朱梓良，曾濤，起燕江，3

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理671003；2.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明650106；3.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，云南昆明650500）

由磷酸萘酚喹和青蒿素組成的復(fù)方磷酸萘酚喹片是一種極其有效的抗瘧疾藥物[1-4]。然而，在生產(chǎn)磷酸萘酚喹原料藥的過程中，4,7-二氯喹啉作為該工藝的重要中間體[5-6]，可能含有殘留的乙氧基次甲基丙二酸二乙酯（EMME）以及環(huán)合時生成的副產(chǎn)物4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉[7]，這些雜質(zhì)若被引進磷酸萘酚喹中將直接影響成品的質(zhì)量。

參考過往的研究，雖已有采用填充柱檢測4,7-二氯喹啉中4,5-二氯喹啉含量的GC 方法的文獻報道[8]，但該方法未對4,7-二氯喹啉中可能含有的雜質(zhì)EMME 和4,8-二氯喹啉進行研究。本文建立一種簡便、準確的GC 分析方法，以測定4,7-二氯喹啉中雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的含量，為更準確控制復(fù)方磷酸萘酚喹片的產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

XSE205 十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；clarus600 氣相色譜儀（美國PE 公司）；YY-HI-100L超純水儀(成都優(yōu)越科技有限公司）。色譜柱：Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）、Elite-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm，珀金埃爾默儀器有限公司)。

4,7-二 氯 喹 啉(批 號C10142219、C10132378、C10132107，上海麥克林生化科技有限公司）；乙氧基次甲基丙二酸二乙酯(EMME，批號：M180830358，上海麥克林生化科技有限公司）；4,5-二氯喹啉（批號：1916051，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4,8-二氯喹啉（批號：1-NIS-107-1，Toronto Research Chemicals）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，批號：l6C0N30，J&K Scientific Ltd）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）；進樣口溫度：300 ℃；FID檢測器溫度：280 ℃；載氣：N2；流速：2.0 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1；柱溫：初始180 ℃恒溫4 min，一階速率6.5 ℃/min 升至200 ℃恒溫0 min；二階速率20 ℃/min 升至250 ℃恒溫4 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品儲備液的制備 精密稱取EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉各25 mg，置于50 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解定容，精密量取1 mL 置于10 mL 量瓶，DMF 定容，得質(zhì)量濃度分別為50.0 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密量取1 mL混合對照品儲備液置于10 mL量瓶，DMF定容，得質(zhì)量濃度分別為5.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取4,7-二氯喹啉100 mg 置于20 mL 量瓶，DMF 定容，得質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的供試品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗溶液的制備 精密稱取供試品4,7-二氯喹啉100 mg 置于20 mL 量瓶，加入2 mL的混合對照品儲備液，采用DMF稀釋定容，即得。

2.3 色譜系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項系統(tǒng)適用性試驗溶液，按“2.1”項色譜條件進樣并分析，色譜圖見圖1?？梢姡鹘M分的理論塔板數(shù)不低于10 000，且各組分之間的分離度均大于1.5。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗GC色譜圖Figure 1 GC chromatogram of applicability test

2.4 專屬性試驗

分別取“2.2”項混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣分析，色譜圖見圖2。可見，各雜質(zhì)峰與樣品峰均不受溶劑因素干擾且各峰之間完全分離，表明方法專屬性良好。

2.5 定量限和檢測限

精密量取混合對照品儲備液逐級稀釋，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，測得EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的定量限（S/N=10）均為2.5 μg/mL，檢測限（S/N=3）均為0.75 μg/mL。

2.6 標準曲線及線性范圍

分別精密量取混合對照品儲備液3、3、1、2、3、1 mL 置于20、25、10、25、50、20 mL 量瓶中，采用DMF稀釋定容，得6份不同濃度的對照品溶液，分別于“2.1”色譜條件下進樣檢測，記錄色譜圖，以各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.7 精密度試驗

