王亞琴 李宗迪 李晨羊 李云琴 胡濤 謝禮 周雪平

關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)互作;熒光共振能量轉(zhuǎn)移;mNeonGreen;mKOk

熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence reso-nance energy transfer，F(xiàn)RET）是指兩個(gè)相互靠近的熒光發(fā)色基團(tuán)中，一個(gè)分子吸收一定頻率的光子被激發(fā)到更高的電子能態(tài)的同時(shí)，通過(guò)偶極子相互作用，將能量向另一分子轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象的發(fā)生有兩個(gè)前提條件：一是兩個(gè)熒光發(fā)光基團(tuán)中一個(gè)熒光基團(tuán)（供體分子）的發(fā)射光波長(zhǎng)需與另一個(gè)熒光基團(tuán)（受體分子）的激發(fā)光波長(zhǎng)存在重疊區(qū)域;二是供體分子和受體分子之間的距離必須在1～10nm之間。由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象需要在這兩個(gè)較為苛刻的條件下才能發(fā)生，且對(duì)供體和受體間的距離和空間取向高度敏感，因而可以作為檢測(cè)蛋白質(zhì)之間直接相互作用的有效工具。

青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein，CFP）與黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）是目前蛋白質(zhì)相互作用研究中應(yīng)用最廣泛的FRET對(duì)，但CFP/YFP對(duì)存在一定的不足，如CFP和YFP會(huì)發(fā)生快速、多速率、可逆的光漂白，YFP可在一定條件下光轉(zhuǎn)化為青色熒光，CFP可以被YFP的激發(fā)光波長(zhǎng)激發(fā)出熒光等原因造成CFP/YFP對(duì)背景干擾較大。此外，許多報(bào)道表明基于CFP和YFP的FRET，當(dāng)生物化學(xué)反應(yīng)微弱或比較短暫時(shí)，會(huì)對(duì)FRET檢測(cè)效率產(chǎn)生一定的挑戰(zhàn)。因此，找到一對(duì)低背景干擾且能量轉(zhuǎn)移效率高的熒光蛋白對(duì)，對(duì)于FRET的檢測(cè)至關(guān)重要。

mNeonGreen是一種來(lái)源于文昌魚(yú)Branchios-toma lanceolatum的新型綠色熒光蛋白，最大激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為504、517 nm，mKOk是一種來(lái)源于石珊瑚Verrillofungia concinna的新型橙色熒光蛋白，最大激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為551、563 nm，研究發(fā)現(xiàn)，mNeonGreen和mKOk熒光蛋白相較于傳統(tǒng)的綠色和橙色熒光蛋白具有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。目前關(guān)于將這兩種熒光蛋白用于FRET檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究在植物細(xì)胞中驗(yàn)證mNeonGreen-mKOk熒光蛋白對(duì)是否適用于FRET技術(shù)檢測(cè)，并探索一套基于FRET技術(shù)檢測(cè)植物蛋白間相互作用的體系。

1材料與方法

1.1材料

本氏煙Nicotiana benthamiana野生株系型由本實(shí)驗(yàn)室留種繁殖;大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5a，農(nóng)桿菌Agrobacterium tume faciens菌株C58C1，含F(xiàn)LAG和MYC標(biāo)簽的植物表達(dá)載體pGD-FLAG、pGD-MYC均由本實(shí)驗(yàn)室保存;REMl.1為實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒;mKOk、mNeonGreen熒光蛋白由尚亞生物有限公司合成;FLAG、MYC標(biāo)簽抗體購(gòu)自Sig-ma公司;二抗購(gòu)自ABclonal公司;KOD OneTM PCRMaster Mix購(gòu)自TOYOBO公司;ClonExpress II OneStep Cloning Kit、ClonExpress MultiS One Step Clo-ning Kit購(gòu)自Vazyme公司;Kan、Rif抗生素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1 FRET載體構(gòu)建

