楊俊寒， 段海瀟， 張紫怡， 王潤楊， 劉濱磊， 胡 翰， 汪 洋

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

結(jié)直腸癌作為消化道的惡性腫瘤之一，死亡率位居所有癌癥第4位[1]，在中老年人群中發(fā)病率極高，且每年發(fā)病率都有增加。遺憾的是，有1/5的結(jié)直腸癌患者在病情確診時都伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而該類患者5年生存率僅為12%。結(jié)直腸癌的治療方法主要分為三大類：首先是外科手術(shù)治療，即通過手術(shù)切除腫瘤，但是通過該方法進(jìn)行治療方法通常不夠徹底，無法根除腫瘤；其次是放療和化療，這種療法雖然可以有效針對腫瘤細(xì)胞，但是它們對機(jī)體正常細(xì)胞也會產(chǎn)生較大傷害；最后就是近年來受到研究者青睞的腫瘤免疫治療，其能重新啟動并維持患者自身免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷，誘導(dǎo)機(jī)體慢慢恢復(fù)其抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤免疫治療不僅效果好，而且避免了治療過程中對機(jī)體的二次損傷。但由于CT26細(xì)胞不帶任何標(biāo)記，在研究腫瘤細(xì)胞成瘤和病灶轉(zhuǎn)移的過程中無法對其進(jìn)行有效觀察及檢測。因此需要通過某些手段對其進(jìn)行標(biāo)記，且能通過儀器對標(biāo)記進(jìn)行捕捉和記錄。腫瘤免疫治療中常用的一項技術(shù)——生物發(fā)光分析法標(biāo)記生物，正好解決這一問題。

螢火蟲熒光素酶(Firefly luclferase，F(xiàn)luc)是生物發(fā)光中研究最為深入、透徹的發(fā)光系統(tǒng)。其發(fā)光機(jī)制是熒光素酶與底物在Mg2+的作用下反應(yīng)形成的腺昔酸熒光素酞化復(fù)合物， 能夠與酶結(jié)合且經(jīng)過氧化脫梭作用即轉(zhuǎn)化至激活狀態(tài)的氧化熒光素，最后發(fā)射光子[2]。 將表達(dá)Fluc的基因轉(zhuǎn)入到真核細(xì)胞中使其能穩(wěn)定表達(dá)， 且不影響細(xì)胞正常生長[3]。 由于其發(fā)射的光子可以被儀器捕捉記錄， 因此可將它作為一種標(biāo)記方法來檢測特定細(xì)胞所在位置及大體數(shù)量。 作為建立動物腫瘤模型是癌癥研究中一個最為重要的環(huán)節(jié)， BALB/c小鼠是常見的荷瘤鼠模型，在小鼠結(jié)直腸癌腫瘤模型建立方面是比較適合的。本研究通過在BALB/c小鼠右側(cè)背部皮下植入構(gòu)建成功的CT26-Fluc，觀察記錄所植入腫瘤細(xì)胞的繁殖變化情況，并在小動物活體成像設(shè)備中對荷瘤鼠的成瘤效果及相對熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量評估[4]。

1 實驗材料

實驗材料及來源見表1。

表1 實驗材料及來源

2 實驗方法

2.1 CT26細(xì)胞敏感性試驗

按照標(biāo)準(zhǔn)方案對需實驗的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DME/F-12。收集細(xì)胞，500 g離心5 min，用DME/F-12(無血清培養(yǎng)基)重懸并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。用完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+ DME/F-12)將細(xì)胞密度稀釋至2×105個/mL，然后接種于24孔板，置入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度37℃，CO2濃度5%。翌日觀察24孔板中細(xì)胞匯合度，待其匯合度達(dá)到90%左右，將不同濃度梯度的嘌呤霉素加入到24孔板中，此時記為第0天，此后每天同一時間在顯微鏡下對細(xì)胞生存情況進(jìn)行觀察記錄，以第四天觀察時細(xì)胞全部死亡所對應(yīng)的嘌呤霉素濃度為最低致死濃度[5]。

2.2 PBDP-Fluc質(zhì)粒構(gòu)建

Firefly luciferase cDNA的序列長1653 bp，通過CMV啟動子轉(zhuǎn)錄，用T2A連接PuroR和GFP基因，連接后的序列共用EF1α啟動子來啟動，最終得到PBDP-Flu質(zhì)粒。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗

按照標(biāo)準(zhǔn)方案對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DME/F-12。收集細(xì)胞，500 g離心5 min，用DME/F-12重懸并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+ DME/F-12)將細(xì)胞密度稀釋至2×105個/mL，然后接種于24孔板，置入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度37℃，CO2濃度5%。翌日觀察24孔板中細(xì)胞匯合度，待其匯合度達(dá)到70% ～ 90%時，將質(zhì)粒pSPBT和pPBDP-Fluc以質(zhì)量比1∶5混合加入至含MEM的管A中，隨后用MEM稀釋Lipofactamine 3000加至B管。A，B兩管溶液1∶1混合孵育且于室溫靜置10 min。將混合溶液均勻滴加至到鋪有細(xì)胞的24孔板中并置于在CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)2～4 d[6]。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞是否存在GFP。

