北京市平谷區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心（101200）范保瑞 張悅 張成志

上海強(qiáng)生制藥有限公司（200245）王正中

對(duì)乙酰氨基酚是世界衛(wèi)生組織推薦的兒童最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥之一[1]，常用的劑型有片劑、膠囊、口服混懸液及小容量注射液。對(duì)乙酰氨基酚口服混懸液目前國內(nèi)僅有上海強(qiáng)生制藥有限公司生產(chǎn)，為紅色混懸液，黏稠，有甜味、果香味，為保證其口感狀態(tài)適合兒童服用，處方中含有潛溶劑、甜味劑、著色劑、防腐劑、助懸劑等大量輔料。

因?qū)σ阴０被佣垠w（雜質(zhì)A）在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過程中極易產(chǎn)生，對(duì)氯乙酰苯胺（雜質(zhì)B）為原料藥合成時(shí)引入的雜質(zhì)[2]，具有潛在的基因毒性。此外，在現(xiàn)行對(duì)乙酰氨基酚原料藥及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中沒有以上兩種雜質(zhì)的檢測方法。因此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-8]，建立高效液相色譜法，排除輔料干擾并測定其中有關(guān)物質(zhì)及防腐劑含量。建立的方法具有專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、靈敏，可以用于對(duì)乙酰氨基酚口服混懸液的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器 LC20A型HPLC儀，包括SPD-M20A可變波長檢測器（PDA）、Labsolutions色譜工作站（日本島津公司）；CPA225D電子天平（德國sartorius公司）；SevenCompactpH計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100018-201610，含量99.9%）、雜質(zhì)A對(duì)照品（N-(5’-乙酰氨基-6,2’-二羥基-聯(lián)苯)-3-乙酰胺）（Organix公司，VM-459-170，含量89.4%）、雜質(zhì)B對(duì)照品（N-(4-氯苯基)乙酰胺）（Organix公司，D1225CS，含量99.7%）、苯甲酸對(duì)照品（Organix公司，2DH0331，含量100%）、對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)照品（Organix公司，2EA0365，含量100%）、乙腈、三氟乙酸均為色譜純，水為純化水。

附表1 梯度洗脫程序

附表2 回歸方程和線性范圍

附表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

附表4 樣品有關(guān)物質(zhì)和防腐劑測定結(jié)果表

附圖1 高效液相色譜圖。A.對(duì)照品溶液色譜圖；B.供試品溶液色譜圖；C.輔料溶液色譜圖；D.空白溶劑色譜圖；1.對(duì)乙酰氨基酚；2.雜質(zhì)A；3.苯甲酸；4.雜質(zhì)B；5.對(duì)羥基苯甲酸丁酯

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：A為0.1%三氟乙酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速：1.0ml/min，柱溫：35℃，檢測波長：245nm，進(jìn)樣量：20μl。梯度洗脫程序見附表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液取對(duì)乙酰氨基酚口服混懸液，劇烈振搖使混合均勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚160mg），置100ml量瓶中，加稀釋劑50ml，振搖使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液5ml，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液精密稱取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品約32mg、雜質(zhì)A對(duì)照品約32mg和雜質(zhì)B對(duì)照品約6.4mg，置同一500ml量瓶中，加入乙腈50ml振搖使溶解，并用緩沖液定容至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液。精密稱取苯甲酸對(duì)照品約169.5mg和對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)照品約25mg，置于同一50ml量瓶中，加入乙腈5ml振搖使溶解，并用緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為防腐劑對(duì)照儲(chǔ)備液。精密量取有關(guān)物質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液和防腐劑對(duì)照儲(chǔ)備液各5ml，置同一200ml量瓶中，加稀釋劑定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液取對(duì)乙酰氨基酚口服混懸液，劇烈振搖使混合均勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚160mg）和精密加入2.2.2項(xiàng)下的有關(guān)物質(zhì)儲(chǔ)備液2ml，置100ml量瓶中，加稀釋劑50ml，振搖使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液5ml，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 靈敏度溶液精密量取對(duì)照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 空白基質(zhì)溶液取上海強(qiáng)生制藥有限公司提供的空白輔料混合物，按2.2.1項(xiàng)下方法配制空白輔料溶液。

