鐵 寧，李 剛，白麗杰，王 靜，趙 靜，王 勇△

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059

痛風(fēng)是一種常見的關(guān)節(jié)炎，男性發(fā)病率高于女性，且各年齡段均可能出現(xiàn)痛風(fēng)[1]。痛風(fēng)常在夜間發(fā)作，受累關(guān)節(jié)疼痛進(jìn)行性加劇，呈撕裂樣、刀割樣或咬噬樣，難以忍受。關(guān)節(jié)可表現(xiàn)為紅腫灼熱、皮膚緊繃、觸痛明顯、功能受限，疼痛感持續(xù)幾天至幾周不等，緩慢減輕至消失[2]。發(fā)病關(guān)節(jié)會(huì)導(dǎo)致活動(dòng)及功能受限，影響日常生活，因此，對(duì)痛風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制進(jìn)行深入研究，并探討藥物治療的臨床療效和藥理作用機(jī)制，具有十分重要的意義[3]。有研究指出，在痛風(fēng)急性發(fā)作期患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)多出現(xiàn)單鈉尿酸鹽晶體沉積，誘導(dǎo)多形核中性粒細(xì)胞聚集，且當(dāng)炎癥反應(yīng)加重后，產(chǎn)生大量活性氧，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)形成，降解趨化因子及細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng)，有助于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的恢復(fù)[4-5]。槲皮素又名櫟精，在槐樹、蘋果、茶樹、銀杏、西紅柿、丹皮等植物中廣泛存在，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、祛痰止咳、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)及抗血栓等藥理作用[6-7]。近年來，有關(guān)槲皮素對(duì)血清NETs和淋巴細(xì)胞水平影響的報(bào)道較少。因此，本研究擬構(gòu)建痛風(fēng)動(dòng)物模型，分析槲皮素對(duì)痛風(fēng)動(dòng)物模型血清NETs和淋巴細(xì)胞水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所使用的30只6周齡Wistar雄性大鼠均購(gòu)自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，體質(zhì)量180～210 g，平均(190.32±13.29)g。常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，5只1籠，分籠飼養(yǎng)，維持室溫22～26 ℃，濕度55%～65%，正常晝夜循環(huán)，維持12 h光照，大鼠灌胃、換水、添加飼料等均由專人進(jìn)行。

1.2方法 將所有大鼠依照體質(zhì)量編號(hào)，并采用隨機(jī)數(shù)表法分為3組，即對(duì)照組、模型組、槲皮素組，每組10只。模型組和槲皮素組進(jìn)行造模，取仰臥位在解剖板上固定，右后肢小腿踝關(guān)節(jié)進(jìn)行常規(guī)消毒，選取踝關(guān)節(jié)外側(cè)作為6號(hào)注射針穿刺點(diǎn)，針口和脛骨為45°夾角傾向上刺入踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注射250 mg/mL尿酸鈉溶液0.2 mL，踝關(guān)節(jié)對(duì)側(cè)鼓起則注射成功。對(duì)照組注入等體積的生理鹽水。造模成功后槲皮素組大鼠每天早上9：00給予200 mg/kg的槲皮素灌胃，持續(xù)給藥1周，對(duì)照組及模型組同期灌胃等體積的蒸餾水。

1.3觀察指標(biāo) 給藥前和第7天給藥后依照炎癥指數(shù)評(píng)定準(zhǔn)則[8]和Goderre功能障礙指數(shù)[9]對(duì)大鼠急性炎癥狀況進(jìn)行評(píng)估，使用足容積測(cè)量?jī)x檢測(cè)足趾腫脹度，炎癥指數(shù)分級(jí)如下：0級(jí)，正常；1級(jí)，左后足皮膚有紅斑、關(guān)節(jié)稍微腫脹；2級(jí)：左后足顯著紅腫，關(guān)節(jié)部位骨性標(biāo)志消失；3級(jí)：左后足關(guān)節(jié)肢體發(fā)生腫脹。Goderre功能障礙指數(shù)分級(jí)如下：0級(jí)，步態(tài)正常，四足著地均勻；1級(jí)，輕微跛行，左后足足趾未展開，著地減輕；2級(jí)，跛行顯著，左后足趾背著地、屈起；3級(jí)：三足步態(tài)，左后足完全離地。給藥第1天和第6天眼底取血，離心收集血清，使用全自動(dòng)生化分析儀分析血清中淋巴細(xì)胞水平，后取100 μL血清加入100 μL PicoGreen熒光染料，避光孵育300 s，使用熒光染色法檢測(cè)血清中游離DNA/中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(cf-DNA/NETs)水平，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算cf-DNA/NETs水平。

