高啟帆 孫敬賢 王剛 何歡樂 蔡潤 潘俊松

關(guān)鍵詞黃瓜;黃瓜白粉病菌;抗病基因;侵染過程

黃瓜.為葫蘆科Cucurbitace-ae蔬菜，自20世紀70年代以來，我國黃瓜的栽培面積與總產(chǎn)量始終位居世界第一。由于氣候和種植環(huán)境等原因，黃瓜在生產(chǎn)過程中會受到許多病害的危害，其中白粉病是最為嚴重的真菌病害之一。白粉病的潛育期較短，可以頻繁侵染，具有很強的流行性，在一定條件下可以周年發(fā)生，給黃瓜生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失。引起黃瓜等葫蘆科作物白粉病的病原真菌共有6種，其中主要病原菌是單囊殼白粉菌Sphaerotheca fuliginea和二孢白粉菌Erysiphe ci-choracerum。這兩種白粉病菌寄主范圍廣泛，可引起多種葫蘆科作物如黃瓜和甜瓜發(fā)病，我國黃瓜白粉病致病菌以S.fuliginea為主。

白粉菌是活體寄生菌。在我國南方，病菌以分生孢子或菌絲的形式在寄主上越冬，成為次年侵染源。分生孢子隨氣流、雨水等傳播到寄主葉片上，孢端產(chǎn)生芽管從葉片表皮侵入，產(chǎn)生吸器從寄主吸收營養(yǎng)。分生孢子從萌發(fā)到侵染寄主需24h，3～5d后可于侵染處形成白色病斑，7d后可以形成分生孢子，作為新的侵染源再次傳播。國內(nèi)外學(xué)者對小麥、葡萄白粉病的組織病理學(xué)研究較多。張軍科等對葡萄不同抗性品種的白粉菌侵染過程進行了研究，發(fā)現(xiàn)在接種3d后出現(xiàn)了差異：感病植株的葉片表面菌絲數(shù)量急速增加，并在葉片上表現(xiàn)出白粉癥狀;而在抗病植株的葉片表面，菌絲數(shù)量增加緩慢，不表現(xiàn)出白粉癥狀。并且研究發(fā)現(xiàn)，白粉病菌可以在感病材料上完成整個侵染過程。初慶剛通過超薄切片法以及透射電鏡技術(shù)觀察超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)白粉菌在抗病和感病小麥品種的表皮細胞內(nèi)均能形成完整的吸器結(jié)構(gòu)，其中在高感品種中均能成功侵染，只要病原菌成功侵入，均能形成吸器以及其他結(jié)構(gòu);而在中抗品種中可以觀察到不成功的侵染案例，即病原菌在侵入后卻未能形成完整的吸器結(jié)構(gòu)。莫熙禮等通過分析白粉菌侵染后不同抗性辣椒品種上防御酶活性的變化以及白粉菌與辣椒互作機制的研究，發(fā)現(xiàn)白粉菌接種辣椒12h后分生孢子萌發(fā)，進而產(chǎn)生芽管以及附著胞，在24h后形成菌絲，并且分布在菌絲周邊的一些蠟質(zhì)組織逐漸被溶解，120h后菌絲上出現(xiàn)分生孢子梗。

黃瓜白粉病抗性受多個抗性位點控制，但是大部分研究僅限于QTL定位，目前只有隱性抗病基因pm5.1（CsML01）被成功克隆并進行了功能驗證。近期本研究組成功克隆了另一個白粉病抗性基因PM5.2，為顯性抗病基因，并通過轉(zhuǎn)基因黃瓜對其功能進行了驗證（未發(fā)表）。因此，為了研究不同抗性遺傳背景下黃瓜對白粉病的抗性，本研究選取4種遺傳背景共7份黃瓜自交系，進行白粉病抗性鑒定，分析其對白粉病抗性的差異。同時，為了研究白粉菌對黃瓜葉片的侵染過程及不同時間點的生長狀態(tài)，我們將白粉菌分生孢子接種到這7份黃瓜自交系葉片上，觀察病原菌在不同抗性的黃瓜材料上的侵染差異，進一步推測pm5.1和PM5.2的遺傳關(guān)系，為揭示黃瓜抗白粉病分子機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本研究的黃瓜材料均為自交純系，由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院黃瓜課題組提供。‘S05‘NILS05-1和‘NILS05-2為歐洲溫室型黃瓜?！?930‘S1003‘NILSl003-1和‘NILSl003-2為華北類型黃瓜。這7份材料的PM5.1/Pm5.1（簡稱A/a）和PM5.2/pm5.2（簡稱B/b）基因型見表1?！甆ILS05-1和‘NILS05-2是‘S05的近等基因系，‘NILS05-1中原‘S05的PM5.1（顯性）位點被‘S1003的pm5.1（隱性）位點代換;‘NILS05-2中原‘S05的PM5.1和pm5.2位點分別被‘s1003的pm5.1和PM5.2代換?！甆ILS1003-1和‘NILSl003-2是‘S1003的近等基因系，‘NILS1003-1中原‘S1003的pm5.1位點代換成‘S05的PM5.1;‘NILSl003-2中原‘S1003的PM5.2位點代換成‘S05的pm5.2。