以供體熒光蛋白（donor）和受體熒光蛋白（accep-tor）為模板，分別設(shè)計(jì)特異性引物IF-pGD-Donor-F/IF-pGD-Donor-R、IF-pGD-Acceptor-F/IF-pGD-Accep-tor-R（表1），得到去除終止密碼子且?guī)в信cpGD載體同源序列的基因片段，而后將得到的PCR產(chǎn)物利用單片段同源重組的方法分別克隆到pGD-35S-MYC和pGD-35S-FLAG載體上，得到pGD-35S-MYC-Donor和pGD-35S-FLAG-Acceptor（圖1a，b）。再以Donor和Acceptor為模板，分別設(shè)計(jì)特異性引物IF-pGD-FLAG-Donor-F/IF-pGD-Donor-Acceptor-R、IF-pGD-Donor-Acceptor-F/IF-pGD-Acceptor-NOS-R，得到帶有同源序列的Donor和Acceptor片段，而后將PCR產(chǎn)物利用多片段同源重組的方法克隆到pGD-35S-FLAG載體上，得到載體pGD-35S-FLAG-Acceptor-Donor（圖1c）。以待檢測(cè)的互作蛋白（interacting protein，IP）為模板，設(shè)計(jì)特異性引物IF-pGD-IP-F/IF-pGD-IP-R，得到去除終止密碼子且?guī)в信c載體同源序列的基因片段，再利用同源重組的方法將PCR產(chǎn)物分別克隆到帶有供體和受體熒光蛋白的載體上，得到載體pGD-35S-IP-Ac-ceptor-FLAG、pGD-35S-IP-Donor-MYC（圖1d，e）。構(gòu)建好的載體在測(cè)序正確后，電激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株C58C1中。

1.2.2農(nóng)桿菌在本氏煙上的瞬時(shí)表達(dá)

將構(gòu)建好的農(nóng)桿菌置于含有Kanq-Rif的雙抗YFP液體培養(yǎng)基中，28℃，220r/min培養(yǎng)12 h，取2mL菌液于12000r/min下離心30s，而后加入1mL潤(rùn)緩沖液重懸菌體，調(diào)節(jié)OD至0.8左右，室溫靜置2～3h。靜置好的菌液分別浸潤(rùn)本氏煙葉片，于25℃下培養(yǎng)36～48h。

1.2.3蛋白提取、SDS-PAGE及Western blot分析

取約0.10g本氏煙葉片，經(jīng)液氮處理后研磨成粉末，加入200μL植物蛋白質(zhì)提取緩沖液，振蕩1min使樣品與提取緩沖液充分混合反應(yīng)，12000 r/min離心5min，取上清，加入50/μ5×loading buffer，95℃金屬浴5min后使蛋白變性。將制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，取下凝膠，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用TBST緩沖液對(duì)封閉后的膜洗3遍，每次5min，加人事先配制好的一抗溶液，在搖床上輕晃孵育1h，用TBST緩沖液洗膜3遍，每次5～10min。加入HRP標(biāo)記的二抗，在搖床上孵育1h，用TBST緩沖液洗膜3～5次，每次5min，最后用Luminate Forte WesternHRP substrate（Millipore）進(jìn)行化學(xué)顯影。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)FRET效率

樣品制備：檢測(cè)樣品為共表達(dá)供體熒光蛋白mNeonGreen/CFP-IP和受體熒光蛋白mKOk/YFP-IP及融合表達(dá)mNeonGreen-mKOk、CFP-YFP的本氏煙葉片;質(zhì)控樣品為單獨(dú)表達(dá)供體熒光蛋白mNeonμGreen/CFP-IP或受體熒光蛋白mKOk/YFP-IP的本氏煙葉片。采用敏化發(fā)射法（sensitized emissionFRET，SE-FRET）檢測(cè)FRET現(xiàn)象。該法是通過(guò)供體的激發(fā)光去激發(fā)供體，若供體和受體的空問(wèn)距離在1～10nm范圍內(nèi)，供體的發(fā)射光就能激發(fā)出受體的熒光，則可以檢測(cè)到FRET信號(hào)。檢測(cè)步驟如下：

