劉 娟 張俊輝 王 芹 周 影 錢 錕 祝長杰

(吉林省蠶業(yè)科學研究院，吉林吉林 132012)

柞蠶蛹蟲草中含有豐富的蛋白質(zhì)及氨基酸，蛋白質(zhì)含量為30%，氨基酸含量為22%，還含有冬蟲夏草所不含有的抗癌物質(zhì)蟲草素，所以蛹蟲草是冬蟲夏草的良好替代品。在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中，蛹蟲草菌的保藏方法對柞蠶蛹蟲草的產(chǎn)量及活性物質(zhì)含量影響較大。本文對蛹蟲草菌的保藏方法及不同保藏方法對蛹蟲草菌生產(chǎn)能力的影響作一探討。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蛹蟲草菌，柞蠶蛹，均由吉林省蠶業(yè)科學研究院提供。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA)；豐富培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，磷酸鈉0.25%，磷酸氫二鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，馬鈴薯15%；米飯培養(yǎng)基：大米20%，大麥35%，糙米20%，黃豆25%。

1.2 試劑與儀器

試劑：乙腈、甲醇購于美國Fisher試劑公司，蟲草素標準品購于國藥集團。儀器：Agilent 1290超高效液相色譜儀，KOKUSAN H-19F離心機，0.45μm水系濾膜等。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛹蟲草菌冷凍保藏

蛹蟲草菌接種于米飯培養(yǎng)基中，接種量為15%，待蛹蟲草菌長滿米飯培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)10 d，放置于-19 ℃冷凍保藏。

1.3.2 冷凍保藏蛹蟲草菌活化

取-19 ℃冷凍保藏的蛹蟲草菌，放置于-4 ℃的環(huán)境中進行活化12 h再應用于試驗中。

1.3.3 柞蠶蛹蟲草培育

取固體培養(yǎng)基上生長旺盛、轉(zhuǎn)色能力強的蛹蟲草菌菌塊(約黃豆粒大小)接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，23 ℃避光、120 r/min搖床培養(yǎng)96 h，得到蛹蟲草菌菌絲球懸液。每只柞蠶蛹接種量為0.2～0.3 mL。在適當培養(yǎng)條件下進行柞蠶蛹蟲草的培育(吉林省蠶業(yè)科學研究院專利技術(shù))，測定蛹蟲草菌的僵化率和出草率，得到柞蠶蛹蟲草。

1.3.4 蛹蟲草菌繼代培育

取PDA固體培養(yǎng)基上生長旺盛、轉(zhuǎn)色能力強的第1代蛹蟲草菌約黃豆粒大小，再次接種于PDA固體培養(yǎng)基中，23 ℃避光培養(yǎng)至蛹蟲草菌全部覆蓋培養(yǎng)基后見光培養(yǎng)，此為第2代菌株，依次繼代培養(yǎng)至第6代菌株，即得到蛹蟲草菌的第1代至第6代菌株。豐富培養(yǎng)基繼代培育相同。

1.3.5 樣品的制備

柞蠶蛹蟲草60 ℃烘干至恒重，粉碎，100目過篩，取0.5 g柞蠶蛹蟲草粉加水定容至100 mL，超聲水提3 h，5 000 r/min離心取上清，0.45 μm水系濾膜過濾用于液相色譜測定。

1.3.6 蟲草素含量測定

精密稱取蟲草素標準品，配制成濃度范圍為0.255～50 μg/mL的標準品溶液，每濃度進樣10 μL，3次平行。HPLC檢測條件：Welch Ultimate XB-C18色譜柱(5 μm，4.6mm×250mm)；流動相為水：乙腈=90∶10(V/V)；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長260 nm。

記錄不同濃度蟲草素標準品溶液吸收峰面積并取平均值，以蟲草素標準品濃度為橫坐標，以其不同濃度所對應的吸收峰面積為縱坐標。繪制蟲草素標準曲線。圖1為蟲草素標準溶液(20 ug/mL)液相色譜圖，圖2為蟲草素標準曲線，線性方程為Y=0.6693X+0.5083，R2=0.9999。

圖1 蟲草素標準溶液(20 ug/mL)液相色譜圖

圖2 蟲草素標準曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌冷凍保藏不同時間對其生產(chǎn)能力的影響

蛹蟲草菌在冷凍保藏不同時間時注蛹后其柞蠶蛹蟲草的數(shù)量見圖3，隨著冷凍保藏時間的延長，蛹蟲草菌均出現(xiàn)出草率降低的情況。以菌株B為例，初始時菌株B出草率為82.3%，冷凍保藏6月激活后出草率為80.7%，較初始時出草率降低1.9%；冷凍保藏12月激活后出草率為74.3%，較初始時出草率降低9.7%；冷凍保藏18月激活后出草率為69.7%，較初始時出草率降低15.3%?？梢姡S著冷凍保藏時間的延長蛹蟲草菌仍然具有生產(chǎn)能力，但生產(chǎn)能力大幅下降，故以生產(chǎn)柞蠶蛹蟲草為目的批量生產(chǎn)中，蛹蟲草菌不適合過長時間冷凍保藏。

