閆思遠，任苗苗，杜 娟，李 金，楊富龍，李嘉泓，顧沛雯

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021)

內生真菌是指在其生活史中某一階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部，且被感染的宿主植物不表現出明顯病害癥狀(至少是暫時)的一類真菌[1]。研究發(fā)現,內生真菌可促進植物生長，增強植物對生物脅迫和非生物脅迫的抗性，并且能給植物提供氮源、碳源等營養(yǎng)物質及一些激素[2]。目前，由于宿主植物生活環(huán)境的多樣性以及內生真菌與宿主植物關系的復雜性，有關內生真菌在植物體內生命活動的研究仍處于探索階段，對內生真菌與宿主植物間的營養(yǎng)代謝關系尚無定論[3]。解決以上問題的關鍵在于建立內生真菌遺傳標記體系，并用于其在宿主植物中侵染定殖規(guī)律和內生機制研究。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作為一種新型報告蛋白，因熒光性能穩(wěn)定，表達與受體細胞種屬無關且檢測方便，目前在研究真菌與宿主相互作用中應用廣泛[4]。Yao等[5]利用GFP標記揭示了交枝頂孢(Acremoniumimplicatum)在番茄根部的內生性。趙興麗等[6]借助GFP標記探究了鉤狀木霉(Trichodermahamatum)ACCC31649在辣椒植株中的定殖能力。隋麗等[7]用GFP標記研究了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)在玉米中的定殖規(guī)律和促生長特性。

表達載體形式的基因轉移是常用的外源基因轉化方式[8]。外源基因在宿主細胞中的表達取決于兩個因素，第一，啟動子與目的菌株的匹配程度；第二，參與基因轉錄全過程的DNA順式作用元件和反式作用元件的影響[9]。因此，篩選與宿主細胞相互匹配的表達載體，是促使外源基因表達的重要前提[10]。2008年，郭麗瓊等[10]分別使用表達載體pAN7-1和pLE-hph轉化銀耳(Tremellafuciformis)，發(fā)現pLE-hph轉化子具有較好的遺傳穩(wěn)定性。2015年，Sun等[11]使用表達載體pTFCM和Pgpd-hph-TtrpC 3300對茯苓(Wolfiporiacocos)進行轉化，結果顯示只有使用表達載體Pgpd-hph-TtrpC 3300才能成功獲得轉化子。2020年，李棟等[12]分別將GFP標簽蛋白表達載體pKD5-GFP、pKD8-GFP、pEC-Gpd、pEC-H3和pEC-Tef轉入蟬棒束孢菌(Isariacicadae)中，通過熒光顯微觀察發(fā)現，pKD5-GFP轉化子的熒光明顯強于其他轉化子。

枸杞內生真菌(Fusariumnematophilum)NQ8GⅡ4是寧夏大學植物病理實驗室從健康寧杞8號枸杞根部分離到的一株高活性功能菌株[13]。該菌株對枸杞膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)等多種植物病原真菌具有較強的拮抗作用，同時還能產生具有抑菌活性的揮發(fā)性物質[14]。本研究采用PEG介導原生質體轉化法分別將pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG 4種攜帶GFP基因的表達載體轉入NQ8GⅡ4菌株中，通過對比4種GFP轉化子的熒光強度、遺傳穩(wěn)定性、拮抗活性和致病性，篩選出適宜NQ8GⅡ4菌株GFP標記的表達載體，以期為研究該菌株在宿主植物中的侵染行為和定殖規(guī)律奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株和表達載體 枸杞內生真菌NQ8GⅡ4(CGMCC No.19271)、枸杞膠孢炭疽菌由寧夏大學植物病理實驗室分離鑒定并保存。表達載體pFL2(含NEO和GFP基因)、pDL2(含HPH和GFP基因)由西北農林科技大學胡小平教授惠贈，表達載體r-KNT(含NEO和GFP基因)由中國農業(yè)大學彭有良教授惠贈，表達載體KNTG(含NEO和GFP基因)由西北農林科技大學趙磊副教授惠贈。

