王越欣 苗雨露 王梅 李寧 武英茹 張文智 馮敏 倪艷

摘 要 目的：建立青翹和老翹藥材的指紋圖譜并比較，同時進(jìn)行聚類分析和主成分分析。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），檢測波長為235 nm，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。以連翹苷為參照，繪制8批青翹（Q1～Q8）和6批老翹（L1～L6）藥材的HPLC指紋圖譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評價，確定共有峰;采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：青翹和老翹藥材共有19個共有峰，指認(rèn)了其中6個，分別為連翹酯苷A、蘆丁、松脂素-β-D-葡萄糖苷、連翹苷、槲皮素、連翹脂素;青翹與老翹藥材的相似度為0.351～0.767。聚類分析結(jié)果顯示，青翹和老翹藥材樣品可聚為4類，其中L1～L6聚為一類、Q1聚為一類、Q2～Q6聚為一類、Q7～Q8聚為一類。主成分分析結(jié)果顯示，前3個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為83.14%，L1～L6分布較近，Q2～Q6分布較近，Q7～Q8分布較近，Q1分布較為獨立，與聚類分析結(jié)果一致。結(jié)論：青翹和老翹的指紋圖譜共有峰經(jīng)相似度評價、聚類分析及主成分分析均有明顯差異，所建HPLC指紋圖譜可用于綜合評價和比較青翹和老翹藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 青翹;老翹;高效液相色譜法;指紋圖譜;相似度分析;聚類分析;主成分分析

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）06-0663-06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish and compare HPLC fingerprints of green Forsythia suspensa and grown F. suspensa， and to conduct cluster analysis and principle component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Hypersil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid （gradient elution）. The detection wavelength was 235 nm and column temperature was 25 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min. The sample size was 10 μL. HPLC fingerprints of 8 batches of green F. suspensa （Q1-Q8） and 6 batches of grown F. suspensa （L1-L6） were drawn， with phillyrin as reference; the similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）， and common peak was confirmed. Cluster analysis and principal component analysis were carried out with SPSS 23.0 software. RESULTS： There were 19 common peaks for green F. suspensa and grown F. suspensa， among which 6 peaks were identified， i.e. forsythoside A， rutin， pinoresinol-β-D-glucoside， phillyrin， quercetin and phillygenin; the similarities of HPLC fingerprints from green F. suspensa and grown F. suspensa were 0.351-0.767; results of cluster analysis showed that green F. suspensa and grown F. suspensa were classified into 4 categories， among which L1-L6 were clustered into one category， Q1 was clustered into one category， Q2-Q6 were clustered into one category; Q7-Q8 were clustered into one category. The results of principal component analysis showed that the cumulative variance contribution rate of the first three principal components was 83.14%， L1-L6 distribution was close， Q2-Q6 distribution was close， Q7-Q8 distribution was close， and Q1 distribution was independent， which was consistent with the results of cluster analysis. CONCLUSIONS： There were significant differences in the common peaks of fingerprint of green F. suspensa and grown F. suspensa of similarity eraluation， cluster analysis and principle component analysis， the established HPLC fingerprint can be used for comprehensive evaluation and quality comparison of green F. suspensa and grown F. suspensa.

KEYWORDS? ?Green Forsythia suspensa; Grown Forsythia suspensa; HPLC; Fingerprint; Similarity analysis; Cluster ana- lysis; Principal component analysis

連翹為木犀科連翹屬植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl.的干燥果實，主產(chǎn)于我國山西、山東、河南、河北、陜西等地，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，連翹具有抗病毒、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，且已被廣泛用于肝炎、腦膜炎、呼吸道感染、急性腎炎等癥的臨床治療[2]。連翹含有多種化學(xué)成分，如苯乙醇苷類、木脂素類、三萜類、黃酮類、酚酸類等，因此僅以連翹苷和連翹酯苷A作為該藥材質(zhì)量評價的指標(biāo)具有一定的局限性[3]。

