白芨種子在3種介質(zhì)上萌發(fā)及生長比較

趙垚　曹小勇　楊國鵬　胡選萍　蔣景龍　秦公偉

摘要：以MS固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和泥炭基質(zhì)為培養(yǎng)介質(zhì)，利用體視顯微鏡觀察并拍照比較白芨種子在3種介質(zhì)上萌發(fā)及生長發(fā)育的差異。結(jié)果表明：（1）種子在固體培養(yǎng)基和泥炭基質(zhì)上萌發(fā)過程相似，順次形成綠色原球莖-葉片-不定根;在泥炭基質(zhì)上不定根及假鱗莖發(fā)生均遲于固體培養(yǎng)基，但葉片生長較快，當(dāng)不定根在莖節(jié)基部發(fā)生時(shí)原球莖基本消失;（2）在液體培養(yǎng)基中種子萌發(fā)后，原球莖膨大形成類似假鱗莖的儲(chǔ)藏性結(jié)構(gòu);播種15d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，白芨種子在固體培養(yǎng)基中萌發(fā)率為80.67%，液體培養(yǎng)基中為89.33%，泥炭基質(zhì)中為62.67%。結(jié)果表明，3種不同培養(yǎng)基質(zhì)的發(fā)育模式存在差異，白芨原球莖是一種類似胚胎的結(jié)構(gòu)，在后續(xù)發(fā)育中可以消失，也可以形成儲(chǔ)藏性結(jié)構(gòu);MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)在不轉(zhuǎn)接情況下可得到大量原球莖，MS固體培養(yǎng)基和泥炭基質(zhì)培養(yǎng)均可得到白芨幼苗，泥炭基質(zhì)培育過程簡單，可大量繁殖。

關(guān)鍵詞：白芨;原球莖;泥炭;真根;假鱗莖;MS培養(yǎng)基;泥炭基質(zhì)

中圖分類號：S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0087-06

作者簡介：趙垚（1994—），女，陜西漢中人，碩士研究生，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：752601809@qq.com。

通信作者：曹小勇，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：caoxyong@163.com

白芨[Bletillastriata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科白芨屬多年生宿根草本植物，其花大色艷，且有肥厚肉質(zhì)的可供藥用的塊莖，具有收斂止血，消腫生肌等功效，用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥狀[1]。白芨不僅藥用價(jià)值高，觀賞價(jià)值也高[2]，也是我國現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)[3]和化妝品工業(yè)的重要原材料[4]。目前白芨種苗繁殖有3種方式：（1）分株繁殖，這是種植戶采用的主要繁殖方式，利用無性繁殖方式逐步積累種苗，該方式存在繁殖速度慢、繁殖系數(shù)低、耗種量大，還與用藥爭奪原料等問題，長期無性繁殖引起病原體積累、種質(zhì)退化[5];（2）植物組織培養(yǎng)，主要以種子在固體培養(yǎng)基上無菌萌發(fā)形成幼苗[6]，或先利用液體懸浮培養(yǎng)得到大量原球莖，再轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成幼苗[7-8];（3）種子繁殖，白芨種子非常細(xì)小且數(shù)量巨大，但成苗時(shí)間長，影響因素多，穩(wěn)定性差，成苗率低[9]，因此在自然條件下白芨種子繁殖較少[10]。

