陳建波， 楊 勇， 李慧源， 任嬋君， 杜 娟， 李根石， 陶 然， 陳敬賢， 張 玲， 李 淼

（1.武漢金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430100；2.甘肅金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)暨病理診斷所，甘肅 蘭州 730070；3.長沙金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，湖南 長沙 410006；4.廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東 廣州 510005；5.國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心病毒診斷研究中心，廣東 廣州 510005）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）核酸檢測是診斷新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的重要檢測指標(biāo)之一[1]。SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果對(duì)疑似患者的篩查及鑒別診斷、確診患者治療后的出院評(píng)估等有重要作用。但是，有研究結(jié)果顯示，SARS-CoV-2核酸檢測的陽性率不到60%[2]，這與SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒的性能差異有關(guān)，由此導(dǎo)致的檢驗(yàn)結(jié)果差異無疑會(huì)直接影響臨床診療，若發(fā)生漏檢，更會(huì)造成較為嚴(yán)重的后果。疫情初期，我國國家藥品監(jiān)督管理局（the National Medical Products Administration，NMPA）緊急批準(zhǔn)的試劑盒的性能評(píng)估還需要更多的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)支撐。由于疫情分布差異，部分地區(qū)臨床實(shí)驗(yàn)室缺乏足夠的陽性標(biāo)本，在驗(yàn)證和評(píng)估試劑盒性能時(shí)相對(duì)困難。本研究所用標(biāo)本來自湖北省內(nèi)各級(jí)疾病預(yù)防控制中心、武漢雷神山醫(yī)院以及武漢2家方艙醫(yī)院等，部分批次標(biāo)本陽性結(jié)果相對(duì)較高。因此，本研究對(duì)收集的咽拭子標(biāo)本同時(shí)用4種SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測，以觀察和比較4種試劑盒檢測結(jié)果的一致性，為臨床試劑盒選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集湖北省內(nèi)各級(jí)疾病預(yù)防控制中心、武漢雷神山醫(yī)院、武漢國博方艙醫(yī)院、武漢客廳方艙醫(yī)院等單位送檢的咽拭子標(biāo)本，將檢測中發(fā)現(xiàn)的N基因陽性或疑似陽性和/或ORF1ab基因陽性或疑似陽性標(biāo)本作為比對(duì)實(shí)驗(yàn)陽性標(biāo)本。另隨機(jī)選取核酸檢測陰性的咽拭子標(biāo)本作為比對(duì)實(shí)驗(yàn)陰性標(biāo)本，盡可能使初步篩選出的陰性和陽性標(biāo)本占同等比例。共收集了318例標(biāo)本用于比對(duì)實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器和試劑

所有的標(biāo)本均采用DP-1000自動(dòng)化核酸提取儀及配套試劑（上?？迫A公司）進(jìn)行核酸提取。SARS-CoV-2核酸均采用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測，4種試劑盒分別購自湖南圣湘生物科技有限公司（批號(hào)：2020012）、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司（批號(hào)：2020020）、江蘇碩世生物科技股份有限公司（批號(hào)：20200205）、蘇州天隆生物科技有限公司（批號(hào)：P732200119）?；驍U(kuò)增采用Applied Biosystems 7500型定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）。將4種試劑盒隨機(jī)編號(hào)為試劑盒A、試劑盒B、試劑盒C、試劑盒D。

1.3 方法

所有咽拭子標(biāo)本先在干浴箱中進(jìn)行65 ℃、30 min滅活，靜置10 min至室溫（避免氣溶膠），然后按照核酸提取試劑說明書進(jìn)行操作。標(biāo)本經(jīng)裂解液裂解后，加入磁珠與核酸結(jié)合，并利用磁性分離器將結(jié)合了核酸的磁珠與液體分離，通過洗滌、洗脫后得到純化的核酸，分別根據(jù)各個(gè)試劑盒說明書要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。4種試劑盒說明書標(biāo)注的最低檢測限分別為200拷貝/mL（湖南圣湘生物科技有限公司）、500拷貝/mL（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）、500拷貝/mL（蘇州天隆生物科技有限公司）、1 000拷貝/mL（江蘇碩世生物科技股份有限公司）。按照各試劑盒的說明書要求進(jìn)行結(jié)果判定。蘇州天隆生物科技有限公司試劑盒說明中對(duì)單陽結(jié)果（僅N基因或ORF1ab基因陽性）判讀為可疑，需要用其他方法，如測序法進(jìn)行鑒定。本研究對(duì)所有方法檢測的N或ORF1ab其中1個(gè)基因陽性（單陽）或N和ORF1ab2個(gè)基因均陽性（雙陽）結(jié)果均判讀為陽性。