第一步：調(diào)試參數(shù)。首先設(shè)定供體熒光和受體熒光的掃描參數(shù)。由于mNeonGreen供體熒光的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別為504、517nm mKOk受體熒光的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別為551、563 nm，因此采用488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)mNeonGreen熒光蛋白，并采用490～550nm波長(zhǎng)的發(fā)射光接收發(fā)射光;對(duì)于受體mKOk熒光蛋白，采用561nm波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，并采用575～625nm波長(zhǎng)的發(fā)射光檢測(cè)發(fā)射光信號(hào)。另外，當(dāng)FRET熒光蛋白對(duì)變?yōu)镃FP/YFP時(shí)，由于CFP供體熒光的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別為436、476 nm，YFP受體熒光的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別為516、529nm，因此采用405nm波長(zhǎng)的激發(fā)光可以激發(fā)出CFP的熒光，并采用455～515nm波長(zhǎng)的發(fā)射光接收發(fā)射光，YFP的熒光可以采用514nm波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，采用520～620nm波長(zhǎng)的發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)。

第二步：采用多軌道（multi track）FRET圖像采集模式。其中，Track中有兩個(gè)通道，待檢測(cè)的蛋白均用供體的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，通道工收集供體熒光的發(fā)射信號(hào)，通道Ⅱ收集FRET的發(fā)射信號(hào)。TrackⅡ只有一個(gè)受體熒光的通道，采用受體的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，并使用這個(gè)通道單獨(dú)收集受體熒光的發(fā)射信號(hào)。調(diào)整激發(fā)光的強(qiáng)度，獲得理想的熒光圖像。

第三步：FRET效率的分析。從獲得的FRET熒光圖像中，選擇感興趣的區(qū)域（ROD，采用Xia和Liu的方法，利用卡爾蔡司AIM軟件的LSMFRET軟件自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)ROI的FRET效率，即N-FRET值。

第四步：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢測(cè)的方法分析試驗(yàn)組和對(duì)照組的N-FRET值是否存在差異，利用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1熒光蛋白mNeonGreen、mKOk的光譜分析

通過(guò)在線網(wǎng)站（https：//WWW.fpbase.org/fret/）對(duì)mNeonGreen和mKOk的熒光光譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，mNeonGreen最大激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為504、517 nm，mKOk最大激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為551、563nm，且二者的光譜存在重疊區(qū)域（圖2），其中mNeonGreen可作為供體熒光，mKOk作為受體熒光。

2.2重組載體鑒定

以熒光蛋白mNeonGreen，mKOk為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增和酶切篩選獲得的陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，對(duì)相應(yīng)的目的片段進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，得到大小分別為798 bp和720 bp的特異性條帶（圖3），與已報(bào)道的目標(biāo)基因大小符合，證明熒光蛋白mNeon-Green.mKOk分別成功地插入到目的載體上。

2.3重組蛋白鑒定

將構(gòu)建好的熒光蛋白載體在本氏煙葉片上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，36～48h后提取蛋白并進(jìn)行Westernblot分析，利用MYC和FLAG抗體分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，MYC和FLAG抗體可檢測(cè)到mNeon-Green和mKOk的條帶，用FLAG抗體可檢測(cè)到融合蛋白的條帶（圖4），證實(shí)所構(gòu)建的熒光蛋白載體可以在本氏煙葉片中成功表達(dá)。

2.4 mNeonGreen/mKOk熒光蛋白對(duì)適用于FRET技術(shù)檢測(cè)

將C58Cl-pGD-mNeonGreen-MYC、C58Cl-pGD-mKOk-FLAG等比例混合后浸潤(rùn)野生型本氏煙，作為陰性對(duì)照組，將融合表達(dá)載體C58C1-pGD-FLAG-mNeonGreen-mKOk浸潤(rùn)野生型本氏煙葉片，作為陽(yáng)性對(duì)照組，在本氏煙葉片上瞬時(shí)表達(dá)48h后進(jìn)行FRET效率檢測(cè)。

為了排除串色對(duì)FRET效率計(jì)算的干擾，首先收集僅表達(dá)供體mNeonGreen和受體mKOk的FRET圖像作為校正因子（圖5a，b），計(jì)算出串?dāng)_系數(shù)，用于后續(xù)的FRET效率分析，該計(jì)算過(guò)程由卡爾蔡司自帶的LSM FRET軟件完成。