黃瓜白粉病菌采集自田間發(fā)病黃瓜植株，接種到感病自交系‘S05植株上，并在5 000 lx，光周期L//D=16h//8h培養(yǎng)箱中通過連續(xù)單斑分離3次的方式進行純化和繁殖。

1.2黃瓜對白粉病抗病性鑒定

將黃瓜種子播種于營養(yǎng)缽中，澆足營養(yǎng)液并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為白天25℃/夜晚20℃，光周期L//D=16h//8h。待幼苗長至3片真葉時進行接種。采用孢子懸浮液噴霧接種法。選取自然條件下嚴重感病的黃瓜植株，從葉片上收集白粉菌，用毛筆將新鮮的白粉菌孢子收集到盛有無菌水的錐形瓶中，加入1滴吐溫-20。用血球計數(shù)板計數(shù)孢子懸浮液的濃度，將分生孢子懸浮液濃度調(diào)整為1×10。個/mL。用手持噴霧裝置將孢子懸浮液均勻噴灑到黃瓜葉片。病情指數(shù)統(tǒng)計參考Morishita的研究方法。接種后保持較高濕度48h，15d后調(diào)查發(fā)病情況。白粉病的發(fā)病情況劃分為5個等級：0級，沒有可見的白粉病菌感染癥狀;1級，少于6%的葉面積感染;2級，6%～25%的葉面積感染;3級，26%～50%的葉面積感染;4級，50%以上的葉面積感染。每個材料調(diào)查6株，共3次重復(fù)。病情指數(shù)（DD計算公式為：

1.3分生孢子在不同抗性黃瓜自交系上的萌發(fā)過程觀察

1.3.1黃瓜白粉病菌孢子接種

接種方法同1.2。在接種后0、6、12、24、48、72、96、120h，用打孔器在葉片上分別取樣，將葉盤放于10mL離心管中。每個處理的材料各取3株，每株選取一個葉片，一個葉片上取3個葉盤，共9次重復(fù)。

1.3.2葉盤染色及顯微觀察

利用臺盼藍染色法對葉盤進行染色。用鑷子將染色后的葉盤夾到載玻片上，正面朝上，然后蓋上蓋玻片。在10×40倍或10×20倍顯微鏡下觀察黃瓜白粉病菌孢子在不同時間點的萌發(fā)狀態(tài)。每個處理各觀察3株，每株觀察3個葉盤，共9次重復(fù)。每個葉盤至少觀察20個孢子。

1.4分生孢子在不同抗性黃瓜自交系上的萌發(fā)率及正常生長的比例

根據(jù)孢子的萌發(fā)進程觀察發(fā)現(xiàn)，在接種后12h，黃瓜白粉病菌孢子的萌發(fā)形態(tài)最易于觀察;接種后48h，菌絲正常生長的形態(tài)最為明顯;接種后96h，菌絲形成明顯的菌落。因此，本研究在接種12h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)率，萌發(fā)率=視野內(nèi)萌發(fā)孢子數(shù)/視野內(nèi)孢子總數(shù)×100%;接種48h后統(tǒng)計菌絲形成率，菌絲形成率=視野內(nèi)形成菌絲的孢子數(shù)/視野內(nèi)孢子總數(shù)×100%;接種96h后統(tǒng)計菌落形成率，菌落形成率=視野內(nèi)形成的菌落數(shù)/視野內(nèi)孢子總數(shù)×100%。侵染方法及觀察方式同1.3.2。每個處理各觀察3株，每株觀察3個葉盤，每個葉盤觀察3個視野，共9次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜自交系抗病性鑒定