目前，袁寧等對白芨種子在固體培養(yǎng)基上的無菌萌發(fā)進(jìn)行了報(bào)道，利用白芨種子在固體培養(yǎng)基中的萌發(fā)得到白芨試管苗，經(jīng)煉苗、移栽得到白芨幼苗[6，11-14]。王楷等對白芨種子在液體培養(yǎng)基中的萌發(fā)過程也進(jìn)行了報(bào)道，主要利用白芨種子在液體培養(yǎng)基中萌發(fā)得到原球莖，再轉(zhuǎn)接至相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中成苗，最后進(jìn)行煉苗、移栽，形成白芨幼苗，但未對原球莖后續(xù)發(fā)育進(jìn)行觀察[7-8]。另外白芨種子在泥炭中萌發(fā)生長變化的過程未見報(bào)道。鑒于此，本研究在建立白芨種子離體培養(yǎng)（包括MS固體、液體培養(yǎng)）的基礎(chǔ)上，與泥炭中白芨種子的萌發(fā)過程進(jìn)行比較觀察，以了解白芨種子在不同培養(yǎng)基質(zhì)中發(fā)育模式的差異，探討白芨種子適宜的播種基質(zhì)，為進(jìn)一步了解蘭科植物種子萌發(fā)生物學(xué)特性積累資料。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用白芨蒴果于2018年9月采自陜西省漢中市留壩縣（33°37.516′N，106°54.958′E），海拔（972.2±6.2）m的白芨栽培基地，采摘后放入牛皮紙袋，5℃冷藏待用。

1.2種子在3種培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)及觀察

本試驗(yàn)于2019年5月在陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院組織培養(yǎng)室進(jìn)行，選取白芨未開裂蒴果用75%乙醇處理60s，10%NaClO溶液處理20min后，用無菌水沖洗3次。本試驗(yàn)采用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，加入25g/L蔗糖（固體培養(yǎng)基加7g/L瓊脂），pH值5.8～6.0。無菌條件下將約100粒種子分別接入MS固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)4次，液體培養(yǎng)基進(jìn)行靜置培養(yǎng);泥炭基質(zhì)是在20cm×20cm的塑料盆中均勻鋪1層厚約1.5cm的丹麥Pindstrup泥炭土（直徑0～10mm），將約300粒種子均勻散布在泥炭表面，噴水，用保鮮膜封住塑料盆口。所有處理的培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照度為（2500～3000）lx，光照時(shí)間為12h/d。在培養(yǎng)7、15、30、45、60、120、150d時(shí)用LeicaM205C體視顯微鏡觀察并拍照記錄發(fā)育過程。15d統(tǒng)計(jì)白芨種子萌發(fā)率，取約50粒種子進(jìn)行測量統(tǒng)計(jì)萌發(fā)變綠的種子數(shù)量，各重復(fù)3次;計(jì)算公式：萌發(fā)率=（萌發(fā)種子數(shù)/50）×100%;15d后測量不同處理原球莖大小、葉片長度及真根長度，每個(gè)處理每次取樣30個(gè)，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用Digimizer進(jìn)行數(shù)據(jù)測量，使用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1白芨種子在3種介質(zhì)上的萌發(fā)生長

種子在3種介質(zhì)上萌發(fā)初期的發(fā)育過程相近，白芨種子細(xì)小呈紡錘形，種胚呈淡黃色，處于原胚階段，培養(yǎng)3d后種胚轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色（圖1-A），7d后絕大多數(shù)種胚變綠、突破種皮并在原球莖基部出現(xiàn)假根（圖1-B）;15d時(shí)原球莖頂端生長錐逐步發(fā)育形成葉原基，平均長度0.4mm，其長度約是原球莖直徑的1/2。