根據(jù)采收期的不同，連翹分為青翹和老翹，其中前者采收于果實初熟尚帶綠色時，后者則采收于果實熟透時[4]。有研究指出，青翹和老翹在很多方面存在差異，首先在化學(xué)成分方面，青翹中有多種成分的含量均明顯高于老翹，如黃酮類、木脂素類以及揮發(fā)油類成分[5-7]，而老翹中微量元素的含量高于青翹[8];其次在藥效方面，青翹與老翹均有抗炎、抗菌、抗腫瘤和抗氧化等作用，其中青翹的抗氧化、抗炎作用優(yōu)于老翹，而老翹的抗菌作用與青翹相當(dāng)，甚至優(yōu)于青翹[9-10]。2015年版《中國藥典》（一部）僅對青翹和老翹的雜質(zhì)、浸出物限度作了不同要求[1];而2020年版《中國藥典》（一部）雖然增加了連翹中揮發(fā)油的含量測定，但僅對青翹作了規(guī)定，成分方面也僅對連翹酯苷A的含量進(jìn)行了區(qū)分[11]。因此，進(jìn)一步區(qū)分青翹和老翹的差異對于制定完善的連翹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與臨床用藥規(guī)范具有重要的指導(dǎo)意義[12]。

近年來，因指紋圖譜技術(shù)在反映中藥材的物質(zhì)特征中具有穩(wěn)定性好和特征性強的優(yōu)勢，而被廣泛用于中藥材的質(zhì)量控制領(lǐng)域[13]。雖然，已有關(guān)于連翹高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的報道[14-15]，但這些研究主要是將不同產(chǎn)地、市售不同批次青翹藥材或青翹不同極性部位的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較[16-18]，或采用不同技術(shù)（如近紅外光譜技術(shù)）對連翹進(jìn)行鑒別[19-20];同時，目前尚未有將青翹和老翹藥材指紋圖譜進(jìn)行對比的研究?；诖耍狙芯拷⒘饲嗦N和老翹的HPLC指紋圖譜，并采用聚類分析和主成分分析對兩者質(zhì)量進(jìn)行評價，旨在為青翹與老翹的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有UltiMate 3000型HPLC儀（包括溶劑泵、自動進(jìn)樣器、柱箱、可變波長檢測器、ChromeleonTM 6.80色譜工作站，戴安中國有限公司）、FW-100型高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、LC-300B型數(shù)控超聲波清洗機（山東濟寧魯超超聲設(shè)備有限公司）、SE402F型電子分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

連翹苷對照品（批號110821-201112，純度96.8%）、連翹酯苷A對照品（批號111810-201606，純度93.4%）、蘆丁對照品（批號100080-201408，純度90.2%）、槲皮素對照品（批號100081-200907，純度97.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院，連翹脂素對照品（批號141107，純度98.0%）、松脂素-β-D-葡萄糖苷對照品（批號140325，純度98.0%）均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;乙腈、甲酸為色譜純，甲醇等其余試劑均為分析純，水為純化水。

8批青翹（編號Q1～Q8）和6批老翹（編號L1～L6）藥材經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院倪艷教授鑒定均為木犀科植物連翹F. suspensa（Thunb.）Vahl.的干燥果實。其中，青翹質(zhì)硬、多不開裂，表面呈綠褐色，突起的灰白色小斑點較少;種子多數(shù)呈黃綠色且細(xì)長，一側(cè)有翅。老翹質(zhì)脆自頂端開裂或裂成兩瓣，表面呈黃棕色或紅棕色，內(nèi)表面多為淺黃棕色，平滑，具一縱隔;種子呈棕色，多已脫落。8批青翹和6批老翹藥材樣品信息來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Hypersil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，10%A→20%A;20～50 min，20%A→40%A;50～55 min，40%A→65%A;55～65 min，65%A→90%A），檢測波長為235 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、槲皮素、連翹脂素、松脂素-β-D-葡萄糖苷對照品適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含連翹苷0.2 mg和連翹酯苷A、蘆丁、槲皮素、連翹脂素、松脂素-β-D-葡萄糖苷各0.1 mg的混合對照品溶液，搖勻，于4 ℃貯藏，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品粉末（過五號篩）約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取“2.3”項下供試品溶液（編號Q1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以連翹苷為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，19個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取“2.3”項下供試品溶液（編號Q1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以連翹苷為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，19個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性考察 取藥材樣品（編號Q1）適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以連翹苷為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，19個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 青翹和老翹HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜的建立 取8批青翹（編號Q1～Q8）和6批老翹（編號L1～L6）樣品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以連翹苷為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行分析，采用中位系數(shù)法對各色譜峰進(jìn)行多點校正并自動匹配生成對照譜圖（R）和HPLC疊加指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.5.2 共有峰的指認(rèn) 對青翹和老翹藥材樣品指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，共有19個共有峰。通過與混合對照品色譜圖（見圖3，取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣所得）比對，指認(rèn)出了其中6個共有峰，分別為連翹酯苷A（11號峰）、蘆?。?2號峰）、松脂素-β-D-葡萄糖苷（13號峰）、連翹苷（17號峰）、槲皮素（18號峰）和連翹脂素（19號峰）。因17號峰（連翹苷）的含量相對較高且分離度較好，故以其為參照峰。

2.5.3 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評價。結(jié)果，8批青翹藥材樣品的相似度分別為0.867、0.983、0.968、0.982、0.982、0.980、0.867、0.937，6批老翹藥材樣品的相似度分別為0.909、0.875、0.946、0.910、0.949、0.948;青翹與老翹藥材樣品的相似度為0.351～0.767，且青翹與老翹對照指紋圖譜的相似度為0.609，表明兩者成分存在明顯差異。8批青翹與6批老翹藥材樣品的相似度結(jié)果見表2。

2.6 聚類分析

將8批青翹和6批老翹藥材樣品的19個共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，采用組間連接法以歐氏平方距離為測度進(jìn)行聚類分析。結(jié)果，8批青翹和6批老翹可聚為4類，其中L1～L6聚為一類、Q1聚為一類、Q2～Q6聚為一類、Q7～Q8聚為一類，詳見圖4。

2.7 主成分分析

將8批青翹和6批老翹藥材樣品的19個共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，對經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的共有峰峰面積進(jìn)行主成分分析。結(jié)果，以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)[21]，得到前3個成分（即主成分）的累積方差貢獻(xiàn)率，為83.14%，表明這3個主成分可以代表青翹和老翹藥材樣品指紋圖譜中19個共有峰的大部分信息，詳見表3。

主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向[17]。采用SPSS 23.0軟件對8批青翹和6批老翹藥材樣品中的19個共有峰主成分進(jìn)行載荷矩陣分析。結(jié)果，共有峰3、7～8、13～17對主成分1貢獻(xiàn)較大，且與其成正相關(guān);共有峰5～6對主成分2貢獻(xiàn)較大，且與其成正相關(guān);共有峰19對主成分3貢獻(xiàn)最大，且與其成負(fù)相關(guān)，詳見表4。

采用SPSS 23.0軟件對上述主成分載荷值進(jìn)行分析，以各自主成分載荷向量除以各自主成分特征值的算術(shù)平方根得到主成分系數(shù)，各主成分的線性模型如下：Y1=-0.225X1-0.094X2+0.266X3+0.169X4-0.057X5-0.025X6+0.265X7+0.303X8+0.226X9-0.191X10+0.216X11+0.217X12+0.279X13+0.313X14+0.280X15+0.282X16+0.309X17-0.252X18-0.023X19;Y2=0.300X1+0.325X2-0.091X3+0.248X4+0.428X5+0.428X6+0.185X7+0.145X8-0.061X9+0.252X10-0.341X11-0.063X12-0.149X13+0.081X14-0.156X15+0.150X16+0.003X17+0.222X18+0.022X19;Y3=0.205X1-0.066X2+0.130X3+0.144X4-0.075X5+0.107X6+0.188X7-0.012X8+0.358X9+0.266X10+0.107X11+0.213X12+0.203X13+0.014X14-0.184X15-0.190X16-0.065X17-0.281X18-0.643X19。其中，Y1、Y2、Y3分別表示第1、2、3個主成分得分，X1～X19分別表示19個共有峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。將X1～X19數(shù)據(jù)代入上述線性模型后，得到各批樣品的主成分得分，結(jié)果見表5。

將表5中的數(shù)據(jù)錄入SPSS 23.0軟件，繪制主成分得分圖。結(jié)果，L1～L6分布較近，表明6批老翹藥材樣品的質(zhì)量較為接近;8批青翹中，Q2～Q6分布較近，Q7～Q8分布較近，表明對應(yīng)批次青翹藥材樣品質(zhì)量較為接近;而Q1分布較為獨立，表明其與其他藥材質(zhì)量相差甚遠(yuǎn)。上述結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，詳見圖5。

3 討論

由于采收連翹藥材的過程中“搶青”現(xiàn)象嚴(yán)重，加之老翹資源減少，使得青翹和老翹?；煊貌环諿22]。盡管2020年版《中國藥典》（一部）對青翹和老翹的質(zhì)量控制作出了不同規(guī)定，但兩者的功能與主治并未區(qū)分。經(jīng)成分學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，老翹有效成分的含量常低于青翹[23]，這對于青翹和老翹的質(zhì)量控制和臨床用藥都會造成不小的困擾。

本研究試驗前期對不同流動相體系（乙腈-0.1%冰醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液）進(jìn)行考察。結(jié)果，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，所得色譜峰的峰形較好，且峰數(shù)量較多，故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。

連翹質(zhì)量評價的有效辦法之一就是建立系統(tǒng)、全面、特征性強的指紋圖譜[24]。本研究所建指紋圖譜中，青翹和老翹藥材共有19個共有峰，但相似度較低，為0.351～0.767，其原因可能為各色譜峰保留時間基本一致，但峰面積相差較大，提示兩者成分可能存在差異。后期可擴大樣本量，采用分離、制備液相色譜結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振技術(shù)等對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

聚類分析結(jié)果顯示，青翹和老翹藥材樣品可聚為4類，其中L1～L6聚為一類、Q1聚為一類、Q2～Q6聚為一類、Q7～Q8聚為一類，可能與采收時間過長致樣品質(zhì)量發(fā)生變化，或采集時間、地理位置差異有關(guān)[25]。此外，Q1與其他批次樣品差異較大，由青翹指紋圖譜（圖2）推測，可能與Q1圖譜中多數(shù)色譜峰峰面積明顯大于其余7批青翹藥材有關(guān)。主成分分析結(jié)果顯示，前3個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為83.14%，即青翹和老翹全部化學(xué)成分信息的83.14%可由這3個主成分代表，其中第1主成分方差貢獻(xiàn)率最大（為49.29%），青翹和老翹藥材化學(xué)成分的相似性基本可以由其（第1主成分）包含的化學(xué)成分反映出來[26]。主成分得分圖顯示，L1～L6分布較近，Q2～Q6分布較近，Q7～Q8分布較近，而Q1分布較為獨立，該結(jié)果與聚類分析一致。

綜上所述，青翹和老翹的指紋圖譜共有峰經(jīng)相似度評價、聚類分析及主成分分析均有明顯差異，所建HPLC指紋圖譜可用于綜合評價青翹和老翹藥材的質(zhì)量，可為連翹藥材的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供數(shù)據(jù)參考。

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（收稿日期：2020-11-28 修回日期：2021-01-19）

（編輯：陳 宏）