2.7.1 儀器精密度 精密量取1 mL混合對照品儲備液置于20 mL 量瓶中，DMF 稀釋定容，按“2.1”項色譜條件重復(fù)進樣6 次，記錄EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉3種雜質(zhì)的峰面積，計算其RSD值分別為2.50%、2.45%和2.14%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

圖2 空白溶劑（A）、混合對照品（B）、4,7-二氯喹啉供試品（C）的GC色譜圖Figure 2 GC chromatograms of blank solvent(A),mixed reference substance(B)and sample of 4,7-dichloroquinoline(C)

表1 4,7-二氯喹啉中有關(guān)物質(zhì)線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Linear relationships of related impurities in 4,7-dichloroquinoline

2.7.2 重復(fù)性試驗 精密稱取4,7-二氯喹啉（批號：C10142219）約100 mg置于20 mL量瓶，加入2 mL的混合對照品儲備液，采用DMF 定容，共制備6 份，按“2.1”項色譜條件分別進樣檢測，記錄峰面積。結(jié)果顯示雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的峰面積RSD 值分別為2.44%、2.12%、2.76%，均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密稱取1 份4,7-二氯喹啉（批號：C10142219）約100 mg 置于20 mL 量瓶，加入2 mL 的混合對照品儲備液，DMF 定容，于室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、12 h 按“2.1”色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。結(jié)果測得EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉峰面積RSD 值分別為1.92%、2.14%、2.07%，均小于3%，表明在室溫條件下放置12 h穩(wěn)定性符合要求。

2.9 回收率試驗

精密稱取4,7-二氯喹啉（批號：C10142219）9份，每份約100 mg，分別置于20 mL 量瓶，分為3 組，對應(yīng)每組分別加入1、2、3 mL 混合對照品儲備液，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件下分別進樣檢測，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 耐用性試驗

在“2.1”色譜條件基礎(chǔ)上，考察了柱溫和載氣N2流速對雜質(zhì)測定的影響。結(jié)果表明，初始溫度波動±10 ℃，最終溫度波動±10 ℃，載氣N2流速波動+0.5 mL/min 范圍內(nèi)，雜質(zhì)的專屬性試驗以及重復(fù)性試驗結(jié)果均符合要求，顯示方法耐用性良好。

3 樣品的測定

取3 批4,7-二氯喹啉供試品（批號：C10142219、C10132378、C10132107）粉末，按“2.2”項方法制備3批樣品的供試品溶液和混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣分析，以外標法計算已知雜質(zhì)含量，結(jié)果顯示：3 批樣品均檢測出了雜質(zhì)4,5-二氯喹啉，質(zhì)量分數(shù)分別為0.07%、0.06%、0.07%；未檢測出雜質(zhì)EMME和4,8-二氯喹啉。

4 討論

4.1 溶劑的選擇

化合物EMME、4,7-二氯喹啉、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉幾乎不溶于水，在甲醇、乙腈和DMF 中可溶。本研究分別比較了采用甲醇、乙腈和DMF 作為溶劑的效果，結(jié)果顯示采用DMF作為溶劑時，該4種組分的峰形最好，靈敏度最高。

4.2 色譜柱的考察

考察了Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）和Elite-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm）2 種類型色譜柱，以及3 種不同批號Elite-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm）色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示均有較好的分離度，且色譜柱Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）的靈敏度更高，因此本研究采用色譜柱Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）作為固定相并進行分析方法學(xué)驗證。

表2 4,7-二氯喹啉有關(guān)物質(zhì)加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 The recoveries of related impurities in 4,7-dichloroquinoline(n=9)

4.3 雜質(zhì)限度的確定

參考ICH Q3a 指導(dǎo)原則，暫定4,7-二氯喹啉中雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的質(zhì)量分數(shù)限度均為0.1%。

本研究建立的GC 檢測方法能簡便、快速、準確地測定出4,7-二氯喹啉中可能含有的相關(guān)雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉。