陳慧穎，李慧星，許 彬，曹 斌，王春艷,3

1. 西北民族大學生命科學與工程學院， 甘肅 蘭州 730030；2. 南陽理工學院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；3. 南陽理工學院生物與化學工程學院， 河南 南陽 473004

白酒是世界六大蒸餾酒之一[1]。白酒品質受到釀造微生物菌群的顯著影響[2]，其中酒醅微生物菌群來自于酒曲、窖泥以及生產環(huán)境，還受到工藝條件和參數等多因素的影響，菌群多樣性和變化規(guī)律更加復雜[3]。酒醅中有大量的酵母、霉菌等真菌微生物，它們對大分子物質降解有重要作用，代謝產物是酒體風味與口感形成的重要物質基礎[4-8]。

高通量測序技術具有高通量、高分辨率的優(yōu)勢，為準確揭示微生物菌群的多樣性提供了強有力的手段[9,10]。Miseq是Illumina開發(fā)的第二代高通量測序技術，具有成本低、準確率高、操作簡便的優(yōu)點[11-13]，已被成功應用于不同香型白酒酒醅的微生物真菌菌群分析[14-20]。劉凡[14]等研究表明洋河濃香型酒醅發(fā)酵過程中真菌屬水平共鑒定出134 個屬，其中嗜熱真菌屬Thermomyces、熱子囊菌屬Thermoascus和根毛霉屬Rhizomucor在窖內發(fā)酵整個階段均為優(yōu)勢菌屬。與主要有機酸合成相關的真菌有酵母屬Saccharomyces、Naumovozyma、伊薩酵母屬Issatchenkia和根霉屬Rhizopus。胡曉龍[15]等以賈湖濃香型酒醅為研究對象，高通量測序技術檢測到厚壁菌門Firmicutes是菌群優(yōu)勢菌門。賈麗艷[16]等通過高通量測序技術研究了清香型白酒大楂和二楂發(fā)酵過程中的真菌菌群，發(fā)現子囊菌綱的腹膜孢酵母屬、酵母屬、假絲酵母屬、有孢漢遜酵母屬和有孢圓酵母屬為優(yōu)勢菌群。衛(wèi)春會[17]等通過高通量測序表明汾酒酒醅大楂、二楂的發(fā)酵初始真菌群落相似，主要的優(yōu)勢菌都是畢赤酵母Pichia，發(fā)酵后期優(yōu)勢菌有較大差異，大楂酒醅最主要的優(yōu)勢菌為釀酒酵母Saccharomyces，二楂酒醅最主要優(yōu)勢菌為假絲酵母Candida。陳雪[18]等利用高通量測序技術分析鳳香型白酒酒醅，發(fā)酵過程中共檢測出33個真菌屬，以Naumovozyma、根霉屬Rhizopus、熱子囊菌屬Thermoascus、曲霉屬Aspergillus、假絲酵母屬Candida為主，其中Naumovozyma占絕對優(yōu)勢。郝飛[19]等采用高通量測序法分析得到醬香型白酒酒醅中優(yōu)勢酵母菌屬有畢赤酵母屬Pichia、拜耳接合酵母屬Zygosaccharomyces、釀酒酵母屬Saccharomyces和假絲酵母屬Candida。

不同香型白酒酒醅的微生物菌群有差異性，相同香型不同來源的白酒酒醅的多樣性和演替規(guī)律也有明顯差異。然而，當前研究多集中于某個酒廠酒醅發(fā)酵過程的微生物菌群演替規(guī)律[21-24]、空間異質[5,15]、菌群與風味物質的關聯[25,26]，而對酒醅微生物菌群的共性變化規(guī)律研究較少。濃香型白酒是白酒的最重要香型之一，產銷量約占白酒總量的70%[27,28]。實驗取樣于河南三個不同濃香型白酒廠的酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)，采用的Illumina MiSeq高通量測序技術分別研究入窖酒醅和出窖酒醅的真菌微生物菌群，依次在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)和屬(genus)5個水平上進行分析，一方面展示河南濃香型白酒入窖酒醅和出窖酒醅的真菌微生物多樣性；另一方面，分析三個不同酒廠的酒醅發(fā)酵后真菌菌群的共性變化規(guī)律，為探究酒醅發(fā)酵的功能微生物，改造酒醅微生物菌群提高白酒品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

