陳磊

摘 要：本文旨在建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定綠豆糕中的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸，樣品經(jīng)正己烷去除油脂、硫酸鋅-氫氧化鈉去除蛋白質(zhì)，然后采用色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇和0.02mol/L乙酸銨（pH值8.0）溶液為流動(dòng)相，按照5∶95的比例進(jìn)行等度洗脫，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，以保留時(shí)間和待測(cè)物的紫外吸收光譜進(jìn)行定性分析、外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，5種食品添加劑的線性范圍為0.5～100mg/L（r2>0.999），檢出限為0.12～0.64mg/kg，平均回收率為94.0%～99.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%～1.31%。由此可見(jiàn)，該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)綠豆糕中5種常見(jiàn)食品添加劑的同時(shí)檢測(cè)，具有高效、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜? 食品添加劑? 綠豆糕

隨著人們生活水平的不斷提升，對(duì)于食品安全的要求也隨之增高。綠豆糕是百姓家中常備的糕點(diǎn)之一，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）[1]，糕點(diǎn)中可添加的食品添加劑種類繁多，但市面上銷售的綠豆糕配料表中常見(jiàn)的添加劑種類為防腐劑和甜味劑。安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸是較為常見(jiàn)的防腐劑和甜味劑種類，由于它們都是人工合成的化學(xué)物質(zhì)，故具有一定的毒性[2-4]。因此，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）[1]中規(guī)定了它們的最大使用量。為了避免企業(yè)過(guò)量使用食品添加劑，故需要通過(guò)簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)手段對(duì)市場(chǎng)上流通的產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管。

當(dāng)前，對(duì)安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的檢測(cè)多采用高效液相色譜法，且會(huì)在樣品前處理中使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑[5-8]。通過(guò)日常的檢驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑會(huì)造成樣品中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸這5種食品添加劑在色譜條件下的出峰時(shí)間發(fā)生改變而造成結(jié)果的誤判。因此，本文在測(cè)定時(shí)選擇更為合適的沉淀劑并對(duì)流動(dòng)相的條件加以優(yōu)化來(lái)消除脫氫乙酸的拖尾現(xiàn)象，從而高效、準(zhǔn)確地測(cè)定綠豆糕中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀，賽默飛（美國(guó)），配DAD檢測(cè)器;ME204/02型萬(wàn)分之一天平，梅特勒-托利多（瑞士）;Arium-Pro型純水系統(tǒng)，賽多利斯（德國(guó)）;S-700B型多參數(shù)測(cè)試儀，梅特勒-托利多（瑞士）;T18型分散機(jī)，IKA（德國(guó)）;0.22μm水相微孔濾膜，CNW（德國(guó)），HC-3018型離心機(jī)，中科中佳（中國(guó)）。

1.1.2 試劑

安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉，均由德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司提供，于20±4℃下保存;脫氫乙酸由美國(guó)Chem Service公司提供，于4℃下保存。

甲醇、乙酸、正己烷，均為色譜純，由TEDIA提供;乙酸銨為色譜純，阿拉丁;氨水、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、氫氧化鈉，均為分析純，由國(guó)藥提供;實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

乙酸銨溶液（0.02mol/L，pH值8.0）：稱取乙酸銨1.54g，加水溶解并稀釋至1000mL，用氨水調(diào)節(jié)pH值至8.0。

硫酸鋅溶液（120g/L）：稱取120g硫酸鋅，加水溶解并稀釋至1000mL。

亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）：稱取106g亞鐵氰化鉀，加水溶解并稀釋至1000mL。

乙酸鋅溶液（220g/L）：稱取220g乙酸鋅，加入30mL乙酸，加水溶解并稀釋至1000mL。

硫酸銅溶液（100g/L）：稱取100g硫酸銅，加水溶解并稀釋至1000mL。

氫氧化鈉溶液（20g/L）：稱取20g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1000mL。

氫氧化鈉溶液（40g/L）：稱取40g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1000mL。

安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液（1mg/mL）：分別稱取適量的5種食品添加劑置于燒杯中，加入10mL氫氧化鈉溶液（20g/L）和適量的水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。

安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液至10mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。

1.2 色譜條件

月旭Ultimate C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）;柱溫：35℃;流量：1.0mL/min;進(jìn)樣量：10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm;流動(dòng)相：0.02mol/L乙酸銨溶液（pH值8.0）∶甲醇=95∶5（V∶V）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取2.0g（精確至0.1mg）樣品置于50mL離心管中，加入20mL純水、2mL硫酸鋅（120g/L）、1.5mL氫氧化鈉（40g/L），勻漿，10000r/min離心5min，取上清液于250mL分液漏斗中。然后，在殘?jiān)屑尤?0mL純水，勻漿，10000r/min離心5min，合并上清液于250mL分液漏斗中。之后，在分液漏斗中加入15mL正己烷，振蕩5min，靜置分層，取下層溶液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，過(guò)0.22μm水相微孔濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉淀劑的選擇