2.2.6 破壞試驗(yàn)儲(chǔ)備液取對(duì)乙酰氨基酚混懸液6.5g，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.7 稀釋劑的配制 0.01mol/L枸櫞酸緩沖液：取枸櫞酸鈉1.1g和枸櫞酸1.3g，加水溶解并稀釋至1000ml，用枸櫞酸鈉或枸櫞酸調(diào)節(jié)pH值至（4.00±0.05）。稀釋劑：0.01mol/L枸櫞酸緩沖液-乙腈（90∶10）。

2.3 靈敏度及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，色譜見附圖1，結(jié)果：供試品溶液中主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度均大于1.5。精密量取靈敏度溶液20μl，注入液相色譜儀，雜質(zhì)B峰的信噪比不低于10，理論板數(shù)不低于5000。表明系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果符合要求，本方法靈敏度較高，可用于雜質(zhì)定量測定。

附圖3 （1）雜質(zhì)A（對(duì)乙酰氨基酚二聚體）；（2）雜質(zhì)B（對(duì)氯乙酰苯胺）

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1 輔料干擾試驗(yàn)取2.2.4項(xiàng)下的溶液，采用上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果空白輔料在本方法所考察的各物質(zhì)峰處無色譜峰，輔料中泡泡糖香精、阿洛拉紅Ac、品紅酸D及高果糖漿的色譜峰較大，應(yīng)予以扣除。故本方法采用Thermo Hypersil GOLD Aq（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，扣除4.5分鐘前的溶劑峰以及相對(duì)保留時(shí)間約為0.8、1.7、1.8、2.0、2.6、2.7的輔料峰。

2.4.2 破壞試驗(yàn) ①未破壞：取樣品6.4756g，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。②酸破壞：取樣品6.4219g，置100ml量瓶中，加1mol/L鹽酸溶液6ml，室溫放置5小時(shí)，加1mol/L氫氧化鈉溶液6ml，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。③堿破壞：取樣品6.4682g，置100ml量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液6ml，室溫放置5小時(shí)，加1mol/L鹽酸溶液6ml，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。④氧化破壞：取樣品6.4123g，置100ml量瓶中，加30%過氧化氫溶液6ml，室溫放置8小時(shí)，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。⑤高溫破壞：取樣品6.4550g，置100ml量瓶中，置105℃放置9小時(shí)，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。⑥光照破壞：取樣品6.4470g，置100ml量瓶中，置254nm紫外燈下照射9小時(shí)，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。以上各溶液按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定。破壞性試驗(yàn)色譜見附圖2。由附圖2可見，各種因素破壞情況下，各峰分離度均大于1.5，雜質(zhì)A峰純度均大于0.99999，表明在各種破壞條件下，已知成分峰與相鄰雜質(zhì)分離度符合要求，方法專屬性較好。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品32.14mg，雜質(zhì)A對(duì)照品36.18mg，雜質(zhì)B對(duì)照品6.70mg，置同一500ml量瓶中，加乙腈50ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻，作為有關(guān)物質(zhì)儲(chǔ)備液。

精密稱取苯甲酸對(duì)照品170.52mg，對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)照品25.27mg，置同一50ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗(yàn)防腐劑儲(chǔ)備液。

用上述兩種儲(chǔ)備液稀釋制成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，依法測定。以檢測質(zhì)量濃度（x,μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性范圍和回歸方程見附表2。

2.6 檢測限和定量限試驗(yàn) 將2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液取適量流動(dòng)相稀釋后按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以信噪比S/N=3∶1測得雜質(zhì)A、雜質(zhì)B，以及防腐劑苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸丁酯的檢測限分別為0.065ng、0.14ng、0.34ng、0.10ng；以信噪比S/N=10∶1測得各成分定量限分別為0.32ng、0.67ng、1.71ng、0.26ng。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品32.14mg，雜質(zhì)A對(duì)照品36.18mg，雜質(zhì)B對(duì)照品6.70mg，置同一500ml量瓶中，加乙腈50ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻，作為有關(guān)物質(zhì)儲(chǔ)備液。

