成鏡 李季 戴雪梅 徐正偉 周權(quán)男 黃天帶 黃關(guān)青

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地?海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室/熱帶林木種子種苗工程中心海南?？?71101)

巴西橡膠樹（Hevea brailiensis）是大戟科（Euphorbiaceae）橡膠樹屬（Hevea）多年生異花授粉喬木，廣泛種植于熱帶地區(qū)。其所產(chǎn)生的膠乳是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，在國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位［1］。橡膠樹種苗從傳統(tǒng)的種子苗發(fā)展到芽接苗，再到目前的橡膠樹組培苗（橡膠樹自根幼態(tài)無性系）。橡膠樹組培苗是通過花藥和內(nèi)珠被等外植體進行胚性愈傷組織誘導和體細胞胚發(fā)生獲得初生體胚，再以初生體胚為外植體，通過胚到胚的循環(huán)次生體胚發(fā)生繁殖體細胞胚，最后誘導次生胚植株再生來獲得［2］。

在橡膠樹組織培養(yǎng)過程中，污染問題一直伴隨著組織培養(yǎng)過程，污染率的高低不僅影響植株組織培養(yǎng)的效率，更影響組培苗生產(chǎn)成本的高低。PTC3（Plant Tissue Culture Contamination Control）和植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture， PPM）是一種廣譜抗微生物劑，可以殺死細菌和真菌細胞，防止真菌孢子的萌發(fā)，并在較高濃度下能消除內(nèi)源性污染的外植體。PPM 應(yīng)用于甘薯試管苗的移栽煉苗過程，對甘薯試管苗煉苗期的培養(yǎng)基防污染有一定抑制效果［3］。

針對橡膠樹組織培養(yǎng)過程中存在的污染問題，很多學者進行過相關(guān)研究。秦云霞等［4］發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉和山梨酸鉀以及益生菌哈茨木霉菌株13-3-2可以用于降低污染率。添加3%的苯甲酸鈉或山梨酸鉀的培養(yǎng)基可有效防止細菌及部分真菌（包括黑曲霉）污染；在后期馴化練苗過程中，接種的哈茨木霉菌13-3-2 可有效殺死多種污染真菌，使污染苗的成活率提高43%以上。另外使用40%福星乳油對粗糙脈孢霉菌的抑制效果最好，其EC50最??；其次為70%甲基托布津可濕性粉劑；50%撲海因可濕性粉劑，99%惡霉靈可濕性粉劑，50%敵磺鈉可濕性粉劑對其的殺菌效果均一般，50%多菌靈可濕性粉劑無效［5］。黃天帶等［6］為了降低橡膠樹帶芽莖段的污染率，使用1 g/L 多菌靈和800 mg/L羧芐青霉素鈉、500 mg/L噻孢霉素混合后處理外植體，真菌污染率下降了55.29%，細菌污染率下降了4.58%。

姜澤海等［7］為了降低大田中橡膠樹新生樹根的污染率，在常規(guī)消毒前先采用1 g/L 多菌靈對外植體處理2.5 h，再用75%乙醇消毒30 s 及0.1%HgCl2消毒6 min，然后接種到添加0.1%益培隆的固體愈傷誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d 后外植體污染率下降至44.59%，存活率達25.60%。

以上研究的對象分別為完整的橡膠樹組培苗、帶芽莖段、橡膠樹新生跟，研究階段為植株再生階段、啟動培養(yǎng)階段、愈傷誘導階段，而沒有對橡膠樹次生體胚發(fā)生過程中存在的污染及其對次生體胚發(fā)生效率的影響進行研究。本研究旨在通過使用2種新型的抑菌劑研究其對橡膠樹次生體胚發(fā)生過程中存在的污染的防治效果及其對次生體胚發(fā)生效率的影響，以便為后期橡膠樹組培苗生產(chǎn)提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物組培抗菌劑PTC3（品牌：PhytoTechnology，北京西美杰科技有限公司）和植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture， PPM）PPM（上海翊圣生物）。

紅青霉菌是從污染的平板上分離并進行形態(tài)和測序鑒定。污染平板來自于本單位橡膠樹組培苗生產(chǎn)工作室。

橡膠樹次生體胚發(fā)生的材料和方法參考華玉偉等［2］方法。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA提取方法及ITS序列擴增

除了進行形態(tài)鑒定外，還克隆所分離污染菌的tef1 序列，系統(tǒng)進化分析從而鑒定其類別。以CTAB 法提取病菌的基因組DNA，以真菌通用引物Ef728 （5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'） 和Tefla（5'-GCCATCCTTGGGAGATACCAGC-3'） 為 引 物 進 行PCR 擴增。經(jīng)過PCR 產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化及菌落PCR 鑒定后送公司測序。登錄NCBI，將所得序列進行序列相似性比對，并下載相應(yīng)基因序列，用lasergene軟件進行對位排列，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