1.1.2 試 劑 潮霉素B(Hygromycin B，HmB)購于德國Roche公司，Miracloth購于美國Calbiochem公司，崩潰酶(Driselase)、溶壁酶(Lyticase)購于美國Sigma公司，LB固體/液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、遺傳霉素(Genetinic，G418)購于北京索萊寶科技有限公司，AxyPrep表達載體DNA小量試劑盒購自美國康寧生命科學有限公司，DH10B大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京博邁德生物技術有限公司，EcoTaq?PCR SuperMix(+dye)購自北京全式金生物技術有限公司。

根據張世杰[15]的方法，配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)、TB3培養(yǎng)基、Bottom Agar培養(yǎng)基、Top Agar培養(yǎng)基、山梨醇-Tris-氯化鈣溶液(STC)和聚乙二醇-Tris-氯化鈣溶液(PTC)。

1.2 試驗方法

1.2.1 NQ8GⅡ4菌株對抗生素的耐受性 融化PDA培養(yǎng)基，待溫度降至45 ℃，加入HmB或G418，使其在培養(yǎng)基中的終質量濃度均分別為0，10，20，30，40，50，60，70，80 mg/L，待培養(yǎng)基冷卻后分別接種直徑為0.5 cm的NQ8GⅡ4菌餅，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況，確定HmB或G418對NQ8GⅡ4菌株的最佳篩選質量濃度。

1.2.2 原生質體的制備 參照徐齊君等[16]的方法并略作調整，制備原生質體。NQ8GⅡ4菌株原生質體的制備條件為：將16 h菌齡的菌絲0.05 g置于1 mL酶解液(30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶)中反應2.5 h；以0.713 mol/L NaCl為穩(wěn)滲劑，所獲得的原生質體使用STC溶液調節(jié)密度為2×107～5×107mL-1，每管200 μL分裝。

1.2.3 原生質體的轉化 參照侯甲男等[17]的方法，略作調整,將NQ8GⅡ4原生質體轉化表達載體。分別吸取20 μg表達載體pFL2、pDL2、r-KNT、KNTG裝入有200 μL NQ8GⅡ4菌株原生質體的離心管中，輕輕混勻，冰上靜置20 min，加入1.25 mL PTC輕微翻轉混勻，冰上再靜置20 min，轉至50 mL離心管中，加入10 mL TB3培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp)，25 ℃、175 r/min培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的原生質體加入融化降溫至45 ℃的Bottom Agar培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp+20 mg/L HmB(或80 mg/L G418))中混勻倒平板。將平板于25 ℃倒置培養(yǎng)2 d后，再鋪10 mL Top Agar培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418))，25 ℃倒置培養(yǎng)7 d后挑取單菌落，轉接到PDA培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418))上復篩2次，能再生的視為轉化子。轉化效率(株/μg)=再生轉化子數量/表達載體的質量。

1.2.4 轉化子的PCR檢測 使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取轉化子菌落DNA。PCR反應體系(25 μL)：2×EcoTaq?PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)(表1)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55～61.4 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。試驗同時設表達載體和野生型菌株對照。PCR產物經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過凝膠成像系統(tǒng)(Azure c200，美國)分析結果。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 轉化子的熒光觀察 使用埋片法[18]或壓片法[19]獲得NQ8GⅡ4野生型菌株和轉化子菌株的菌絲，熒光顯微鏡(Olympus BX51，日本)400倍下觀察，記錄菌絲發(fā)熒光和不發(fā)熒光的轉化子。

1.2.6 轉化子的遺傳穩(wěn)定性檢測 根據研究人員Bernardi-Wenzel等[20]的方法，略作調整，檢測轉化子的遺傳穩(wěn)定性。將野生型及再生的NQ8GⅡ4轉化子接種在含有50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418)的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d，從邊緣挑取菌絲接種于不含抗生素的PDA平板上，重復5次，然后再接種于含有50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418)的PDA平板上，對比繼代后轉化子的生長情況和熒光強度。遺傳穩(wěn)定率=第5代轉化子數目/第1代轉化子數目×100%。