用波長(zhǎng)為488nm激發(fā)光和490～550nm發(fā)射光檢測(cè)共表達(dá)供體mNeonGreen和受體mKOk以及表達(dá)融合蛋白mNeonGreen-mKOk的本氏煙葉片，均可以獲得mNeonGreen熒光圖像（圖5c，d，mNeonGreen通道）;用波長(zhǎng)561nm激發(fā)光和575～625nm發(fā)射光檢測(cè)共表達(dá)供體mNeonGreen和受體mKOk以及表達(dá)融合蛋白mNeonGreen-mKOk的本氏煙葉片，也可檢測(cè)到mKOk熒光的發(fā)射光信號(hào)（圖5c，d，mKOk通道）。用波長(zhǎng)為488nm激發(fā)光和575～625nn3.發(fā)射光檢測(cè)FRET信號(hào)時(shí)，無(wú)法在共同表達(dá)供體和受體的葉片（mNeonGreen+mKOk）中獲得FRET通道的圖像（圖5c，F(xiàn)RET通道），但能在表達(dá)融合蛋白mNeonGreen-mKOk的葉片上檢測(cè)到較強(qiáng)的FRET信號(hào)（圖5d，F(xiàn)RET通道）。

根據(jù)獲得的FRET圖像，用卡爾蔡司自帶的LSM FRET軟件計(jì)算FRET效率N-FRET值。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組的FRET效率值幾乎為零，而陽(yáng)性對(duì)照組的FRET效率值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陰性對(duì)照組，且兩者存在顯著差異（圖5e）。說(shuō)明mNeonGreen和mKOk熒光蛋白在共浸潤(rùn)的情況下，由于空間距離上足夠遠(yuǎn)，不會(huì)發(fā)生FRET現(xiàn)象，可以作為FRET檢測(cè)的陰性對(duì)照組。而融合熒光蛋白mNeonGreen-mKOk由于在空間距離上幾乎為零，因此發(fā)生了FRET現(xiàn)象，說(shuō)明mNeonGreen/mKOk熒光蛋白對(duì)適用于FRET技術(shù)檢測(cè)。

2.5mKOk/mNeonGreen熒光蛋白對(duì)的優(yōu)勢(shì)

將C58Cl-tGDMYC-CFP、C58C1-pGDFLAG-YFP等比例混合后浸潤(rùn)野生型本氏煙，作為陰性對(duì)照組，將融合表達(dá)載體C58C1-pGD-FLAG-CFP-YFP浸潤(rùn)野生型本氏煙，作為陽(yáng)性對(duì)照組，在本氏煙葉片上瞬時(shí)表達(dá)48h后進(jìn)行FRET效率檢測(cè)。

首先，采集單獨(dú)表達(dá)供體CFP和受體YFP的FRET圖像（圖6a，b），并進(jìn)行串?dāng)_系數(shù)的計(jì)算。再用波長(zhǎng)405 nm激發(fā)光、455～515nm發(fā)射光檢測(cè)共表達(dá)供體CFP和受體YFP以及表達(dá)融合蛋白CFP-YFP的本氏煙葉片，均可以獲得青色熒光圖像（圖6c，d，CFP通道）;用波長(zhǎng)514nm激發(fā)光和520～620nm發(fā)射光檢測(cè)共表達(dá)供體和受體以及表達(dá)融合蛋白的本氏煙葉片，均能檢測(cè)到黃色熒光的發(fā)射光信號(hào)（圖6c，d，YFP通道）。用波長(zhǎng)為405nm激發(fā)光和520～620nm發(fā)射光檢測(cè)FRET信號(hào)時(shí)，不僅能在表達(dá)融合蛋白CFP-YFP的葉片上檢測(cè)到FRET的信號(hào)（圖6d，F(xiàn)RET通道），在共同表達(dá)CFP和YFP的葉片中，也可以獲得較弱的FRET通道信號(hào)（圖6c，F(xiàn)RET通道）。

對(duì)獲得的陰性和陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行FRET效率分析，結(jié)果表明，在共同表達(dá)CFP和YFP的情況下，F(xiàn)RET通道檢測(cè)到了較弱的信號(hào)，但是通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，表達(dá)融合蛋白CFP-YFP的葉片F(xiàn)RET效率相比于共同表達(dá)CFP和YFP的葉片F(xiàn)RET效率之問(wèn)還是存在顯著性差異的（圖6e）。與mNeonGreen/mKOk熒光對(duì)的陰性對(duì)照組相比，CFP/YFP熒光對(duì)陰性對(duì)照組FRET效率值明顯偏高，說(shuō)明CFP/YFP熒光對(duì)存在一定的背景干擾，而mNeonGreen/mKOk的陰性對(duì)照組的FRET效率值更接近于零，背景干擾較低。所以，在煙草葉片中，mNeonGreen/mKOk相比于傳統(tǒng)的CFP/YFP更適合作為FRET熒光蛋白對(duì)用于蛋白相互作用的檢測(cè)。