1.2.2 兩種抑菌劑不同濃度對菌株生長的影響

取經(jīng)28?C 培養(yǎng)4 d 的菌株，加5 mL 無菌水洗下霉菌孢子，依次10 倍稀釋為10?3，使孢子數(shù)約為103個/mL。分別取0.2 mL 孢子懸浮液與20 mL LDA培養(yǎng)基混勻到平板，28℃遮光培養(yǎng)48 h 后備用。在配制1/2 PDA+5 g 酵母粉固體培養(yǎng)基時，分別加入PTC3和PPM2 種抑菌劑，使其濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL/L 和0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 mL/L的含藥培養(yǎng)基，對照為不加藥的培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌備用。用打孔器（直徑10 mm）從備用平板中打取菌餅（將培養(yǎng)好的病原菌，在無菌條件下用直徑10 mm 的無菌打孔器，自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種于含藥平板中央，菌絲面朝下，蓋上皿蓋，置適宜溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。），菌絲面朝下接種于含藥培養(yǎng)基中央，每個平板加一個菌餅，3 次重復，28℃遮光培養(yǎng)，每2天取出測量菌落直徑（用卡尺測量菌落直徑，單位為mm。每個菌落用十字交叉法垂直測量直徑各一次，取其平均值。）

生長抑制率=［（對照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）］/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%

1.2.3 不同抑菌劑濃度對橡膠樹次生體胚發(fā)生的影響

分別設(shè)置PTC3濃度（0.2、0.4、0.6、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL/L） 和PPM 濃 度（0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 mL/L），每個濃度為一個處理，每個處理接種10 皿，每皿接種7 個胚塊外植體，重復3 次。所用培養(yǎng)基采用華玉偉等文獻［2］中的培養(yǎng)基，在25℃下，暗培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計污染情況、出胚愈傷數(shù)、正常胚愈傷數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excell 2003 軟件，序列比對和系統(tǒng)進化樹分析使用Lasergene軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離及鑒定橡膠樹組培的超強污染源

根據(jù)污染源出現(xiàn)的頻率和污染源在培養(yǎng)基上的表型，挑取了組培中常見的污染源進行分離接種，命名為y3。tef1 擴增片段大小約為610 bp，利用NCBI blast 進行序列比較，發(fā)現(xiàn)序列相似性為98%～100%。下載同源基因的fasta 序列，利用軟件Lasergene 軟件進行序列比對分析，采用Neighbor-Joining 方法進行聚類分析，進行1 000次bootstrap 統(tǒng)計學檢驗，結(jié)果顯示，y3 與Penicillium rubens紅青霉歸為一類（圖1）。

圖1 污染真菌ITS 序列的進化分析

2.2 兩種抑菌劑對污染菌的拮抗作用。

從表1 中可以看出，培養(yǎng)2 d，當PTC3抑菌劑濃度為1.0 mL/L 時，對真菌的生長抑制率為18.1%。隨著濃度的增加，生長抑制率逐漸降低。培養(yǎng)5 d 時，PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L 時，對真菌的生長抑制率為22.3%。隨后，隨著抑菌劑濃度的增加呈滑坡勢下降。

表1 PTC3對菌株生長抑制率的影響

從表2 可以看出，培養(yǎng)2 d 時，PPM 抑菌劑濃度為0.6、0.65、0.7、0.85、0.95 mL/L 時，對真菌的生長抑制率分別為18.6%、17.4%、17.2%、19.2%、16.3%。培養(yǎng)5 d 時，所有抑菌劑濃度處理對真菌均沒有生長抑制作用。

2.3 不同抑菌劑濃度對橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響

從表3 可以看出，隨著PTC3抑菌劑濃度的增加污染率呈下降趨勢。出胚率隨著抑菌劑濃度的增加呈先下降，后緩慢增加的趨勢。正常胚率隨著抑菌劑濃度的增加有逐漸增加的趨勢。有效率隨著PTC3抑菌劑濃度的增加呈逐漸升高再降低的趨勢。當PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L 時，污染率為10%、出胚率為30%、正常胚率為20.0%、有效率為7.3%。與對照（CK）相比，污染率降低了36.7%、出胚率降低了14.6%、正常胚率增加了14.7%、有效率增加了6.4%。

表2 PPM對菌株生長抑制率的影響

表3 PTC3對橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響

從表4 可以看出，污染率隨著PPM 抑菌劑濃度的增加呈逐漸降低的趨勢，出胚率、正常胚、有效率隨著PPM抑菌劑濃度的增加呈先升高再降低的趨勢，當PPM 抑菌劑濃度為0.65 mL/L 時，污染率為9.3%、出胚率為33.6%、正常胚率為7.4%、有效率為2.8%。與對照（CK）相比污染率降低37.4%、出胚率增加18.1%、正常胚率降低了1.9%、有效率增加了1.9%。

