學(xué)，烏柳葉片面積最小，而四倍體的4種柳的葉片面積相對(duì)較大。推斷，隨著倍性的增加，柳屬植物葉片面積增大。該結(jié)論驗(yàn)證了“多倍體植物中的營(yíng)養(yǎng)體較大，表現(xiàn)如葉大株高”的說(shuō)法。研究結(jié)果顯示6種柳屬基因組大小，烏柳(290.69～310.91 Mb)預(yù)測(cè)值為300 Mb、圓頭柳(628.22～656.93 Mb)預(yù)測(cè)值為640 Mb、五蕊柳(569.76～612.54 Mb)預(yù)測(cè)值為580 Mb、三蕊柳(569.76～612.41 Mb)預(yù)測(cè)值為610 Mb、垂柳(565.51～629.09 Mb)預(yù)測(cè)值為580 Mb、杞柳(285.51～312.63 Mb)預(yù)測(cè)值為300 Mb。二倍體的烏柳、杞柳基因組大小數(shù)值最小，約為300 Mb；四倍體的圓頭柳基因組大小數(shù)值最大，約為640 Mb；因此6種柳屬基因組大小為285～640 Mb之間。除了烏柳、杞柳以外，均在目前已知柳屬植物基因組大小的342～841 Mb之間。