2.6 mKOk-mNeonGreen熒光蛋白對(duì)驗(yàn)證植物蛋白間相互作用

Remorin蛋白是定位在植物細(xì)胞膜上的一種陸地植物特有的蛋白，它可以通過(guò)影響胼胝體的積累來(lái)調(diào)節(jié)胞間連絲孔徑的大小，在植物抵抗病原微生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。NbREMl.1是Remorin蛋白的一種，F(xiàn)u等利用傳統(tǒng)的酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)等方法鑒定到NbREMl.1存在自身互作的現(xiàn)象。因此，本研究選取REMl.1蛋白，采用mNeonGreen/mKOk FRET熒光蛋白對(duì)驗(yàn)證其蛋白質(zhì)間相互作用。

采集單獨(dú)表達(dá)REMl.1-mNeonGreen和REM1.1-mKOk的FRET圖像（圖7a，b），計(jì)算出串?dāng)_系數(shù)。再用488nm波長(zhǎng)的激發(fā)光、490～550nm波長(zhǎng)的發(fā)射光檢測(cè)共表達(dá)供體mNeonGreen和受體mKOk以及共表達(dá)REMl.1-mNeonGreen和REMl.1-mKOk的煙草細(xì)胞，均可以獲得mNeon-Green熒光圖像（圖7c，d，mNeonGreen通道）。同時(shí)，用561nm波長(zhǎng)的激發(fā)光、575～625nm波長(zhǎng)的發(fā)射光檢測(cè)共表達(dá)供體mNeonGreen和受體mKOk以及共表達(dá)REMl.1-mNeonGreen和REMl.1-mKOk的煙草細(xì)胞，均可以獲得mKOk熒光的發(fā)射光信號(hào)（圖7c，d，mKOk通道）。用波長(zhǎng)為488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光、575～625nm波長(zhǎng)的發(fā)射光檢測(cè)FRET信號(hào)時(shí)，無(wú)法在共同表達(dá)供體mNeonGreen和受體mKOk的葉片中獲得FRET通道的圖像（圖7c，F(xiàn)RET通道），但能在共表達(dá)REMl.1-mNeon-Green和REMl.1-mKOk的煙草葉片上檢測(cè)到較強(qiáng)的FRET信號(hào)（圖7d，F(xiàn)RET通道）。

根據(jù)獲得的FRET圖像，利用軟件計(jì)算FRET效率值。結(jié)果顯示，共同表達(dá)REMl.1-mNeon-Green和REMl.1-mKOk的FRET效率值遠(yuǎn)高于共表達(dá)mNeonGreen和mKOk的FRET效率值，并且兩者之間存在顯著性差異（圖7e），證實(shí)REMl.1可以發(fā)生自身互作，與之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

3討論

在植物體內(nèi)，蛋白質(zhì)間的相互作用與多種生物過(guò)程相關(guān)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)平衡控制、應(yīng)激反應(yīng)、植物防御和器官形成等。在分子層面上，蛋白質(zhì)問(wèn)的相互作用在蛋白質(zhì)翻譯后修飾、轉(zhuǎn)錄輔助因子的招募、細(xì)胞骨架的組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)體的活化等方面都具有重要意義。

目前研究蛋白質(zhì)互作的常規(guī)技術(shù)為酵母雙雜交技術(shù)、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiFC）、GST pull-down技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)等。這些研究技術(shù)的不斷發(fā)展，為蛋白一蛋白間相互作用的研究提供了極為有利的條件，但同時(shí)這些研究手段也存在不少缺陷，如傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)操作周期較長(zhǎng)，并且需要將誘餌蛋白和捕獲蛋白拉至細(xì)胞核內(nèi)才能啟動(dòng)下游報(bào)告信號(hào)，因此不能鑒定出在細(xì)胞核之外具有特定亞細(xì)胞定位的互作。BiFC的缺點(diǎn)在于假陽(yáng)性較多，需要進(jìn)行多重篩選等試驗(yàn)進(jìn)行排除。GST pull-down技術(shù)無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模篩選、且不能排除內(nèi)源蛋白產(chǎn)生的假陽(yáng)性的干擾。免疫共沉淀技術(shù)無(wú)法檢測(cè)瞬時(shí)的相互作用、無(wú)法判斷是直接還是問(wèn)接的相互作用等。

