田野 李貝貝 李霜 農(nóng)向群 張澤華 劉廷輝 王廣君

關鍵詞東亞飛蝗;FK506結合蛋白;金龜子綠僵菌;保護酶

FK506結合蛋白（FK506 binding proteins，F(xiàn)K-BPs）是一類以胞內(nèi)蛋白為主的蛋白質超家族，因其與FKS06（Prograf，普樂可復）的相互作用而得名，它具有肽基脯氨酰順反異構酶（PPIases）活性，可催化多肽或蛋白質底物中的肽一脯氨酸順反子的轉換，從而影響其活性、磷酸化狀態(tài)、蛋白質間相互作用、亞細胞定位及穩(wěn)定性。FKBPs能夠結合環(huán)孢素a（CsA）、FKS06或雷帕霉素，發(fā)揮免疫抑制效應。在免疫細胞中，F(xiàn)KBPs和FKS06的二元復合體共同作用，抑制鈣調磷酸酶（CAN）的活性，進一步作用于磷酸化信號途徑，使免疫細胞產(chǎn)生免疫抑制作用。此外，F(xiàn)KS06結合蛋白還有許多其他重要生理功能，如細胞周期調節(jié)、鈣離子通道活性調節(jié)以及發(fā)育調節(jié)等作用。

金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae作為一類廣譜性的昆蟲病原真菌，對害蟲生物防治具有重要作用。其侵染方式主要有體壁侵入和體內(nèi)增殖兩種。其中體壁侵染機制是金龜子綠僵菌孢子附著在寄主體表后，形成附著胞和侵染釘，在一系列胞外酶的作用下，穿透體壁進人體腔，形成蟲菌體，大量繁殖，消耗寄主營養(yǎng)，并分泌多種毒素，最終造成寄主死亡。研究發(fā)現(xiàn)，采用金龜子綠僵菌制劑可以有效控制蝗蟲為害，但與化學農(nóng)藥相比，存在致死效率低、致死時間長的弊端。其原因一方面是金龜子綠僵菌侵染所需時間較長，另一方面是東亞飛蝗具有較強的免疫防御反應。因此，我們推測可以通過改變蝗蟲體內(nèi)FKBPs的量，抑制東亞飛蝗免疫活性，促進金龜子綠僵菌侵染，達到加速蝗蟲死亡的目的。

本試驗通過定量PCR檢測了FKBP52基因在東亞飛蝗不同組織中的表達情況，克隆了FKBP52基因，并獲得了FKBP52蛋白，研究了其對金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗的影響，以及對東亞飛蝗體內(nèi)免疫相關酶的誘導激活作用，為進一步明確FKBP的功能奠定了基礎，同時對指導蝗蟲防治具有一定的理論意義。

1材料與方法

1.1供試菌株、試蟲與試劑

供試金龜子綠僵菌菌株IMl330189為國外引進在本實驗室長期保藏。培養(yǎng)條件：將菌株接種到PDAY培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，蔗糖20g，酵母粉5g，瓊脂粉20g，補水定容至1000mL，121℃高壓滅菌25min）平板上，25℃下培養(yǎng)5d。收集分生孢子粉，密封貯存于4℃冰箱，備用。

試驗所用東亞飛蝗Locusta migratoria ma-nilensis為本實驗室飼養(yǎng)純化種群，在人工氣候培養(yǎng)箱中于溫度（30±2）℃，相對濕度（60±5）%，光周期L∥D=14h∥10h條件下孵化后，將同一時問孵化的蝗蝻轉移到60cm×50cm×70cm規(guī)格的養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng)，光周期L∥D=14h∥10h，溫度為（30±2）℃。

試劑TRIzol、PrimeScriptTM RT Reagent Kitwith gDNA Eraser、LA-Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）、無RNase純水等均購于TaKaRa公司;感受態(tài)細胞BL21（DE3）、蛋白Marker和Ni-NTA親和層析柱購自北京全式金生物有限公司;大腸桿菌Escherichia coli DH5a和載體pET-21b為本實驗室保存;膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2東亞飛蝗總RNA提取和反轉錄

用TRIzol溶液提取東亞飛蝗成蟲后足、體壁、脂肪體和血淋巴等不同組織、卵塊、1齡蝗蝻蟲體、2～5齡蝗蝻及雌雄成蟲中腸的RNA，并用NanoPhotometer微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gD-NA Eraser說明書方法合成cDNA第1鏈，直接進行后續(xù)試驗或者-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 FKBP52基因在飛蝗成蟲不同組織、不同發(fā)育階段中腸中的表達