目前，在檢測(cè)安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸時(shí)大多選擇亞鐵氰化鉀-乙酸鋅[9-10]體系作為沉淀劑，其雖然對(duì)于蛋白質(zhì)的沉淀效果明顯，但按照色譜條件進(jìn)行測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)存在使樣品中的5種目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰時(shí)間不一致的現(xiàn)象。由此推測(cè)，可能是亞鐵氰化鉀的配位作用造成5種目標(biāo)物質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生變化。

本文同時(shí)試驗(yàn)硫酸鋅-氫氧化鈉[11]和硫酸銅-氫氧化鈉[12]兩種體系的沉淀劑，二者對(duì)于蛋白質(zhì)的沉淀均有顯著效果，但由于硫酸銅屬于有毒物質(zhì)，不利于環(huán)保和實(shí)驗(yàn)室安全，故本文最終選擇硫酸鋅-氫氧化鈉體系作為沉淀劑。

2.2 流動(dòng)相的改進(jìn)

測(cè)定安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸時(shí)通常使用0.02moL/L乙酸銨和甲醇為流動(dòng)相[3-10]，以體積比95∶5進(jìn)行等度洗脫，以此分離以上5種食品添加劑。在此流動(dòng)相下分析以上5種食品添加劑不僅耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且脫氫乙酸的峰型存在拖尾現(xiàn)象。調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值可以抑制脫氫乙酸水解而造成峰型拖尾的現(xiàn)象，故本文通過(guò)氨水調(diào)節(jié)0.02moL/L乙酸銨的pH值，并比對(duì)pH值為5.0、6.0、7.0、8.0時(shí)的色譜圖。最后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙酸銨的pH值為8.0時(shí)，5種食品添加劑的分離效果較好，且脫氫乙酸無(wú)拖尾現(xiàn)象（如圖1）。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用DAD檢測(cè)器分別對(duì)安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，各組分的最大吸收波長(zhǎng)分別為安賽蜜（226nm）、苯甲酸（223nm）、山梨酸（254nm）、糖精鈉（207nm）、脫氫乙酸（230nm）。最終，綜合考慮各組分的響應(yīng)值，選擇230nm作為最終的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 工作曲線和檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)濃度分別為0.5、1、5、10、50、100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定，以5種食品添加劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，5種食品添加劑的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

將混標(biāo)添加在空白基質(zhì)樣品中，在相同條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，按照3倍信噪比考察5種食品添加劑的檢出限，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 回收試驗(yàn)

分別稱取綠豆糕陰性樣品2.0g（精確至0.1mg），按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每一個(gè)濃度平行進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié)果與討論

本文建立了氫氧化鈉-硫酸鋅體系作為沉淀劑的液-液萃取方法對(duì)綠豆糕進(jìn)行前處理，使用高效液相色譜-DAD檢測(cè)器于230nm波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸這5種食品添加劑。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，優(yōu)化后的色譜條件出峰快、峰形好，分離度符合要求，適用于綠豆糕中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸這5種食品添加劑的定性和定量分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）[S].

[2] 于喆源，張婕.食品中苯甲酸，山梨酸，糖精鈉，脫氫乙酸同時(shí)測(cè)定的HPLC方法.《食品安全導(dǎo)刊》[J]，2017（33）：131-134.

[3] 楊紅梅，劉艷琴，殷曉燕，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中安賽蜜，苯甲酸，山梨酸，糖精鈉以及脫氫乙酸.食品科技[J]，2007（10）：213-214.

[4] 王健，方建軍.HPLC快速測(cè)定月餅中5種添加劑.食品研究與開(kāi)發(fā)[J]，2016（10）：147-149.

[5] 尤妍，潘輝國(guó)，陳盼盼，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲料中5種添加劑.食品研究與開(kāi)發(fā)[J]，2016（37）：164-166.

[6] 譚朝勤，吳新.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定面包糕點(diǎn)中苯甲酸（鈉）、山梨酸（鉀）安賽蜜、糖精鈉和脫氫乙酸（鈉）的含量.廣東化工[J]，2009（6）：166-168.

[7] 李碧波，鄢兵華，榮汝繁.富硒豆豉中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的測(cè)定.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)[J]，2019 10）：521-526.

[8] 羅亮，姚幫本，吳巧.高效液相色譜法測(cè)定食品中5種防腐劑和甜味劑.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]，2016（44）：95-97.

[9] 董字鐵.高效液相色譜法測(cè)定食品中安賽蜜、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、脫氫乙酸的過(guò)程優(yōu)化研究.廣東化工[J]，2019（46）：116-117.

[10] 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28-2016）[S].

[11] 袁文新.超高效液相色譜法測(cè)定烘焙類食品中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸.衛(wèi)生研究[J]，2015（44）：681-683.

[12] 楊海昕，曹云，肖君.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸前處理方法探討.江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)[J]，2015（26）：100-102.