2.4 CT26-Fluc細(xì)胞的單克隆獲取

收集經(jīng)嘌呤霉素篩選過后的CT26-Fluc細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)，再以10倍濃度梯度對細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋，以500個/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，置入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，當(dāng)整個孔中僅有一個細(xì)胞分裂而成的細(xì)胞團(tuán)，且轉(zhuǎn)染成功(發(fā)綠色熒光)時，對該孔進(jìn)行標(biāo)記，并將其消化擴(kuò)大培養(yǎng)[7]。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測CT26-Fluc細(xì)胞純度

將CT26原始細(xì)胞作為對照組細(xì)胞，收集擴(kuò)增后的CT26-Fluc單克隆細(xì)胞[8]，用BD C6 流式細(xì)胞儀 (BD Biosciences)檢測CT26-Fluc中GFP的表達(dá)率并分析結(jié)果。

2.6 oHSV2-GFP[9]體外殺傷CT26-Fluc

按照標(biāo)準(zhǔn)方案對需實驗的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DME/F-12。收集細(xì)胞，500 g離心5 min，重懸至DME/F-12并鋪板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80% ～ 90%時，按照病毒濃度1×105、0.5×105、0.25×105、0.125×105/孔接種毒株，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h后，加入熒光素酶底物10 μL(15 mg/mL)，孵育5 min后放入多功能酶標(biāo)儀中檢測熒光素表達(dá)量。

2.7 CT26-Fluc細(xì)胞成瘤性評估

于BALB/c小鼠右側(cè)肋腹皮下注射100 μL含有1×106個CT26-Fluc的細(xì)胞懸液[10]，待腫瘤體積至100 mm3，記錄觀察腫瘤大小，用動物活體成像系統(tǒng)對其進(jìn)行麻醉拍攝。

3 實驗結(jié)果

3.1 PBDP-Fluc質(zhì)粒構(gòu)建

PBDP-Fluc質(zhì)粒構(gòu)建見圖1。

圖 1 PBDP-Flu質(zhì)粒

3.2 CT26細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及CT26-Fluc單克隆細(xì)胞的挑取、擴(kuò)培

PBDP-Fluc和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CT26細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功即可見發(fā)綠色熒光的CT26-Fluc。圖2放大倍數(shù)為40，圖3放大倍數(shù)為100。

圖 2 PBDP-Fluc-GFP轉(zhuǎn)染CT26

圖 3 CT26-Fluc單克隆細(xì)胞擴(kuò)培

3.3 流式細(xì)胞儀檢測CT26-Fluc單克隆細(xì)胞

流式細(xì)胞儀檢測對照組(CT26)和實驗組(CT26-Fluc)GFP的表達(dá)(圖4)，結(jié)果顯示實驗組GFP(GFP所在通道即為FL1-H)表達(dá)率達(dá)到99.8%，表明CT26-Fluc細(xì)胞系是單克隆細(xì)胞系。

(a)CT26

3.4 多功能酶標(biāo)儀檢測oHSV2-GFP體外殺傷CT26-Fluc

接種毒株后30 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測CT26-Fluc的熒光素表達(dá)(圖5)。結(jié)果顯示，病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)越高，亦即病毒滴度越高時，檢測到的熒光素酶熒光強(qiáng)度表達(dá)量越低，說明活細(xì)胞數(shù)越少。而未加病毒的mock組熒光素酶熒光強(qiáng)度表達(dá)量最高，Negative組(陰性對照，僅為CT26原始細(xì)胞系)檢測不到熒光素信號。

圖 5 酶標(biāo)儀檢測病毒殺傷CT26-Fluc細(xì)胞熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度表達(dá)

3.5 CT26-Fluc BALB/c模型建立

為了證明CT26-Fluc細(xì)胞系能夠在BALB/c小鼠體內(nèi)表達(dá)Firefly luciferase,在小鼠右側(cè)背部植入CT26-Fluc(圖6)。第5天時,用小動物活體成像系統(tǒng)觀察到植瘤部位有明顯的CT26-Fluc腫瘤生長。

圖 6 動物活體成像拍攝CT26-Fluc

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irefly luciferase的表達(dá)不影響CT26-Fluc細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖等細(xì)胞學(xué)特征，因此可以以此為基礎(chǔ)建立新的體外殺傷腫瘤細(xì)胞檢測方法，即通過向孔板內(nèi)加入熒光素酶底物，檢測板孔內(nèi)的熒光素信號并與空白對照進(jìn)行對比，從而反映所研究物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。與傳統(tǒng)方法相比，該方法更便捷也更準(zhǔn)確客觀。同時，為了驗證CT26-Fluc細(xì)胞是否可用于建立小鼠結(jié)直腸癌成瘤模型，以及Fluc基因是否可在荷瘤鼠模型中穩(wěn)定表達(dá)，又將CT26-Fluc細(xì)胞對BALB/c小鼠進(jìn)行右側(cè)背部皮下植瘤，飼養(yǎng)期間注射部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)，隨后對其成瘤情況進(jìn)行了活體成像拍攝。結(jié)果表明，在結(jié)節(jié)形成部位有明確的熒光顯示，說明CT26-Fluc細(xì)胞不僅可以用于建立小鼠結(jié)直腸癌成瘤模型，而且Firefly luciferase基因能夠在成瘤部位表達(dá)。以該方法標(biāo)記替代傳統(tǒng)的游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，減少了各種誤差，具有更明顯的客觀性。同時也降低了傳統(tǒng)測量方法給實驗人員帶來的安全隱患，在腫瘤細(xì)胞在活體動物體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移方面，也提供了更為直觀、快捷的方法。