1.2.7 熒光轉化子的拮抗活性測定 根據胡麗杰[21]的方法，采用平板對峙法測定NQ8GⅡ4野生型菌株和轉化子對枸杞膠孢炭疽菌的拮抗活性。

抑菌率=[(對照菌落直徑-各處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-原菌餅直徑)]×100%。

1.2.8 熒光轉化子的致病性檢測 根據崔偉業(yè)等[22]的方法，略作調整，檢測熒光轉化子的致病性。采集健康枸杞葉片，用體積分數75%酒精消毒30 s，再用體積分數7%次氯酸鈉處理8 min，無菌水沖洗5次，吸取5 μL濃度為107個/mL的NQ8GⅡ4野生型菌株或轉化子孢子懸浮液滴加于枸杞葉片上，培養(yǎng)48 h，觀察病斑情況。以滴加無菌水處理的葉片為陰性對照，以滴加枸杞膠孢炭疽菌孢子懸浮液處理的葉片為陽性對照。

1.3 數據處理

采用SPSS 23軟件對試驗數據進行差異顯著性檢驗(Duncan’s，α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 抗生素對NQ8GⅡ4菌株生長的抑制作用

采用生長速率法測定NQ8GⅡ4菌株對抗生素HmB和G418的敏感性。結果(圖1)表明，當PDA平板中含有20 mg/L HmB 或80 mg/L G418時，NQ8GⅡ4菌株生長完全停止。因此，后續(xù)試驗選擇20 mg/L HmB用于pDL2陽性轉化子的初篩，80 mg/L G418用于pFL2、r-KNT和KNTG陽性轉化子的初篩。

圖中數字表示抗生素質量濃度(mg/L)The numbers in the figure indicate concentrations of antibiotic (mg/L)圖1 抗生素對NQ8GⅡ4菌株生長的影響Fig.1 Effect of antibiotic on growth of NQ8GⅡ4 strain

2.2 不同表達載體對NQ8GⅡ4菌株原生質體的轉化效率

不同表達載體對NQ8GⅡ4菌株原生質體的轉化效率見表2。

表2 不同表達載體對NQ8GⅡ4菌株原生質體的轉化效率Table 2 Transformation efficiency of different expression vector transformed into protoplasts of NQ8GⅡ4 strain

由表2可知，將表達載體pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG分別轉入NQ8GⅡ4菌株原生質體后，獲得pFL2轉化子272株、pDL2轉化子57株、r-KNT轉化子73株和KNTG轉化子226株。其中表達載體pFL2和KNTG的轉化效率比較高，分別為13.60和11.30株/μg；表達載體pDL2和r-KNT的轉化效率較低，分別為2.85和3.65株/μg。

2.3 NQ8GⅡ4菌株轉化子的PCR檢測

隨機挑取在50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418)上生長良好的菌落，分別提取菌絲體DNA進行PCR擴增，結果發(fā)現pFL2和pDL2轉化子均可以擴增出500 bp左右的目的條帶，r-KNT和KNTG轉化子均可以擴增出700 bp左右的目的條帶，與表達載體擴增出的條帶相同，而野生型NQ8GⅡ4菌株均未擴增出目的條帶(圖2)。說明GFP基因被成功整合到了NQ8GⅡ4菌株基因組中。

M.DNA Marker；1～15.轉化子；P.表達載體；WT.野生型菌株M.DNA Marker;1-15.Transformants;P.Expression vector;WT.Wild type strain圖2 NQ8GⅡ4菌株轉化子GFP基因的PCR檢測Fig.2 PCR detection of NQ8GⅡ4 transformants with specific GFP primer