基于NCBI中已經(jīng)公布的昆蟲FKBP基因序列，結合本實驗室前期測得東亞飛蝗轉錄組數(shù)據(jù)，獲得FKBP52基因的DNA序列;利用DNAMAN6.0軟件設計熒光定量PCR引物及基因克隆所需引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4東亞飛蝗FKBP52基因克隆

以1.2中合成的成蟲時期東亞飛蝗cDNA作為模板，F(xiàn)KBP52-F、FKBP52-R為引物，PCR擴增FKBP52基因。反應體系（25μL）：10×PCRBuffer 2.5μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，上下游引物（10 gmol/L）各1μL，cDNA1μL，雙蒸水17μL。反應條件為：94℃預變性5min;94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸90 s，共30個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶切膠回收。將純化產(chǎn)物連接到pMD19-T載體。采用熱激轉化法，導人感受態(tài)細胞DH5a中;通過氨芐抗性篩選陽性克隆。將篩選到的陽性克隆進行PCR檢測，正確的送公司測序。從篩選獲得的目標菌株中提取質粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5生物信息學分析

目的基因核酸序列的翻譯以及編碼蛋白質序列結構分析預測采用DNAMAN軟件;蛋白質分子量預測采用https：//web.expasy.org/cgi-bin/prot-param/protparam在線工具;利用SignalP在線軟件信號肽。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BlastP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行氨基酸序列同源性分析，運用在線軟件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/smart/set）分析保守結構域。

1.6 FKBPS2蛋白表達與純化

從測序正確的轉化子中提取質粒，以該質粒為模板，用分別帶有EcoR工和HindⅢ酶切位點的引物FKBP52-F/FKBP52-R進行PCR，擴增FKBP52全長基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測無誤后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收，用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切。將酶切產(chǎn)物回收，與pET-21b載體進行連接，構建重組表達載體。采用熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21，涂板、挑單克隆檢測。將陽性克隆在LB（Amp）液體培養(yǎng)基中37IC培養(yǎng)至為0.5～0.6時，加入IPTG，至終濃度為0.5 mmol/L，16℃進行誘導表達12h。離心收集菌體，超聲波破碎（300w，超聲持續(xù)5s，暫停5s，重復99個循環(huán)）后，4℃，9000r/min離心10min，取上清。用鎳柱親和層析進行蛋白純化，用SDS-PAGE電泳檢測所純化蛋白濃度。

1.7金龜子綠僵菌與FKBPS2組合對東亞飛蝗生物活性測定

采用金龜子綠僵菌IMI330189孢子懸浮液單次背板點滴和FKBP52蛋白飼喂3齡東亞飛蝗的方法來測定FKBP52對金龜子綠僵菌的毒力影響，稱取0.5g金龜子綠僵菌孢子粉于0.05%的吐溫80溶液中，用渦旋儀使其混合均勻，隨后用血球計數(shù)板進行計數(shù)，配制成終濃度為4.15×10個/mL的金龜子綠僵菌孢子懸浮液。FKBP52蛋白測定濃度后，配制成終濃度為1mg/mL的蛋白液。共設3個處理1個對照。

處理1：金龜子綠僵菌孢子懸浮液背板點滴，餌劑為1g含5%植物油的無菌麥麩;處理2：FKBP52蛋白飼喂，餌劑為1g含5%植物油的無菌麥麩+1mL的FKBP52蛋白;處理3：同時進行金龜子綠僵菌孢子懸浮液背板點滴和FKBP52蛋白飼喂，餌劑為1g含5%植物油的無菌麥麩+1mL的FKBP52蛋白;對照：同時進行0.05%的吐溫80溶液背板點滴和大腸桿菌BL21（DE3）（含有pET-21b空載體）誘導表達的菌體飼喂，餌劑為1g含5%植物油的無菌麥麩+1mL終濃度為1mg/mL的空載體誘導表達的蛋白。不同處理中金龜子綠僵菌孢子用量和FKBP52蛋白濃度見表2。對照和所有處理均重復5次。