1.4 質(zhì)量控制

每批檢測均設(shè)立1個(gè)弱陽性質(zhì)控和3個(gè)陰性質(zhì)控（0.9%氯化鈉溶液），其中3份陰性質(zhì)控隨機(jī)置于臨床標(biāo)本中。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系中設(shè)置有內(nèi)標(biāo)，用以判斷本次實(shí)驗(yàn)是否有效。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kappa一致性分析評(píng)價(jià)不同試劑盒檢測結(jié)果。采用χ2檢驗(yàn)評(píng)估試劑盒檢測陽性率及診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒檢測結(jié)果比較

將4種試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，并進(jìn)行Kappa一致性分析，相應(yīng)的Kappa值分別為：0.741（試劑盒A與B比較）、0.653（試劑盒A與C比較）、0.510（試劑盒A與D比較）、0.669（試劑盒B與C比較）、0.633（試劑盒B與D比較）、0.565（試劑盒C與D比較）（P＜0.01）。試劑盒A和試劑盒B的結(jié)果一致性最高。見表1。

表1 4種SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒檢測結(jié)果比較 例

2.2 N基因和ORF1ab基因陽性率結(jié)果比較

試劑盒A、B、C和D SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒的N基因和ORF1ab基因檢測的陽性率分別為39.94%、30.5%、31.45%和18.55%。通過χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了試劑盒B和試劑盒C的陽性率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.797）外，其他試劑盒間陽性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 N基因和ORF1ab基因陽性率比較 例（%）

2.3 診斷效能評(píng)價(jià)

由于沒能通過其他方法（測序、臨床綜合診斷等）對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行最終確認(rèn)，本研究通過結(jié)果趨同的方法相對(duì)確定最終的參考標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。若3個(gè)及以上品牌試劑盒陰性或陽性檢測結(jié)果一致，則判定為參考標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。按此規(guī)則，有292例標(biāo)本可直接產(chǎn)生參考標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。余下的26例標(biāo)本檢測結(jié)果中，由于試劑盒D結(jié)果均為陰性（陽性率顯著低于其他3種試劑盒），則以試劑盒A、B和C中的2種的一致性結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果（2種試劑盒結(jié)果陽性則判斷為陽性、2種試劑盒結(jié)果陰性則判斷為陰性）。χ2統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，試劑盒D與其他3種試劑盒的總符合率的差異均有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），試劑盒B與試劑盒C的總符合率差異也有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4種試劑盒診斷效能評(píng)價(jià) %

3 討論

試劑盒檢測性能的差異是造成SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果差異的重要因素[3-5]。4種SARSCoV-2核酸檢測試劑盒陽性和陰性結(jié)果相互比較后可知，試劑盒A和試劑盒B的結(jié)果一致性最高，試劑盒D與其他3種試劑盒的結(jié)果一致性相對(duì)較差。不同品牌試劑盒檢測結(jié)果不一致的原因主要為引物設(shè)計(jì)、試劑盒檢測的靈敏度、抗干擾能力的差異等[6]。本研究采用的不是SARSCoV-2核酸檢測試劑盒生產(chǎn)者指定或配套的核酸提取方法與試劑，有可能對(duì)試劑盒的PCR反應(yīng)體系產(chǎn)生干擾。但另一方面也確實(shí)表明，部分品牌試劑盒質(zhì)量存在明顯差異，需要相應(yīng)試劑盒品牌不斷探討和分析原因，改進(jìn)試劑盒檢測性能，確保滿足COVID-19疫情防控的需求。