2.2白芨種子在3種培養(yǎng)基質(zhì)中發(fā)育過程比較

白芨種子在3種培養(yǎng)基質(zhì)中的發(fā)育過程見圖2、表1，白芨種子接種15d，3種培養(yǎng)基質(zhì)中的種子均已發(fā)育成原球莖，并且長出葉原基（圖2-A、圖2-B、圖2-C），液體培養(yǎng)基中原球莖及葉片均明顯小于固體培養(yǎng)基和泥炭基質(zhì);此時(shí)，統(tǒng)計(jì)白芨種子萌發(fā)率：固體培養(yǎng)基為（80.67±3.06）%，液體培養(yǎng)基為（89.33±6.43）%，泥炭基質(zhì)為（62.67±5.03）%;接種后30d，原球莖快速增大，葉片增長，其中液體培養(yǎng)基原球莖增幅最大，達(dá)到242%，原球莖直徑已超過固體培養(yǎng)基和泥炭基質(zhì);泥炭基質(zhì)中葉片生長最快，增幅達(dá)496%，顯著高于MS培養(yǎng)基（P<0.05）;接種后45d，3種介質(zhì)中原球莖大小相近;葉片生長差異較大，與接種30d相比，葉片在泥炭基質(zhì)中生長最快，其次是固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基中生長最慢，僅增長了22%;同時(shí)，固體培養(yǎng)基和泥炭基質(zhì)中白芨均發(fā)育出真根（圖2-D、圖2-F），但在固體培養(yǎng)基中真根長度和數(shù)量均大于在泥炭基質(zhì)中，而液體培養(yǎng)基中沒有真根出現(xiàn)（圖2-E）;接種后60d，MS液體培養(yǎng)基原球莖持續(xù)增大（圖2-H），而泥炭基質(zhì)中原球莖逐漸消失（圖2-I）;液體培養(yǎng)基中葉片比固體培養(yǎng)基和泥炭基質(zhì)中明顯較短（圖2-H）;真根在固體培養(yǎng)基中生長迅速，與45d相比，增長了1.6倍，生根率達(dá)到84.2%（圖2-G），泥炭基質(zhì)中真根生長緩慢，生根率僅21.4%，后期統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，80d時(shí)泥炭基質(zhì)中生根率達(dá)到81.1%，液體培養(yǎng)基中沒有典型真根出現(xiàn)（圖2-H）。

2.3白芨種子在3種培養(yǎng)基質(zhì)中后期生長狀態(tài)

觀察白芨種子培養(yǎng)后期發(fā)育過程，種子在液體培養(yǎng)基中葉片生長受限，不定根很少發(fā)生，原球莖及葉片持續(xù)膨大，形成肉質(zhì)、半透明狀態(tài);一些形成增殖（圖3-A），類似分蘗現(xiàn)象;在液體培養(yǎng)基中偶然會(huì)出現(xiàn)少數(shù)個(gè)體，形成葉片及不定根（圖3-B），這種情況推測是在培養(yǎng)早期種子貼附在培養(yǎng)容器壁上，改變了個(gè)體發(fā)育模式造成的。如圖3-C、圖3-D所示，泥炭基質(zhì)培養(yǎng)150d時(shí)開始出現(xiàn)二級生長點(diǎn)，二級生長點(diǎn)的出現(xiàn)伴隨早期葉片的衰老死亡，原球莖上最早形成的葉片最先開始衰老，接著是第2片葉，以此類推，此時(shí)假鱗莖出現(xiàn)率超過90%;白芨種子在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)120d時(shí)三角瓶中的固體培養(yǎng)基即將耗完，部分白芨幼苗基部原球莖消失，但多數(shù)存在，無假鱗莖出現(xiàn)。

將液體培養(yǎng)呈膨大狀原球莖播種到泥炭基質(zhì)上時(shí)，在其頂部形成一個(gè)或多個(gè)新的子代原球莖（圖4-A），伴隨子代原球莖生長，原來膨大狀母原球莖整體衰老死亡（圖4-B）。白芨種子泥炭培養(yǎng)后期，生長良好。

3結(jié)論與討論

MS培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，能夠在植物胚、原球莖等培養(yǎng)中取得較好效果[15]，液體培養(yǎng)基適用于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[16-17]，泥炭土含有豐富的有機(jī)質(zhì)，可以作為細(xì)小種子萌發(fā)的基質(zhì)。利用MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)白芨種子的報(bào)道很多，張燕等研究發(fā)現(xiàn)，白芨種子萌發(fā)時(shí)首先種胚吸水膨大，顏色轉(zhuǎn)綠，進(jìn)而突破種皮形成原球莖，原球莖長出葉片和根，部分原球莖轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶢钋o，最后成苗[11，18]。聶寧等通過細(xì)胞組織學(xué)觀察白芨種子的萌發(fā)過程，提出白芨種子的發(fā)育過程要經(jīng)過種胚、原球莖、根狀莖和假鱗莖4個(gè)階段[19]。本研究觀察了白芨種子在不加激素的培養(yǎng)介質(zhì)中發(fā)育的過程發(fā)現(xiàn)，首先白芨種子種胚吸水膨脹，接著種胚轉(zhuǎn)綠并且突破種皮形成原球莖，葉原基形成并逐漸長出葉片，15d時(shí)萌發(fā)率達(dá)80.67%，