圖3 蛹蟲草菌冷凍保藏不同時間對其生產(chǎn)能力的影響

2.2 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時間對其生產(chǎn)能力的影響

不同蛹蟲草菌在冷藏保藏不同時間時注蛹后柞蠶蛹蟲草的數(shù)量見圖4，隨著冷藏保藏時間的延長，不同蛹蟲草菌均出現(xiàn)出草率降低的情況。以菌株B為例，初始時菌株B出草率為82.3%；冷藏保藏6月后出草率為78.3%，較初始時出草率降低4.9%；冷藏保藏12月后出草率為70.3%，較初始時出草率降低14.6%；冷藏保藏18月后出草率為64%，較初始時出草率降低22.2%。可見，隨著冷藏保藏時間的延長蛹蟲草菌注蛹后出草率逐漸降低，故以生產(chǎn)柞蠶蛹蟲草為目的批量生產(chǎn)中，蛹蟲草菌亦不適合過長時間冷藏保藏。

圖4 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時間對其生產(chǎn)能力的影響

2.3 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時間其蟲草素含量變化

蛹蟲草菌在冷藏保藏不同時間注蛹后柞蠶蛹蟲草中蟲草素含量見圖5，隨著蛹蟲草菌冷藏保藏時間的延長，柞蠶蛹蟲草出現(xiàn)蟲草素含量降低的現(xiàn)象。以菌株D為例，初始時蟲草素含量為1.07 mg/g，冷藏保藏6月后蟲草素含量為1.01 mg/g，較初始時含量降低5.6%；冷藏保藏12月后蟲草素含量為0.93 mg/g，較初始時含量降低13.1%；冷藏保藏18月后蟲草素含量為0.87 mg/g，較初始時含量降低18.7%?？梢?，隨著蛹蟲草菌冷藏保藏時間的延長柞蠶蛹蟲草中蟲草素含量逐漸降低。

圖5 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時間其蟲草素含量變化

2.4 蛹蟲草菌在豐富培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時其生產(chǎn)能力的變化

蛹蟲草菌在豐富培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時生產(chǎn)能力見圖6。以菌株A為例，第1代蛹蟲草菌出草率為86.7%；第2代蛹蟲草菌出草率為81%，較第1代下降6.6%；第3代出草率為76.7%，較第1代下降11.5%；第4代蛹蟲草菌出草率為72.3%，較第1代下降16.6%；第5代蛹蟲草菌出草率為68.7%，較第1代下降20.8%；第6代出草率為63.7%，較第1代下降26.5%。可見，豐富培養(yǎng)基中蛹蟲草菌隨傳代次數(shù)的增加其生產(chǎn)能力均出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，故在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中蛹蟲草菌不適宜在豐富培養(yǎng)基中傳代次數(shù)過多。

圖6 蛹蟲草菌在豐富培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時其生產(chǎn)能力的變化

2.5 蛹蟲草菌在PDA培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時其生產(chǎn)能力的變化

在PDA培養(yǎng)基中，蛹蟲草菌在不同傳代次數(shù)時出草率見圖7，蛹蟲草菌在PDA培養(yǎng)基中繼代培育其出草率均不斷降低。以菌株A為例，第1代蛹蟲草菌出草率為86%；第2代蛹蟲草菌出草率為83.7%，較第1代下降2.7%；第3代出草率為78.7%，較第1代下降8.5%；第4代蛹蟲草菌出草率為73.3%，較第1代下降14.8%；第5代蛹蟲草菌出草率為68.7%，較第1代下降20.1%；第6代出草率為65%，較第1代下降24.4%?？梢?，在PDA培養(yǎng)基中蛹蟲草菌隨傳代次數(shù)的增加其生產(chǎn)能力均出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，且趨勢與在豐富培養(yǎng)基中相同。

圖7 蛹蟲草菌在PDA培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時其生產(chǎn)能力的變化

3 討 論

在柞蠶蛹蟲草的生產(chǎn)中，蛹蟲草菌的保藏時間、保藏方法、傳代次數(shù)等都對柞蠶蛹蟲草生產(chǎn)的影響巨大。

菌種保藏過程中，隨著保藏時間的延長蛹蟲草菌均會出現(xiàn)生產(chǎn)能力降低的現(xiàn)象，但冷凍保藏較冷藏保藏蛹蟲草菌生產(chǎn)能力降低的速度慢，故冷凍更適合用來保藏蛹蟲草菌，但在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中還應盡量減少蛹蟲草菌的保藏時間以達到良好的生產(chǎn)效果。

隨著冷藏保藏時間的延長蟲草素含量逐漸降低，故在以高產(chǎn)蟲草素為目的的柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中，應盡量減少蛹蟲草菌的保藏時間。

PDA培養(yǎng)基中蟲草菌生產(chǎn)能力下降的速度在不同傳代次數(shù)時均慢于在豐富培養(yǎng)基中，可見PDA培養(yǎng)基更適合蛹蟲草菌的繼代保藏，在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中應盡量選擇PDA培養(yǎng)基作為蛹蟲草菌的保藏培養(yǎng)基，同時盡量減少生產(chǎn)用蛹蟲草菌的傳代次數(shù)，以達到高產(chǎn)柞蠶蛹蟲草的目的。