從檢測的靶標(biāo)N基因和ORF1ab基因情況來看，無論是單陽還是雙陽，不同品牌試劑盒的檢測結(jié)果有一定差異，試劑盒A的總陽性率明顯高于其他3種試劑盒，試劑盒D的總陽性率明顯低于其他3種試劑盒。這些差異主要與各品牌試劑盒設(shè)計(jì)的引物不同、PCR反應(yīng)體系競爭、熒光信號(hào)干擾、加入反應(yīng)體系里的核酸量、對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素的把控等有關(guān)。另外，大部分檢測結(jié)果為N基因和ORF1ab基因同時(shí)陽性，單獨(dú)ORF1ab基因陽性的情況比較少見（陽性率0.31%～1.57%），但單獨(dú)N基因陽性比例相對(duì)較高（陽性率5.03%～14.15%）。這可能是因?yàn)椴《臼窃诩?xì)胞內(nèi)復(fù)制的，N基因的轉(zhuǎn)錄量高于ORF1ab基因，使得針對(duì)N基因區(qū)域的陽性檢出率高于ORF1ab基因區(qū)域，尤其是在SARS-CoV-2載量較低的情況下，單獨(dú)N基因陽性的情況更為突出[7]。SARS-CoV-2為單鏈RNA病毒，容易發(fā)生突變，因此，包含N基因的多靶標(biāo)試劑檢測方案，有助于降低因基因突變及低病毒載量而導(dǎo)致的漏檢風(fēng)險(xiǎn)。

在實(shí)際工作中，對(duì)于單獨(dú)N或ORF1ab基因陽性結(jié)果，原標(biāo)本復(fù)查后也有部分結(jié)果變?yōu)殡p陽，甚至變?yōu)殛幮越Y(jié)果，這與檢測人員實(shí)驗(yàn)操作差異、試劑的性能有關(guān)。因此，對(duì)于出現(xiàn)的單陽結(jié)果，除了按試劑盒說明書及相應(yīng)技術(shù)指南的要求進(jìn)行復(fù)檢或重新采樣檢測外[1，8]，還需要檢測人員有嫻熟的實(shí)驗(yàn)操作技能。建議實(shí)驗(yàn)室采用不同品牌SARS-CoV-2檢測試劑盒，對(duì)可疑檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)測，以確認(rèn)結(jié)果的可靠性。

SARS-CoV-2核酸檢測用于COVID-19的篩查，對(duì)檢測試劑盒的敏感性及準(zhǔn)確度要求較高。試劑盒A敏感性達(dá)到98.2%，總符合率也達(dá)到93.1%，是比較理想的COVID-19篩查與診治檢測試劑盒。試劑盒B敏感性次之，總符合率最高，也可作為COVID-19的檢測試劑。試劑盒D的敏感性較低，如果被應(yīng)用到COVID-19的篩查與診治中，會(huì)帶來較大的漏診風(fēng)險(xiǎn)。由于本研究采用的是結(jié)果趨同的方法來相對(duì)確定最終的參考標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，故以上結(jié)論存在一定的局限性。

SARS-CoV-2核酸檢測雖是診斷COVID-19的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，但臨床診療上也出現(xiàn)了一些棘手的COVID-19患者咽拭子核酸持續(xù)陰性的情況。隨著COVID-19疫情防控工作的推進(jìn)，新的檢測與診斷指標(biāo)也開始出現(xiàn)。血清學(xué)檢測指標(biāo)SARS-CoV-2免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M和IgG抗體也被納入到COVID-19診療方案里[9]。而且已有的研究結(jié)果也表明，這些特異性抗體檢測有較好的敏感性和特異性，有助于彌補(bǔ)SARS-CoV-2核酸檢測的不足[10-11]。

總而言之，本研究中4種SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒性能參差不齊，試劑盒A與試劑盒B結(jié)果一致性最高，試劑盒A敏感性最高，準(zhǔn)確度較好，是比較理想的可用于COVID-19篩查和診治的試劑盒。試劑盒D敏感性較低，若用于SARS-CoV-2核酸檢測則存在漏診風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)室在使用SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒前應(yīng)進(jìn)行充分的性能驗(yàn)證。