表4 PPM對橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中，污染問題一直是伴隨著組織培養(yǎng)發(fā)生的，培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室空氣質(zhì)量、起始培養(yǎng)材料、滅菌程序、無菌操作、培養(yǎng)容器的密封情況等因素都會引起組培過程中污染的發(fā)生。本研究通過單菌分離及分子鑒定結(jié)果表明：紅青霉菌是橡膠樹組織培養(yǎng)中常見的污染菌。

從PTC3和PPM 抑菌劑對紅青霉菌的生長抑制率來看，PTC3的抑菌效果較PPM 稍好。但總體上2 種抑菌劑對紅青霉菌的生長抑制率較低，培養(yǎng)2 d，當PTC3抑菌劑濃度為1 mL/L時，對真菌生長抑制率為18.1%。培養(yǎng)5 d，PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L時，對真菌生長抑制率為22.3%。培養(yǎng)2 d 時，PPM抑菌劑濃度為0.6、0.65、0.7、0.85、0.95 mL/L時，對真菌的生長抑制率分別為18.6%、17.4%、17.2%、19.2%、16.3%。培養(yǎng)5 d 時，所有濃度處理均沒有抑菌效果。2 種抑菌劑對紅青霉菌的生長抑制率均較低，可能是因為所使用的濃度均較低。在今后的研究中應(yīng)該增加這2 種抑菌劑的使用濃度。

從2種抑菌劑對橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響研究發(fā)現(xiàn)，當PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L時，污染率為10%、出胚率為30%、正常胚率為20.0%、有效率為7.3%。與對照（CK）相比，污染率降低了36.7%、出胚率降低了14.6%、正常胚率增加了14.7%、有效率增加了6.4%。當PPM 抑菌劑濃度為0.65 mL/L 時，污染率為9.3%、出胚率為33.6%、正常胚率為7.4%、有效率為2.8%。與對照（CK）相比，污染率降低37.4%、出胚率增加18.1%、正常胚率降低了1.9%、有效率增加了1.9%。

在組織培養(yǎng)中，控制污染是要亟待解決的問題，但是，不能因為使用抑菌劑對植物材料的生長產(chǎn)生不良影響。從2種抑菌劑對橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響來看，PTC3和PPM 均有降低污染率和促進體胚有效率增加的作用，PTC3相對于PPM 的效 果 稍 好 一 些。為 探 究 煙 草［8］、白 菜［9］、藍莓［10］、馬鈴薯［11-12］鐵皮石斛［13］開放式組織培養(yǎng)中抑菌劑對組織培養(yǎng)的影響，使用了卡那霉素、頭孢霉素、多菌靈和次氯酸鈉、生物農(nóng)藥大蒜素與化學農(nóng)藥代森錳鋅、50%多菌靈可濕性粉劑、70%代森猛鋅可濕性粉劑、YI-1、57.6%冠菌清干粒劑、50%撲海因懸浮劑、75%百菌清可濕性粉劑、組菌清、植培靈、菌殺光、甲基托布津等抑菌劑，效果因物種和抑菌劑組合和使用濃度而異。除了在商業(yè)化組織培養(yǎng)中使用抑菌劑，在茶樹［14］轉(zhuǎn)化體系中使用2種抑菌劑表明，頭孢噻肟鈉和羧芐青霉素明顯降低茶樹外植體的成活率和增殖率，且呈濃度依賴效應(yīng)；低濃度特美汀（對茶樹外植體的生長和增殖都沒有明顯影響，并能完全抑制發(fā)根農(nóng)桿菌的生長，故特美汀在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用有望提高茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化效率。所以在使用抑菌劑的同時應(yīng)該考慮對外植體生長的影響，否則就會本末倒置，得不到理想的結(jié)果。在組織培養(yǎng)過程中，污染菌并不是單一的菌種，可能是由一種或多種菌組成，所以，在今后的研究中應(yīng)該將抑菌劑進行組合應(yīng)用，這樣防治污染的效果可能會更好。另外，為了不對植物組織培養(yǎng)過程產(chǎn)生不良影響，應(yīng)使用安全、專一、植物源的抑菌劑。

植物組織培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域，在組培中存在經(jīng)費投入多、能源消耗量大、無菌操作需要大量技術(shù)人員等現(xiàn)狀。為了進一步降低組培成本、簡化生產(chǎn)工藝，在組培環(huán)節(jié)中應(yīng)考慮在外植體消毒、培養(yǎng)基支撐物替代與循環(huán)利用、應(yīng)用抗菌劑和抑菌劑抑制培養(yǎng)基及培養(yǎng)物污染、采用自然光照和大棚溫度來代替組培日光燈光照等方面進行探索和研究，為降低植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)成本、節(jié)能降耗提供理論支撐［15］。