7份黃瓜自交系的白粉病抗性鑒定結(jié)果（表1）顯示，基因型為AAbb的‘S05病情指數(shù)最高，達到65.89，表現(xiàn)為高感白粉病;‘NILS05-1的病情指數(shù)略低于‘S05，也表現(xiàn)為高感白粉病，可能存在其他微效基因影響其對白粉病的抗性;基因型為aabb的黃瓜自交系‘NILS1003-2與‘9930均表現(xiàn)為中感白粉病，病情指數(shù)比較接近，且均低于‘S05;基因型為AABB的‘NILS1003-1的病情指數(shù)略低于基因型為aabb的黃瓜材料，但仍高達38.21。肉眼觀察無法區(qū)分‘NILS1003-1與‘9930之間的抗性差異?；蛐蜑閍aBB的黃瓜材料病情指數(shù)最低，表現(xiàn)為抗白粉病。

2.2分生孢子在不同黃瓜自交系上的侵染過程

2.2.1黃瓜白粉病菌在‘9930（aabb）自交系上的侵染過程

黃瓜‘9930自交系植株接種黃瓜白粉病菌孢子后，6h可以觀察到孢子萌發(fā)形成初生芽管（primarygerm tube，PGT）;12h可觀察到附著胞（appresso-rium，App）;24h在附著胞的頂端形成侵染釘（pen-etration peg，Pp）;48h形成菌絲，菌絲在葉片表面擴展;96h可以觀察到菌落（fungal colony，F(xiàn)C）的形成;120h菌絲上形成分生孢子梗（conidiophore，Cdp），產(chǎn)生新的分生孢子，表明黃瓜白粉病菌孢子完成其無性生長周期（圖1）。

2.2.2黃瓜白粉病菌在‘S05（AAbb）及其近等基因系‘NILS05cc1（aabb）與‘NILS05-2（aaBB）上的侵染過程

如圖2所示，在‘S05自交系接種黃瓜白粉病菌孢子后6h可以觀察到孢子萌發(fā)形成初生芽管（PGT）;12h可觀察到附著胞（App）;24h在附著胞的頂端形成侵染釘（Pp）;48h形成菌絲，菌絲在葉片表面擴展;72h可以觀察到菌落（FC）的形成;96h菌絲上開始形成分生孢子梗產(chǎn)孢;120h分生孢子梗（Cdp）的數(shù)量明顯增多，孢子可以完成其無性生長周期。黃瓜白粉病菌在‘S05的感病近等基因系‘NILS05-1（aabb）上的生長過程與‘S05相似，但稍慢于‘S05，接種6h可以觀察到少量孢子萌發(fā)形成初生芽管（PGT）;12h可觀察到附著胞（App）;24h在附著胞的頂端形成侵染釘（Pp）;48h形成菌絲，菌絲依舊開始在葉片表面擴展，但是相對‘S05速度較慢;96h可以觀察到菌落（FC）的形成;120h可以觀察到分生孢子梗（Cdp）的形成，孢子可以完成其無性生長周期。‘S05的抗病近等基因系‘NILS05-2（aaBB）在接種后12h可觀察到少量孢子萌發(fā)形成初生芽管（PGT）;24h有極少數(shù)孢子形成附著胞（App）以及侵染釘（Pp），大部分孢子還停留在初生芽管形成階段;在接種后48、72、96h一直停留在附著胞階段;大部分孢子停止生長，極少數(shù)孢子形成侵染釘，但是長勢較弱;120h才可以觀察到極少數(shù)孢子形成菌絲，視野內(nèi)未見真菌菌落（FC）及分生孢子梗（Cdp），表明黃瓜白粉病菌孢子在抗病自交系上無法完成其無性生長周期。