精密稱取苯甲酸對(duì)照品170.52mg，對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)照品25.27mg，置同一50ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為防腐劑儲(chǔ)備液。

精密稱取樣品約6.4g，置100ml量瓶中，精密加入適量上述兩種儲(chǔ)備液，按供試品溶液配制方法進(jìn)行溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制回收率試驗(yàn)溶液，每個(gè)濃度配制3份，共9份溶液，分別測定回收率，測定結(jié)果見附表3。

2.8 耐用性試驗(yàn) 筆者采用在同一臺(tái)色譜儀上分別只微小改變柱溫、流速、流動(dòng)相中三氟乙酸濃度、梯度洗脫程序和不同色譜柱等唯一條件的方式，取2.2項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行試驗(yàn)。其中，色譜柱分別選用了Waters A tlantis T3(4.6mm×150mm，3μm)；Waters XSelect HSS T3(4.6mm×250mm，5μm)和Thermo Hypersil GOLD aQ(4.6mm×250mm，5μm)在不同色譜儀上進(jìn)行檢測。結(jié)果：選定的色譜條件進(jìn)行微調(diào)及選用不同色譜柱后，所檢測到的雜質(zhì)數(shù)目、出峰順序、分離效果和雜質(zhì)及防腐劑峰面積均無明顯變化。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2.1項(xiàng)下方法配制6份供試品溶液（樣品批號(hào)160831165），按2.1項(xiàng)下的方法測定，記錄色譜圖。結(jié)果：六份供試品測定結(jié)果一致，雜質(zhì)A含量RSD=0.3%、雜質(zhì)B未檢出，雜質(zhì)總量RSD=0.6%、苯甲酸含量RSD=0.1%、對(duì)羥基苯甲酸丁酯含量RSD=0.1%。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照2.2.1項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10、20h，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積計(jì)算雜質(zhì)，結(jié)果：A含量RSD=1.9%、雜質(zhì)B未檢出、雜質(zhì)總量RSD=1.6%、苯甲酸含量RSD=0.3%、對(duì)羥基苯甲酸丁酯RSD=0.4%，表明供試品溶液在20h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 樣品測定 按照2.2項(xiàng)下方法分別配制3份不同批號(hào)的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的方法測定，結(jié)果見附表4。

3 討論

3.1 雜質(zhì)限度的確定 本方法所測雜質(zhì)為現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)未考察的新雜質(zhì)，規(guī)定限度為雜質(zhì)A不得過0.1%；雜質(zhì)B（對(duì)氯乙酰苯胺）為原料藥合成時(shí)引入的雜質(zhì)，因其具有潛在的基因毒性，故限值定為不得過0.005%。雜質(zhì)分子式見附圖3。

3.2 溶解方法的探索 為保證取樣均一性，筆者嘗試取樣前要求超聲和劇烈振搖兩種預(yù)處理方法，考慮到超聲可能導(dǎo)致有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果變化，故采用劇烈振搖混合方式使樣品均勻。取本品，劇烈振搖約20秒使分散均勻，稱取本品約6.4g（約5ml），置100ml量瓶中，加稀釋劑約50ml，振搖1小時(shí)。取出后用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，建議采用0.45μm的微孔濾膜過濾，但由于液體較黏稠，為保證過濾效果，采用8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后再過濾的方式，棄去初濾液5ml，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.3 檢測波長的選擇 制備各組分的定位溶液，采用PDA檢測器，進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明：樣品主成分對(duì)乙酰氨基酚最大吸收在243nm，已知雜質(zhì)含量最低的雜質(zhì)B最大吸收為246nm。將檢測波長確定為主成分最大吸收和雜質(zhì)B最大吸收之間且較靠近雜質(zhì)B最大吸收的245nm，在此波長其他組分及破壞試驗(yàn)產(chǎn)生的雜質(zhì)也有較強(qiáng)吸收，選定的檢測波長可行。

3.4 色譜柱的選擇 本方法流動(dòng)相中水的比例較高，宜采用耐水性強(qiáng)的色譜柱，筆者考察了2.8項(xiàng)下的三種色譜柱進(jìn)行檢測。

綜上所述，本方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于對(duì)乙酰氨基酚口服混懸液的質(zhì)量控制。