濃香型酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)樣品分別取自于河南南陽社旗、濮陽南樂和周口鹿邑的三個白酒廠，入窖酒醅分別命名為EFG-1，EFG-2，EFG-3，出窖酒醅分別命名為OFG-1，OFG-2，OFG-3，樣品采集后密封、保存于4℃。E.Z.N.A.Soil DNA Kit，Qubit2.0 DNA檢測試劑盒，Taq DNA Polymerase，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。

入窖酒醅和出窖酒醅的理化指標見表1。

表1 入窖酒醅和出窖酒醅的理化指標

1.2 實驗方法

實驗方法和數據分析參考文獻[13]。PCR擴增真菌的ITS序列，采用Miseq測序平臺的通用引物，ITS1引物：5′CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode) CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′，ITS2-Rev引物：5′GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGA-GAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC3′。

2 結果與分析

2.1 測序序列數目和多樣性指數分析

濃香型酒醅樣品經高通量測序和質量控制后，獲得有效序列。根據差異水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚類得到操作分類單元(OTU)。由表2可以看出：樣品測序的覆蓋率均大于98%，表明測序結果代表樣品的真實情況。三個入窖酒醅樣品(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的有效序列數量分別是38933、52416和62533，聚類得到OTU數目分別為1173、910和609；三個出窖酒醅樣品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的有效序列數量分別是53699、54776和23816，聚類得到OTU數目分別為1517、1583和1010。在序列聚類獲得OTU的基礎上，分別采用Shannon指數和Chao1指數描述菌群物種的多樣性，其中Shannon指數和Chao1指數越大，說明群落多樣性越高。EFG-1、EFG-2和EFG-3的Shannon指數和Chao1指數分別低于OFG-1、OFG-2和OFG-3的Shannon指數和Chao1指數，說明入窖酒醅的真菌菌群多樣性低于出窖酒醅的真菌菌群多樣性。濃香型酒醅經過發(fā)酵后真菌菌群發(fā)生變化，物種多樣性提高。這是由于入窖酒醅的微生物主要來自生產環(huán)境和酒曲，而出窖酒醅的微生物來源是生產環(huán)境、酒曲和窖泥。

表2 OTU數量及多樣性指數

實驗依次在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)和屬(genus)5個分類水平上進行分析，通過酒醅樣品的真菌菌群分布和變化趨勢來闡釋酒醅中真菌菌群的多樣性和共變性。為了使真菌菌群分布的顯示效果較好，實驗選取相對豐度較大的前15個物種(不足15個的則選取所有物種)，將相對豐度較低的部分合并為Other顯示在圖上。真菌菌群變化趨勢是在真菌菌群分布的基礎上，將三個入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和三個出窖酒醅樣品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)分別進行比較，分析出三個不同來源濃香型酒醅發(fā)酵后具有相同和顯著變化趨勢的真菌物種。

圖1 在門水平上濃香型酒醅的真菌菌群

2.2 在門(Phylum)水平上濃香型酒醅的真菌菌群

圖1為在門(Phylum)水平上濃香型酒醅的真菌菌群，可以看出：三個入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的優(yōu)勢菌群均是子囊菌門Ascomycota，它的相對豐度為80%～90%。除子囊菌門Ascomycota以外，酒醅中還有一定量的未分類真菌、接合菌門Zygomycota和擔子菌門Basidiomycota。分別比較入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，可知出窖酒醅中擔子菌門Basidiomycota的相對豐度均高于入窖酒醅中擔子菌門Basidiomycota的相對豐度(圖2)，濃香型酒醅發(fā)酵后擔子菌門Basidiomycota的相對豐度增加。

圖2 濃香型酒醅中擔子菌門的變化趨勢

2.3 在綱(Class)水平上濃香型酒醅的真菌菌群

在綱(Class)水平上濃香型酒醅的真菌菌群如圖3所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的優(yōu)勢菌群有酵母綱Saccharomycetes和散囊菌綱Eurotiomycetes，它們的相對豐度分別是31%～65%和14%～44%。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的優(yōu)勢菌群是糞殼菌綱Sordariomycete(相對豐度30%～55%)，還有一定量的座囊菌綱Dothideomycetes(相對豐度3%～5%)、錘舌菌綱Leotiomycetes(相對豐度8%～15%)、銀耳綱Tremellomycetes，(相對豐度2%～5%)、酵母綱Saccharomycetes(相對豐度2%～32%)和散囊菌綱Eurotiomycetes(相對豐度3%～16%)。