2.2.3黃瓜白粉病菌在‘S1003（aaBB）及其近等基因系‘NILSl003-1（AABB）與‘NILSl003-2（aabb）上的侵染過程

在黃瓜白粉病菌接種于‘S1003（aaBB）后12h，孢子才開始萌發(fā)，可觀察到少量孢子萌發(fā)形成初生芽管（PGT）;24h有極少數(shù)孢子形成附著胞（APP）以及侵染釘（Pp），大部分孢子還停留在初生芽管形成階段;在接種后48、72、96h白粉菌一直停留在附著胞階段;大部分孢子停止萌發(fā)，極少數(shù)孢子形成侵染釘;在白粉菌侵染120h后才可以觀察到極少數(shù)孢子形成菌絲，視野內(nèi)未見真菌菌落（FC）及分生孢子梗（Cdp），表明白粉菌孢子在抗病自交系‘S1003上無法完成其無性生長周期。黃瓜白粉病菌在‘S1003的感病近等基因系‘NILSl003-1與‘NILSl003-2上的生長過程相似，接種后6h可以觀察到少量白粉菌孢子萌發(fā)形成初生芽管（PGT）;12h可觀察到附著胞（App）;24h在附著胞的頂端形成侵染釘（Pp）;48hN成菌絲，菌絲在葉片表面擴展;96h可以觀察到菌落（FC）的形成;120h可以觀察到分生孢子梗（cdp）的形成，產(chǎn)生新的分生孢子，表明黃瓜白粉病菌孢子完成了其無性生長周期（圖3）。

2.3不同抗性黃瓜材料上白粉病菌的侵染分析

2.3.1不同基因型黃瓜材料上孢子萌發(fā)率的比較

孢子萌發(fā)率的統(tǒng)計結(jié)果（圖4）顯示，在接種黃瓜白粉病菌孢子后12h，感病自交系‘S05（AAbb）葉片上孢子萌發(fā)率最高，為（35.67±6.35）%，顯著高于‘NILS05-1（aabb）與‘NILS05-2（aaBB）上的萌發(fā)率，且‘S05感病近等基因系‘NILS05-1上的萌發(fā)率顯著高于其抗病近等基因系‘NILS05-2上的萌發(fā)率;‘S1003（aaBB）上的萌發(fā)率為（6.61±0.98）%，顯著低于其感病自交系‘NILSl003-1（AABB）與‘NILS1003-2（aabb），且‘NILSl003-1與‘NILS1003-2上的萌發(fā)率之間沒有顯著差異;‘9930（aabb）上的孢子萌發(fā)率為（28.14±7.1）%，顯著低于‘S05上的孢子萌發(fā)率，顯著高于‘S1003與‘NILS05-2上的萌發(fā)率，與‘NILS05-1‘NILSl003-2‘NILSl003-1之間沒有顯著差異。

2.3.2不同基因型黃瓜材料上白粉菌菌絲形成率的比較

孢子菌絲形成率統(tǒng)計（圖5）顯示，在接種黃瓜白粉病菌后24h，感病自交系‘S05（AAbb）葉片上菌絲形成率最高，為（33.9±5.62）%，顯著高于‘NILS05-1（aabb）與‘NILS05-2（aaBB）上的菌絲形成率，且‘S05感病近等基因系‘NILS05-1上的菌絲形成率顯著高于其抗病近等基因系‘NILS05-2上的菌絲形成率;‘S1003（aaBB）上的菌絲形成率為（6.14±1.94）9/6，顯著低于其感病自交系‘NILSl003-1（AABB）與‘NILS1003-2（aabb），且‘NILS1003-1與‘NILS1003-2上的菌絲形成率之間沒有顯著差異;‘9930（aabb）上的菌絲形成率為（27.9±9.71）%，顯著低于‘S05上的菌絲形成率，顯著高于‘S1003與‘NILS05-2上的菌絲形成率，與‘NILS05-1‘NILS1003-2‘NILS1003-1之間沒有顯著差異，這與孢子萌發(fā)率觀察結(jié)果一致。

2.3.3不同基因型黃瓜材料上白粉菌菌落形成率的比較

菌落形成率顯示（圖6），在接種黃瓜白粉病菌后72h，感病自交系‘S05（AAbb）葉片上菌落形成率最高，為（68.26±17.74）%;其余感病自交系（包括aabb和AABB）上的菌落形成率次之，其中，‘9930為（46.73±10.45）9/6，‘NILS05-1為（45.5±9.72）%，‘NILS1003-2為（33.8±7.21）%，‘NILSl003-1為（32.19±9.13）%;抗病自交系（aaBB）‘NILS05-2和‘S1003葉片上的菌落形成率分別為（2.89±0.38）%和（2.64±0.98）%，低于感病自交系的菌落形成率。差異顯著性分析表明，在接種白粉菌后72h，感病自交系‘S05（AAbb）菌落形成率最高，并且顯著高于其他自交系，表明‘S05的感病程度就菌落形成率而言在所測自交系中是最高的;基因型為aabb以及AABB的感病自交系葉片上孢子的菌落形成率也顯著高于抗病自交系，但是基因型為AABB以及aabb的感病自交系之問的菌落形成率差異不顯著，與孢子萌發(fā)率觀察結(jié)果以及菌絲形成率結(jié)果一致。