將預先饑餓處理12h的3齡東亞飛蝗蝗蝻按照30頭/筐的標準放人無菌的塑料生測筐中（長×寬×高=30 cmX12 cmX9cm），用已消毒的玻璃板蓋好。金龜子綠僵菌單獨處理和金龜子綠僵菌+FKBP52共同處理中的蝗蝻全部以背板點滴的方式接種金龜子綠僵菌IMI330189孢子懸浮液（濃度為4.15×10個/mL），對照組中的蝗蝻全部以背板點滴的方式接種0.05%的吐溫80溶液，每頭蝗蝻接種量為2μL。對照、FKBP52、綠僵菌單獨處理以及金龜子綠僵菌+FKBP52共同處理中分別加入相應的餌劑。根據(jù)試驗設計，24h后將餌劑取出，以新鮮麥苗飼喂至試驗結束，每日記錄蝗蟲的死亡數(shù)與存活數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計10d。試驗于溫度30℃，相對濕度60%，光周期L//D=16h//8h生測室內(nèi)進行。

1.8 FKBP52處理后東亞飛蝗保護酶酶活力測定

按照與1.7相同的方法處理蝗蝻，將3齡蝗蝻分裝，每筐15頭，每個處理重復3次。第2天開始，從每個處理的3個重復中各取1頭蝗蟲，解剖收集中腸，于液氮中研磨，加入預冷的20mmol/L Tris-HCl緩沖液，4℃、15000r/min離心20min，取上清作為酶提取液，以牛血清蛋白BSA為標準蛋白，參照Bradford方法測定每個提取液的蛋白濃度，然后測定酶液中過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，具體測定方法參照試劑盒使用說明書。每個樣品重復測定3次。

1.9數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS19軟件進行單因素方差分析，并選用多重比較進行顯著性差異分析，其中P<0.05表示樣本問存在顯著差異，P%0.01表示樣本間存在極顯著差異。

2結果與分析

2.1 FKBP52在飛蝗成蟲不同組織中和不同發(fā)育時期中腸中的表達分析

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP52基因在雌、雄成蟲的體壁、血淋巴、脂肪體、足、中腸、精巢和卵巢中都有表達，其中在雄成蟲中腸內(nèi)的表達量最高。以FKBP52基因在雄性成蟲體壁中的表達量為標準參量，雄成蟲中腸中FKBP52基因的表達量為體壁中表達量的4.13倍;其次為雌成蟲中腸，相對表達量是雄成蟲體壁中表達量的3.41倍;但雌、雄成蟲中腸的相對表達量無顯著性差異（P>0.05）。FKBP52基因在雌、雄成蟲脂肪體中的相對表達量也較高，分別為雄成蟲體壁表達量的2.79倍和2.71倍，二者之間也無顯著性差異（P>0.05）。FKBP52基因在雌、雄成蟲足中的表達量分別為雄成蟲體壁表達量的1.38倍和1.60倍（P>0.05）。在雌蟲體壁中的表達量與雄蟲體壁之間無顯著差異。但是在雄性精巢和雌性卵巢中的表達量略低于雄蟲體壁。FKBP52基因在雌、雄成蟲血淋巴中的表達量相對較少，分別為雄成蟲體壁表達量的0.77倍和0.38倍（P>0.05）（圖1）。

FKBP52基因在卵塊、1齡蝗蝻蟲體、2～5齡蝗蝻及雌、雄成蟲中腸中都有表達，其中卵塊中表達量最高。以FKBP52基因在1齡蝗蝻中的表達量為標準參量，卵塊中FKBP52基因的表達量為1齡蝗蝻表達量的3.89倍，顯著高于其他齡期（P<0.05）。其次為雌、雄成蟲中腸，F(xiàn)KBP52基因的表達量為1齡蝗蝻表達量的3.09倍和2.91倍，二者之間無顯著性差異（P>0.05）;3齡蝗蝻中腸、2齡蝗蝻中腸、5齡蝗蝻中腸、4齡蝗蝻中腸的表達量依次遞減，F(xiàn)KBP52基因的表達量分別為1齡蝗蝻表達量的0.99，0.81，0.46和0.26倍?？梢姡煌l(fā)育期的轉錄水平中，該基因主要在東亞飛蝗卵和雌雄成蟲中腸中表達（圖2）。