未能100%萌發(fā)，可能原因是消毒過程中氯化汞對部分種子毒害較大，少數(shù)種子未能接觸到培養(yǎng)基表面，吸收營養(yǎng)不夠。原球莖增長迅速，當(dāng)45d左右長出2張葉，同時(shí)出現(xiàn)真根，60d時(shí)生根率達(dá)到84.2%;在固體培養(yǎng)基上由于培養(yǎng)基提供額外營養(yǎng)，白芨種子不定根和假鱗莖發(fā)生時(shí)間早于泥炭基質(zhì)上的，不定根發(fā)生時(shí)原球莖尚未完全消失;而在泥炭上葉片生長速度較在固體培養(yǎng)基上的快;在泥炭上當(dāng)幼苗形成第3張葉片、原球莖基本消失時(shí)，根在莖節(jié)基部發(fā)生;原球莖消失，意味著原來儲(chǔ)藏其中的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)全部轉(zhuǎn)移。王楷等利用液體培養(yǎng)得到白芨原球莖，進(jìn)而轉(zhuǎn)接到不同的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，最后得到白芨幼苗，因液體培養(yǎng)可以大量得到白芨原球莖，所以此方法可以快速得到較多白芨幼苗[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在液體培養(yǎng)基中白芨種子萌發(fā)后葉片生長受阻，不定根未發(fā)生，原球莖及葉片持續(xù)膨大形成肉質(zhì)、半透明狀態(tài);當(dāng)播種到泥炭上時(shí)，頂部形成新的原球莖，隨著其生長，原來的母原球莖衰老，這個(gè)現(xiàn)象顯示，液體中生長形成的膨大狀原球莖整體上轉(zhuǎn)變成為儲(chǔ)藏性組織，呈現(xiàn)為假鱗莖狀態(tài)。結(jié)果顯示原球莖作為蘭科植物種子萌發(fā)形成幼苗的一個(gè)中間形態(tài)，其留存時(shí)間與個(gè)體營養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)，也與生長環(huán)境相關(guān)。

原球莖最早由Treub提出，用于描述石松（club-moss）胚萌發(fā)形成下側(cè)具毛的塊莖狀結(jié)構(gòu)，Balfour將此概念用于表示蘭科植物種子萌發(fā)形成的小的、球形、塊莖狀的結(jié)構(gòu)[20-21]。原球莖后續(xù)發(fā)育形成幼苗有2個(gè)途徑，一是直接形成幼苗，如附生型蘭屬植物冬鳳蘭（Cymbidiumdayanum）;二是轉(zhuǎn)變形成根狀莖，然后由根狀莖發(fā)育形成幼苗，如建蘭（C.ensifolium）、春蘭（C.goeringii）、墨蘭（C.sinense）、紋瓣蘭（C.aloifolium）[22]。相關(guān)研究者對于原球莖是屬于幼苗還是胚仍然存在不同看法，大多數(shù)研究者認(rèn)為是幼苗，如Batygina等也有認(rèn)為是胚的，郭順星等也認(rèn)為是[23]。依據(jù)筆者所在課題組對白芨種子萌發(fā)的觀察，固體培養(yǎng)基及泥炭基質(zhì)上，葉片直接發(fā)育，而在液體培養(yǎng)基中葉片發(fā)育成儲(chǔ)藏性結(jié)構(gòu)，類似胚的子葉功能，因此可以認(rèn)為，原球莖是一種過渡性結(jié)構(gòu)，原球莖更接近胚的狀態(tài)。它反映的是植物發(fā)育模式的一個(gè)重要特征，即具有更加高的可塑性以應(yīng)對環(huán)境改變。