近年來(lái)，F(xiàn)RET技術(shù)的發(fā)展為彌補(bǔ)上述問(wèn)題提供了一個(gè)有力的工具。相比于傳統(tǒng)的蛋白一蛋白互作研究手段，F(xiàn)RET技術(shù)能夠在活細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件下進(jìn)行檢測(cè)，并具有靈敏度高，假陽(yáng)性較低，實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)勢(shì)，因此目前FRET技術(shù)在研究哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用上已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。但由于植物葉片葉肉組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜等因素，F(xiàn)RET技術(shù)在植物蛋白互作研究中的應(yīng)用較少。

進(jìn)行FRET檢測(cè)時(shí)最關(guān)鍵的就是選擇兩個(gè)合適的熒光蛋白（供體和受體），目前應(yīng)用較廣泛的是CFP和YFP，由于CFP和YFP都是在GFP的基礎(chǔ)上改造得來(lái)的，兩者在一定程度上可能存在著同源性，可形成微弱的相互作用，同時(shí)YFP的激發(fā)光也可以激發(fā)出CFP的熒光，這些因素導(dǎo)致CFP/YFP熒光對(duì)的背景干擾較大，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。本研究選取了兩種新型的熒光蛋白mNeon-Green/mKOk作為FRET傳能對(duì)，熒光光譜分析表明mKOk和mNeonGreen的光譜存在重疊區(qū)域，且兩者之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，其中mNeon-Green作為供體熒光，mKOk作為受體熒光。與傳統(tǒng)的傳能對(duì)CFP/YFP相比，mNeonGreen/mKOk背景干擾較低，更適合作為FRET熒光蛋白對(duì)用于蛋白相互作用的檢測(cè)。通過(guò)構(gòu)建并表達(dá)熒光蛋白與目標(biāo)蛋白的融合蛋白，利用FRET技術(shù)成功地在植物細(xì)胞中驗(yàn)證了蛋白與蛋白間的相互作用。

FRET技術(shù)在研究活細(xì)胞單分子之間相互作用的能力已引起人們的廣泛興趣，這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成為一種顯微鏡研究的常用技術(shù)。盡管如此，用FRET檢測(cè)蛋白質(zhì)互作的報(bào)道還非常有限，這表明目前FRET技術(shù)還遠(yuǎn)非一種常規(guī)技術(shù)。在對(duì)FRET效率進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中，檢測(cè)儀器的敏感度、分辨率、參數(shù)設(shè)置以及計(jì)算機(jī)影像采集和分析軟件的能力等都是影響FRET效率的因素。目前，F(xiàn)RET技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用非常少，植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與動(dòng)物細(xì)胞有較大差別，熒光蛋白的選擇，ROI的選取，融合蛋白在葉肉細(xì)胞中的表達(dá)水平等都會(huì)影響FRET的效率和試驗(yàn)的成敗。本研究采用敏化發(fā)射法分析FRET效率，這種方法對(duì)于激光共聚焦顯微鏡的配置要求較低，操作簡(jiǎn)單，但是該法只能定性地判斷2個(gè)蛋白間是否存在相互作用，無(wú)法定量比較蛋白一蛋白相互作用的強(qiáng)弱。就目前而言分析蛋白質(zhì)間的相互作用需要結(jié)合多種不同的方法相互取長(zhǎng)補(bǔ)短才能得出一個(gè)科學(xué)的結(jié)論。

本研究成功構(gòu)建了mNeonGreen和mKOk兩個(gè)熒光蛋白標(biāo)記的載體，建立了一套基于FRET技術(shù)在植物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白一蛋白相互作用的體系，包括融合表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)、激光共聚焦的圖像采集、FRET效率的分析等，為后續(xù)FRET技術(shù)在植物細(xì)胞中的應(yīng)用提供了更多的技術(shù)支持和借鑒。