2.2東亞飛蝗FKBP52基因的克隆

通過PCR擴增得到FKBP全長基因。將其連接到pMD19-T克隆載體中，導人大腸桿菌DH5a中，經(jīng)抗性篩選獲得陽性克隆，進行測序。結果表明，該基因長度為1242bp（圖3），編碼413個氨基酸，通過NCBI序列比對，將其命名為FKBP52。利用SMART的序列工具分析FKBP52氨基酸序列，結果顯示FK-BP52蛋白在第38-130位氨基酸、158-247位氨基酸之間存在2個FKBP_C超家族保守結構域，屬于FKBP_C超家族成員之一（圖4下劃線所注）。

2.3 FKBP52蛋白表達與純化

將FKBP52基因插入表達載體pET-21b中獲得重組表達載體pET21b-FKBP52，將其導人大腸桿菌BL21后，經(jīng)IPTG誘導表達，獲得目的蛋白FKBP52。經(jīng)過15%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析，蛋白大小為46 kDa，與預期大小相符。大量提取蛋白，經(jīng)鎳柱親和層析純化，得到FKBP52純蛋白（圖5）。

2.4 FKBP52蛋白對金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗的影響

研究發(fā)現(xiàn)，使用只含F(xiàn)KBP52蛋白的餌劑處理東亞飛蝗，到第10天其累計平均死亡率為2.22%，與對照組（1.11%）無顯著差異（P>0.05）。單獨使用金龜子綠僵菌處理時，東亞飛蝗累計死亡率隨處理天數(shù)增加不斷上升，第10天達到60%，顯著高于FKBP52蛋白單獨處理組和對照組。使用金龜子綠僵菌與FKBP52蛋白同時處理東亞飛蝗時，在二者的共同作用下，東亞飛蝗的累計死亡率迅速上升，到第10天達到93.33%，顯著高于金龜子綠僵菌單獨處理組（P<0.05）（圖6，表3）。上述結果表明FK-BP52蛋白與金龜子綠僵菌共同處理，可以顯著提升對東亞飛蝗的致病力，提高殺蟲效果。

2.5 FKBP52蛋白對東亞飛蝗過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP52單獨處理東亞飛蝗時，第1、4、5天POD酶活力與對照組之問無顯著性差異（P>0.05），第2、3天時POD活力顯著低于對照組（P<0.05）。金龜子綠僵菌單獨處理時，在第3天和第5天東亞飛蝗的POD酶活力顯著高于對照，尤其是第3天時，POD活力達到最高值11.609 u/mg;但在第2天POD的酶活力低于對照;在第1、4天其酶活力與對照無顯著差異。FKBP52與金龜子綠僵菌共同處理時，除第1天外（第1天處理組的POD酶活力與其他處理無顯著差異），第2、3、4、5天，處理組的POD活性都顯著低于對照組（P<0.05），同時在第3-5天，F(xiàn)KBP52與金龜子綠僵菌共同處理組POD活性顯著低于金龜子綠僵菌單獨處理組（P<0.05）（圖7）。

FKBP52單獨處理東亞飛蝗時，第3、4、5天，處理組的SOD酶活力達到10.502、8.644、9.182 u/mg，顯著高于對照組（分別為8.478、7.729、7.662 U/mg）（P<0.05），但在第1、2天時，與對照組之間都無顯著性差異（P>0.05）。金龜子綠僵菌單獨處理時，在第3天和第5天東亞飛蝗的SOD酶活力顯著高于對照，尤其是第3天時，SOD酶活力達到最高值10.769u/mg;在第1天和第4天，SOD酶活力與對照無顯著差異（P>0.05）;但在第2天，處理組的酶活力顯著低于對照組（P<0.05）。FKBP52與金龜子綠僵菌共同處理時，在第1天，處理組SOD酶活力與對照組之問無顯著性差異;但第3、4、5天，處理組的SOD活性顯著低于對照組和金龜子綠僵菌單獨處理組（P<0.05），且從第1天開始呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢（圖8）。