分別比較入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，圖4顯示了在綱水平上濃香型酒醅中真菌的變化趨勢。酒醅發(fā)酵后，糞殼菌綱Sordariomycete、錘舌菌綱Leotiomycetes、座囊菌綱Dothideomycetes和銀耳綱Tremellomycetes的相對豐度均有增加，其中糞殼菌綱Sordariomycete和錘舌菌綱Leotiomycetes的相對豐度增加幅度較大。酵母綱Saccharomycetes和散囊菌綱Eurotiomycetes的相對豐度明顯降低。

圖3 在綱水平上濃香型酒醅的真菌菌群

2.4 在目(Order)水平上分析濃香型酒醅的真菌菌群

在目(Order)水平上濃香型酒醅的真菌菌群如圖5所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的優(yōu)勢菌群有酵母目Saccharomycetales和散囊菌目Eurotiales，它們的相對豐度分別是31%～65%和13%～34%。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的優(yōu)勢菌群是肉座菌目Hypocreales，相對豐度18%～34%；還有一定量的銀耳目Tremellales(相對豐度2%～4%)、格孢腔菌目Pleosporales(相對豐度2.7%～4%)、酵母目Saccharomycetales(相對豐度2%～32%)和散囊菌目Eurotiales(相對豐度3%～16%)。此外，還有大量未分類和未定地位的真菌，如unclassified-Leotiomycetes等。

分別比較入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，圖6顯示了在目水平上濃香型酒醅的真菌變化趨勢，酒醅發(fā)酵后肉座菌目(Hypocreales)、格孢腔菌目(Pleosporales)和銀耳目(Tremellales)的相對豐度均有增加，而酵母目(Saccharomycetales)和散囊菌目(Eurotiales)的相對豐度均有降低。

圖5 在目水平上濃香型酒醅的真菌菌群

2.5 在科(Family)水平上分析濃香型酒醅的真菌菌群

在科(Family)水平上濃香型酒醅的真菌菌群如圖7所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2)的優(yōu)勢菌有發(fā)菌科Trichocomaceae(相對豐度24%～34%)和Pichiaceae科(相對豐度28%～56%)，入窖酒醅EFG-3的優(yōu)勢菌是發(fā)菌科Trichocomaceae(相對豐度12.6%)和復膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae(相對豐度58.8%)。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的優(yōu)勢菌群是Plectosphaerellaceae科(相對豐度10%～20%)和叢赤殼科Nectriaceae(相對豐度18%～33%)。還有一定量的孢腔菌科Pleosporaceae(相對豐度2.5%～4%)、發(fā)菌科Trichocomaceae(相對豐度2.5%～16%)和Pichiaceae科(相對豐度1%～16%)等。此外，還有大量未分類的真菌，如Unclassified-Tremellales等。

分別比較入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，圖8顯示了在科水平上濃香型酒醅中真菌的變化趨勢，可以看出酒醅發(fā)酵后叢赤殼科Nectriaceae、Plectosphaerellaceae科和孢腔菌科Pleosporaceae的相對豐度均有增加，發(fā)菌科Trichocomaceae的相對豐度降低。OFG-1和OFG-2相比較于EFG-1和EFG-2，Pichiaceae科的相對豐度降低，而復膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae的相對豐度變化不明顯；OFG-3相比較于EFG-3，復膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae的相對豐度降低，而Pichiaceae科的相對豐度變化不明顯。

圖7 在科水平上濃香型酒醅的真菌菌群

圖8 在科水平上濃香型酒醅中真菌變化趨勢

2.6 在屬(Genus)水平上分析濃香型酒醅的真菌菌群

在屬(Genus)水平上濃香型酒醅的真菌菌群如圖9所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2)的優(yōu)勢菌是伊薩酵母屬Issatchenkia(相對豐度27%～57%)，一定量的復膜孢酵母屬Saccharomycopsis(相對豐度1.8%～3.6%)和大量的未分類真菌。入窖酒醅EFG-3的優(yōu)勢菌是復膜孢酵母屬Saccharomycopsis(相對豐度58.8%)。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的優(yōu)勢菌群是鐮刀菌屬Fusarium(相對豐度17%～32%)和Plectosphaerella屬(相對豐度10%～19%)。還有一定量的鏈格孢屬Alternaria(相對豐度2.5%～3.7%)和大量的未分類真菌。