白芨在生長過程中可以產(chǎn)生大量種子，但種子極微小，結(jié)構(gòu)簡單，無胚乳，一般認(rèn)為不具備自然萌發(fā)所需的養(yǎng)分，種子繁殖較困難[24];張建霞等研究發(fā)現(xiàn)，白芨種子胚細(xì)胞中富含淀粉及大量貯藏物質(zhì)，這些物質(zhì)作為種子萌發(fā)所需的營養(yǎng)被分解代謝，在種子結(jié)構(gòu)簡化，無胚乳的蘭科植物種子中，白芨種子是常規(guī)條件下容易萌發(fā)的類型[25]。李青風(fēng)對白芨原生地萌發(fā)研究發(fā)現(xiàn)，白芨種子在室外通過覆土、覆草可與共生菌作用得到白芨幼苗[26]。?？》宓冗x擇樹皮粉、腐殖質(zhì)、營養(yǎng)土、雞糞和草炭土按體積比為15∶20∶8∶1∶5配成的育苗基質(zhì)，控制空氣溫度20～35℃、濕度為60%～80%，定期噴灑營養(yǎng)液，白芨種子萌發(fā)率可達(dá)到69.7%，其所用草炭土就是本研究中的泥炭土[27]。本研究利用泥炭基質(zhì)進(jìn)行白芨種子萌發(fā)試驗(yàn)，取得良好效果，種子萌發(fā)率可達(dá)62.67%，略低于?？》宓葓?bào)道的萌發(fā)率，但成本更低，過程更加簡單。培養(yǎng)30d可形成2張葉，60d葉片平均長度是固體培養(yǎng)基的1.09倍。45d左右真根開始生長，到80d真根率達(dá)到80%以上。泥炭中營養(yǎng)物質(zhì)對比MS培養(yǎng)基較為匱乏，白芨種子萌發(fā)變綠后營養(yǎng)來源主要是光合作用，其根的生長速度在一定程度上和葉片生長相關(guān)，在出現(xiàn)第2張葉時(shí)真根開始生長。泥炭中白芨幼苗在后期繼續(xù)培養(yǎng)中，120d出現(xiàn)假鱗莖，150d假鱗莖表面出現(xiàn)新的生長點(diǎn)，此生長點(diǎn)發(fā)育為另一假鱗莖。1個(gè)老的假鱗莖后期可能長出1～3個(gè)新的假鱗莖，在其上重新開始分化出葉片和根。同時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)偏向于運(yùn)輸至新的分生組織，造成原有的葉從第1張開始衰老死亡。說明白芨種子在泥炭中直接播種可以得到大量白芨幼苗，且不需要像常規(guī)離體培養(yǎng)一樣進(jìn)行轉(zhuǎn)接、煉苗，省時(shí)省力，簡單可行。

綜上所述，白芨種子在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可得試管苗，及時(shí)煉苗、移栽可形成白芨幼苗，固體培養(yǎng)基表面干燥，種子吸水較為困難，萌發(fā)速度稍慢，流水浸泡3d可使種子種胚吸水膨大，縮短萌發(fā)時(shí)間。在MS液體培養(yǎng)基中種子吸收營養(yǎng)水分速度最快，具胚種子基本全部可以萌發(fā)，接種量大，可在短時(shí)間內(nèi)得到大量原球莖，及時(shí)將大量原球莖分裝至固體培養(yǎng)基可得試管苗，經(jīng)煉苗、移栽最終形成大量白芨幼苗，但操作較為繁雜，成本較高。在白芨液體培養(yǎng)成苗技術(shù)的研究過程中發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)最終形成原球莖抑或試管苗與液體培養(yǎng)基深淺有關(guān)，本研究所采用的較深液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，可得大量原球莖，而不能直接得到白芨試管苗;在泥炭基質(zhì)中白芨種子亦可萌發(fā)，萌發(fā)率低于MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程需控制濕度及溫度，較MS培養(yǎng)基培養(yǎng)更為簡單，且可直接得到大量白芨幼苗，省去煉苗、移栽過程，因白芨果實(shí)中含有大量種子，通過提高接種量可增大白芨種苗的得率，即可以通過此法進(jìn)行白芨種苗的規(guī)?；敝?。

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