2.4 不同表達載體NQ8GⅡ4菌株轉化子的熒光強度

由圖3可知，pDL2轉化子和KNTG轉化子產生的綠色熒光明顯強于r-KNT轉化子，而pFL2轉化子和野生型NQ8GⅡ4菌株均不產生綠色熒光。

圖3 不同表達載體NQ8GⅡ4菌株轉化子的熒光強度Fig.3 Fluorescence intensity of NQ8GⅡ4 transformants with different expression vectors

2.5 4種NQ8GⅡ4菌株轉化子的遺傳穩(wěn)定性

4種NQ8GⅡ4菌株轉化子的遺傳穩(wěn)定性檢測結果見圖4、圖5和表3。

圖4 4種NQ8GⅡ4菌株轉化子的遺傳穩(wěn)定性觀察Fig.4 Observation of mitotic stability of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants

圖5 4種NQ8GⅡ4菌株轉化子在熒光下的遺傳穩(wěn)定性Fig.5 Fluorescence stability of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants

表3 4種NQ8GⅡ4菌株轉化子的遺傳穩(wěn)定性檢測Table 3 Detection of mitotic stability of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants

對獲得的272株pFL2轉化子、57株pDL2轉化子、73株r-KNT轉化子和226株KNTG轉化子進行繼代培養(yǎng)，其中183株pFL2轉化子、51株pDL2轉化子、50株r-KNT轉化子和133株KNTG轉化子均能正常生長，且熒光強度未發(fā)生變化(圖4，圖5和表3)。說明67.28%的pFL2轉化子、89.47%的pDL2轉化子、68.49%的r-KNT轉化子和58.85%的KNTG轉化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性(表3)。

2.6 4種NQ8GⅡ4菌株轉化子對枸杞膠孢炭疽菌的拮抗活性

4種NQ8GⅡ4菌株轉化子對枸杞膠孢炭疽菌的拮抗活性見圖6和表4。

圖6 4種NQ8GⅡ4轉化子對枸杞膠孢炭疽菌的拮抗表現Fig.6 Antagonistic of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants against C. gloeosporioides

表4 4種NQ8GⅡ4轉化子對枸杞膠孢炭疽菌的拮抗作用Table 4 Antagonistic role of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants against C. gloeosporioides

皿內對峙試驗結果(圖6)表明，NQ8GⅡ4野生型菌株和4種轉化子與枸杞膠孢炭疽菌之間均能夠產生明顯的抑菌帶，病原菌的菌絲體分布不均，邊緣明顯變薄，顏色變黃褐色，菌絲的生長受到明顯抑制。其中pDL2轉化子對枸杞膠孢炭疽菌抑制率為58.98%，相對于野生型NQ8GⅡ4菌株(55.29%)略有提升。pFL2轉化子、r-KNT轉化子和KNTG轉化子對枸杞膠孢炭疽菌抑菌率分別為53.29%,54.27%和52.88%，相對于野生型NQ8GⅡ4菌株略有下降,但抑菌率間差異均不顯著(表4)。

2.7 4種NQ8GⅡ4菌株轉化子對枸杞離體葉片的致病性

枸杞離體葉片致病性檢測結果(圖7)表明，4種NQ8GⅡ4菌株轉化子均不能使枸杞葉片發(fā)病，與野生型NQ8GⅡ4菌株無異。

圖7 NQ8GⅡ4菌株轉化子對枸杞離體葉片的致病性Fig.7 Pathogenicity analysis of NQ8GⅡ4 transformants on Lycium barbarum leaves