分別比較入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，圖10顯示了在屬水平上濃香型酒醅中真菌的變化趨勢，酒醅發(fā)酵后鐮刀菌屬Fusarium、Plectosphaerel-la屬和鏈格孢屬Alternaria的相對豐度均有增加。OFG-1和OFG-2相比較于EFG-1和EFG-2，伊薩酵母屬Issatchenkia的相對豐度降低，而復膜孢酵母屬Saccharomycopsis的相對豐度變化不明顯；OFG-3相比較于EFG-3，復膜孢酵母屬Saccharomycopsis的相對豐度降低，而伊薩酵母屬Issatchenkia的相對豐度變化不明顯。

圖9 在屬水平上濃香型酒醅的真菌菌群

圖10 在屬水平上濃香型酒醅中真菌變化趨勢

3 結論

基于Illumina MiSeq高通量測序展示了河南濃香型酒醅的真菌微生物多樣性，出窖酒醅的真菌微生物多樣性高于入窖酒醅的真菌微生物多樣性，出窖酒醅中真菌微生物有子囊菌門Ascomycota、糞殼菌綱Sordariomycete、肉座菌目Hypocreales、叢赤殼科Nectriaceae、鐮刀菌屬Fusarium；子囊菌門Ascomycota、糞殼菌綱Sordariomycete、Plectosphaerellaceae科、Plectosphaerella屬；子囊菌門Ascomycota、座囊菌綱Dothideomycetes、格孢腔菌目Pleosporales、孢腔菌科Pleosporaceae、鏈格孢屬Alternaria等。入窖酒醅中真菌微生物有子囊菌門Ascomycota、酵母綱Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale、Plectosphaerellaceae科、伊薩酵母屬Issatchenkia；子囊菌門Ascomycota、酵母綱Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale，復膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae，復膜孢酵母屬Saccharomycopsis；子囊菌門Ascomycota、散囊菌綱Eurotiomycetes、散囊菌目Eurotiales、發(fā)菌科Trichocomaceae等。

在濃香型酒醅真菌微生物多樣性的研究基礎上，分別比較三個不同酒廠的酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)的真菌微生物菌群，探究酒醅發(fā)酵后的菌群共性變化規(guī)律，結果如圖11所示。濃香型酒醅發(fā)酵后子囊菌門Ascomycota的相對豐度穩(wěn)定，擔子菌門Basidiomycota的相對豐度增加。子囊菌門Ascomycota的相對豐度穩(wěn)定，是由于子囊菌門Ascomycota中糞殼菌綱Sordariomycete、肉座菌目Hypocreales、叢赤殼科Nectriaceae、鐮刀菌屬Fusarium的相對豐度增加；座囊菌綱Dothideomycetes、格孢腔菌目Pleosporales、孢腔菌科Pleosporaceae，鏈格孢屬Alternaria的相對豐度增加；錘舌菌綱Leotiomycetes的相對豐度增加。另一方面，酵母綱Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale，Plectosphaerellaceae科，伊薩酵母屬Issatchenkia的相對豐度降低，或酵母綱Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale，復膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae，復膜孢酵母屬Saccharomycop-

圖11 濃香型酒醅發(fā)酵后真菌菌群的變化規(guī)律

sis的相對豐度降低；散囊菌綱Eurotiomycetes、散囊菌目Eurotiales、發(fā)菌科Trichocomaceae的相對豐度降低。擔子菌門Basidiomycota的相對豐度增加主要是銀耳綱Tremellomycetes，銀耳目Tremellales的相對豐度增加。然而，酒醅的真菌微生物菌群在門、綱、目、科、屬5個分類水平上逐次分析，真菌物種變化規(guī)律無法完全可循，如錘舌菌綱Leotiomycetes、銀耳目Tremellales、發(fā)菌科Trichocomaceae的變化，這是由于分類水平越高，種類越多，相對豐度較低的物種變化趨勢不明顯；另一方面，隨著分類水平的提高，樣品中出現了大量未分類和未定地位的真菌。