3討論

本文通過幼苗人工接種黃瓜白粉病菌，鑒定了不同基因型黃瓜材料對白粉病的抗性水平，并觀察了白粉病菌在不同抗感黃瓜材料上的侵染過程。由于白粉病的發(fā)病情況易受環(huán)境影響，因此試驗材料均在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在人工接種之前保證供試材料不受外界白粉病菌的影響。

目前已有白粉菌在小麥和番茄上生長過程的研究，但是白粉菌在黃瓜上的侵染和生長過程的研究還未見報道。本試驗觀察的時間與Jankovics相似，共8個時間點。結(jié)果顯示，當(dāng)感病品系接種白粉菌后12h，孢子可以產(chǎn)生芽管，24h形成菌絲，48h菌絲開始擴展，72h形成菌落，96h出現(xiàn)分生孢子梗，120h分生孢子梗的數(shù)量明顯變多。這與郭衛(wèi)麗等對白粉菌侵染南瓜的結(jié)論一致，也與王吉霞所報道的白粉菌可在5d內(nèi)完成其生長周期的結(jié)論一致。比較‘S05與其近等基因系‘NILS05-1（aabb）和‘NILS05-2（aaBB），‘S1003與其近等基因系‘NILSl003-1（AABB）和‘NILSl003-2（aabb）的白粉菌生長過程，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pm5.1和PM5.2位點均為純合感?。ˋAbb）時，白粉菌孢子萌發(fā)率以及菌絲、菌落形成率最高;當(dāng)其中一個基因純合感病，另一個基因純合抗?。╝abb或AABB）時，雖表現(xiàn)為感病，但病情指數(shù)稍低，白粉菌孢子萌發(fā)率以及菌絲、菌落形成率降低;當(dāng)pm5.1與PM5.2位點均為純合抗?。╝aBB）時，植株表現(xiàn)出抗病，病情指數(shù)較低，并且白粉菌在接種后24h停止生長，只有極少數(shù)形成菌絲，但也無法形成分生孢子梗，說明這2個抗性基因在誘導(dǎo)白粉病抗性方面都是不可或缺的。

周威在研究白粉菌的侵入對不同抗性南瓜品種的病理以及生理影響時發(fā)現(xiàn)：白粉菌的生長變化和品種的抗病性密切相關(guān)，這與本試驗的研究結(jié)果一致。白粉菌孢子在感病黃瓜材料上有較高的萌發(fā)率，并且大部分都能正常生長，形成菌落，最終導(dǎo)致感病材料發(fā)病嚴重;在抗病材料上，白粉菌孢子萌發(fā)率較低，大部分孢子不能形成明顯的菌落，表現(xiàn)為抗白粉病。Nie等對‘S1003以及‘S05中C5ML01基因的啟動子順式元件分析發(fā)現(xiàn)，啟動子含有真菌的激發(fā)子與防御反應(yīng)的響應(yīng)元件，并且提出在黃瓜的pm5.1抗性過程中，胼胝質(zhì)沉積等過程造成細胞壁加厚可能發(fā)揮了很重要的作用，一些基因的表達可能為寄主抵御白粉菌的侵染提供了物理或化學(xué)屏障，從而在細胞壁處阻止了病菌侵入寄主表皮細胞。因此推測，抗感材料在萌發(fā)率以及菌絲形成率上存在的差異可能與抗病基因誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)以及細胞壁加厚有關(guān)。此外抗感材料上白粉菌菌落以及分生孢子梗形成的差異可能與白粉菌是否能成功侵入植株從而吸收營養(yǎng)有關(guān)，白粉菌成功侵入感病材料可以吸收寄主營養(yǎng)，從而完成生長周期，而在抗性材料中侵入失敗導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)不足，從而無法實現(xiàn)正常生長。本研究在抗性材料中也觀察到極少數(shù)菌絲的擴展，可能與植株長勢較弱有關(guān)，導(dǎo)致白粉菌能夠成功侵染極少數(shù)部位，進而實現(xiàn)菌絲的生長。生產(chǎn)中，抗病植株生長后期的葉片上能夠觀察到白粉病斑也可以解釋上述現(xiàn)象。此外，后期可進一步分析抗病表型與抗病基因表達量以及相關(guān)生理生化指標的關(guān)系，進一步分析抗病原因，以期更好的解釋黃瓜對白粉病的抗性機制。