3 討 論

抗生素敏感性篩選是菌株轉化的必要前提，是影響轉化效率的重要原因之一[23]。但以抗生素作為抗性篩選標記，通常假陽性背景高，為克服篩選假陽性，通常會使用高于其致死濃度的抗生素來篩選轉化子[24]。高靜等[25]在將含50 mg/L HmB Top培養(yǎng)基上長出的菌落挑到含有100 mg/L HmB Top培養(yǎng)基上復篩，獲得了蘋果腐爛病菌(Valsamali)轉化子。徐齊君等[16]在含250 mg/L HmB的Bottom Agar培養(yǎng)基上覆蓋一層含400 mg/L HmB的Top Agar培養(yǎng)基，獲得了GFP標記的尖孢鐮刀菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)轉化子。本研究使用含有20 mg/L HmB或者80 mg/L G418的Bottom Agar培養(yǎng)基初篩，再使用含有30 mg/L HmB或者100 mg/L G418的Top Agar/PDA培養(yǎng)基復篩，獲得pFL2轉化子272株、pDL2轉化子57株、r-KNT轉化子73株和KNTG轉化子226株，經過熒光觀察和PCR檢測，均為陽性轉化子，轉化效率為2.85～13.60株/μg。

由于抗生素抗性基因的差異和表達載體插入位點的不同，在真菌轉化中常常會出現夭折的轉化子。劉海青[26]建立了以潮霉素磷酸轉移酶(HPH)基因作為選擇標記的禾谷鐮刀菌(F.graminearum)遺傳轉化體系，結果表明100%的轉化子可以穩(wěn)定遺傳。S?rensen等[27]以新霉素抗性(NEO)基因建立了禾谷鐮刀菌(F.graminearum)的遺傳轉化體系，結果顯示只有85%的轉化子可以穩(wěn)定遺傳。本研究在轉化NQ8GⅡ4菌株時出現了類似的結果。pDL2轉化子是以HPH基因作為抗性標記的，其轉化子有89.47%可以穩(wěn)定遺傳，而pFL2、r-KNT和KNTG轉化子是以NEO基因作為選擇標記的，遺傳穩(wěn)定率分別為67.28%，68.49%和58.85%，遠低于pDL2轉化子的遺傳穩(wěn)定率。初步分析產生差異的原因可能是，NQ8GⅡ4菌株對潮霉素和遺傳霉素耐藥性存在差異。說明在繼代培養(yǎng)過程中，有10.53%的pDL2轉化子、32.72%的pFL2轉化子、31.51%的r-KNT轉化子和41.15%的KNTG轉化子喪失了對潮霉素或遺傳霉素的抗性，可能是表達載體DNA整合到真菌基因組中一個不穩(wěn)定的區(qū)域；也可能是表達載體DNA插入后被真菌細胞內的酶降解了；還可能是原生質體凝聚融合形成多核體導致繼代培養(yǎng)中丟失了外源DNA[25]。

外源基因在微生物體內進行特異性表達的同時，也會改變轉化菌株的代謝途徑，增強轉化菌株的代謝負荷。在和其他微生物共同生長的情況下，轉化菌株會處于不利地位，反映在生理特性上，即為轉化子拮抗活性和致病性的變化[28]。黃貴修等[29]發(fā)現，外源基因插入使橡膠多主棒孢(Corynesporacassiicola)的拮抗性發(fā)生變化。張曉斐等[30]對構建的蕓薹生鏈格孢(Alternariabrassicicola)轉化子庫進行篩選，發(fā)現有部分轉化子致病力與野生型菌株相比產生了差異。本研究對所獲得的pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG等4種轉化子進行拮抗活性和致病性比較，發(fā)現4種轉化子的拮抗性和致病性與野生型NQ8GⅡ4菌株無明顯差異。

綜上所述，pDL2轉化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能夠產生較強的綠色熒光，拮抗活性和致病性與野生型菌株無差異，可用于研究NQ8GⅡ4菌株與宿主植物的共生機制。

4 結 論

本研究通過PEG介導原生質體轉化法，獲得272株pFL2轉化子、57株pDL2轉化子、73株r-KNT轉化子和226株KNTG轉化子。通過對比4種轉化子的熒光強度、遺傳穩(wěn)定性、拮抗活性和致病性發(fā)現，pDL2轉化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性，產生的綠色熒光較強，拮抗性和致病性與野生型菌株無差異，可用于后續(xù)NQ8GⅡ4菌株在宿主植物中的侵染行為和定殖規(guī)律研究。