3討論

昆蟲在長期進化中形成了一套獨特的免疫系統(tǒng)使其能夠抵御逆境，擴大分布，并抵抗病原微生物的侵入。隨著分子生物學的發(fā)展，關于昆蟲免疫的主要過程及分子機理逐漸清晰，昆蟲免疫機制的研究成果對于研究飛蝗免疫反應機制具有重要的參考意義。FKS06結合蛋白（FKBP）作為一種免疫調節(jié)蛋白，還參與了生物體內(nèi)眾多重要生理反應，如細胞周期的調節(jié)、鈣離子通道活性的調節(jié)以及生長發(fā)育調節(jié)等。如朱佳證實了FKS06結合蛋白與棉鈴蟲Helicoverpa armigera滯育有關。Li等研究表明FK506結合蛋白在家蠶Bombyx mori每個發(fā)育階段（卵、幼蟲、蛹、成蟲）都有表達，具有重要的調節(jié)作用。隨著對FKS06結合蛋白研究的逐漸深入，其作用機制越來越清楚。劉國通等研究表明，F(xiàn)KS06單獨并不能發(fā)揮免疫抑制作用，它需要先與FKBP12結合才能發(fā)揮作用，當FKS06與FK-BP12結合后，F(xiàn)K506特有的立體化學結構就會抑制FKBP12的肽基脯氨酰順反異構酶活性，F(xiàn)KBP12在FK506的免疫抑制作用中發(fā)揮關鍵作用。本實驗室前期驗證了FKBP可抑制鈣調磷酸酶活性，進一步誘導東亞飛蝗滯育。鈣調磷酸酶可以與Toll途徑下游Dorsal結合并使其去磷酸化，使轉錄因子Dif轉移至細胞核，調節(jié)抗菌肽、防衛(wèi)素、防御素等基因的表達。因此，我們推測FKBP作為鈣調磷酸酶抑制劑會影響飛蝗體液免疫Toll途徑級聯(lián)反應，促進金龜子綠僵菌的侵染。

本試驗克隆得到了長度為1242bp，含有完整FKBP_C結構域的一段FKBP序列，經(jīng)過NCBI檢索，確定克隆出的蛋白是FKBP_C超家族成員之一，與黑腹果蠅Drosophila melanogaster、家蠶中預測的結構相同;通過原核表達獲得FKBP52蛋白，SDS-PAGE檢測結果表明，該蛋白分子量46 kDa，與推測的分子量大小一致。通過對FKBP52基因在飛蝗不同發(fā)育時期和成蟲不同組織中的相對表達量分析，發(fā)現(xiàn)FKBP52蛋白在中腸和脂肪體中的表達量相對較高。脂肪體是昆蟲重要的免疫器官。因此，我們推測FKBP52蛋白對飛蝗免疫反應有著重要的作用。通過對FKBP52基因在蝗蟲不同發(fā)育階段中腸內(nèi)的表達情況分析，發(fā)現(xiàn)其在蝗蟲各發(fā)育階段均有表達，但卵期與成蟲期表達量明顯高于幼蟲期，在幼蟲階段的表達量基本相對穩(wěn)定，這與柞蠶Antheraea pernyi中FKBP基因在不同發(fā)育階段的表達譜相一致。

氧化還原反應是昆蟲體內(nèi)重要的化學反應之一，決定著昆蟲的衰老與死亡，也會產(chǎn)生對蟲體有害的活性氧，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基等?；钚匝醯漠a(chǎn)生會對蟲體造成傷害，引起體內(nèi)脂質過氧化，DNA突變和酶失活等。在長期的發(fā)育進化過程中，昆蟲形成了一套完整的保護系統(tǒng)，來清除各種活性氧。過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）作為昆蟲體內(nèi)氧化自由基的清除系統(tǒng)，能夠協(xié)調體內(nèi)氧自由基處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，使機體免受傷害。王龍江等研究表明，紅火蟻Solenopsis invicta被白僵菌Beau-veria bassiana侵染后體內(nèi)CAT、SOD酶活力一直高于對照組，POD則表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。張彥豐等研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌侵染能使蝗蟲體內(nèi)保護酶活力發(fā)生變化，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，蝗蟲免疫降低，最終導致蝗蟲死亡。本試驗通過FKBP52與金龜子綠僵菌共同處理東亞飛蝗發(fā)現(xiàn)，二者共用可以使蝗蟲的死亡率大大提高，且蝗蟲體內(nèi)的POD和SOD酶活力都顯著降低，表明FKBP52蛋白能夠有效抑制蝗蟲免疫能力，能夠作為正調控因子加強病菌的侵入，增強對寄主的致病力，提高死亡率。本研究為金龜子綠僵菌制劑的研制和蝗蟲防治提供了新的思路與借鑒。