2 結(jié) 果

2.1模型組、槲皮素組大鼠功能障礙指數(shù)、炎癥指數(shù)和足趾腫脹度的比較 本研究結(jié)果顯示，采用槲皮素干預(yù)前模型組和槲皮素組大鼠功能障礙指數(shù)、炎癥指數(shù)和足趾腫脹度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥后，槲皮素組大鼠功能障礙指數(shù)、炎癥指數(shù)和足趾腫脹度均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 模型組和槲皮素組大鼠功能障礙指數(shù)、炎癥指數(shù)和足趾腫脹度的比較

2.23組大鼠血清中淋巴細(xì)胞水平的比較 本研究結(jié)果顯示，給藥前，槲皮素組和模型組大鼠血清中淋巴細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但模型組和槲皮素組大鼠血清中淋巴細(xì)胞水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，給藥后3組大鼠血清中淋巴細(xì)胞水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中模型組最高，對(duì)照組最低，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠血清中淋巴細(xì)胞水平檢測(cè)結(jié)果比較

2.33組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比較 本研究結(jié)果顯示，給藥前，槲皮素組和模型組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但模型組和槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，給藥后3組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中模型組最高，對(duì)照組最低，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比較

3 討 論

槲皮素分布廣泛，屬于黃酮醇類化合物，具有多種生物活性。有研究指出，槲皮素具有對(duì)抗自由基作用，可捕獲自由基預(yù)防脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制腫瘤，并還具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌、預(yù)防糖尿病、抗過敏等較強(qiáng)的生物活性[10]。此外，槲皮素還具有輔助治療高血壓及冠心病的作用，且槲皮素毒性低，具有較大研究?jī)r(jià)值。有學(xué)者指出，采用槲皮素對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后，具有顯著的抗氧化、抗炎活性，但其作用機(jī)制尚不清楚[11]。有研究指出，將尿酸鈉晶體注入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)可用于建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病變模型，其臨床表現(xiàn)與病理表現(xiàn)相似[12]。采用該方案造模后關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞，在滑膜和關(guān)節(jié)積液中，細(xì)胞吞噬尿酸單鈉結(jié)晶，擴(kuò)大炎性反應(yīng)和釋放趨化介質(zhì)，同時(shí)關(guān)節(jié)滑膜肥厚和增生，關(guān)節(jié)液量增加。該造模方案快速、操作簡(jiǎn)單、成功率高，被視為經(jīng)典的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模方法，因此，本研究采用該方案進(jìn)行造模。

痛風(fēng)為慢性且復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，其中天然免疫和適應(yīng)性免疫在機(jī)體持續(xù)炎癥階段起到十分重要的主導(dǎo)作用。有研究指出，痛風(fēng)發(fā)病初期，天然免疫激活單核細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織，將尿酸鈉晶體吞噬，促進(jìn)淋巴細(xì)胞聚集，合成并分泌大量白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子[13]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素干預(yù)7 d后，槲皮素組大鼠功能障礙、炎癥指數(shù)和足趾腫脹度均明顯低于模型組，且槲皮素組大鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞水平顯著降低。說明槲皮素能夠顯著減輕痛風(fēng)模型大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性反應(yīng)，減少關(guān)節(jié)液容積。

人體天然免疫系統(tǒng)中的中性粒細(xì)胞是重要的效應(yīng)細(xì)胞，在早期免疫應(yīng)答階段起到十分重要的作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞活化后會(huì)釋放由組蛋白和DNA構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為NETs[14]。此外，NETs為球狀顆粒串并相互纏繞形成網(wǎng)狀陷阱樣結(jié)構(gòu)，可限制多種病原微生物擴(kuò)散，捕獲病原微生物，是中性粒細(xì)胞殺菌的新途徑。但過量NETs可誘導(dǎo)凝血功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有害作用。本研究結(jié)果顯示，模型組和槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明顯高于對(duì)照組，給藥后槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs明顯降低，且槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs低于模型組。說明采用槲皮素對(duì)痛風(fēng)模型大鼠干預(yù)后可有效降低血中cf-DNA/NETs水平，進(jìn)而有效下調(diào)體內(nèi)炎癥反應(yīng)程度[15]。

綜上所述，槲皮素干預(yù)痛風(fēng)模型大鼠后可有效降低血清NETs和淋巴細(xì)胞水平。但本研究并未對(duì)基因水平的改變進(jìn)行分析，有待進(jìn)一步探討。