52種藥食兩用傣族藥急性經(jīng)口毒性評(píng)價(jià)△

李宜航，李光*，俞靜，李學(xué)蘭，唐德英，蘇晶，牟燕*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西雙版納州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 景洪 666100

西雙版納是中國(guó)生物多樣性最豐富的地區(qū)之一，也是世界上植物種類密度最大的地區(qū)之一[1-2]。傣族先民在長(zhǎng)期的生活實(shí)踐中，不斷地探索各種植物的保健功能以適應(yīng)西雙版納地區(qū)炎熱潮濕的環(huán)境，最終形成獨(dú)具特色的傣族飲食與食療文化。目前，傣族常食用的植物可達(dá)100種以上[3]。傣族醫(yī)藥在發(fā)展過(guò)程中，吸收了部分具有保健作用的傣族食物入藥，逐漸形成了“雅解”理論[4]。該理論指出，日常服用排除毒素的藥物可減少發(fā)病、延年益壽，這類藥物稱為“解藥”。

在傳統(tǒng)飲食習(xí)慣和“解藥”思想的影響下，西雙版納地區(qū)有大量的藥用植物以菜肴、茶水或泡酒的形式端上了餐桌，如薄荷、魚腥草幼苗、刺五加、千張紙幼果、龍葵嫩枝葉等。除此之外，還常以腎茶、傣百解、倒心盾翅藤、大劍葉木、劍葉龍血樹葉等泡酒或代茶飲[5-6]。雖然這些藥食兩用植物多數(shù)都開展過(guò)安全性評(píng)價(jià)，但是因食用非藥用部位、樣品處理方式不同、有毒成分含量不明確、基原植物混淆等問題，其食用安全性仍不明確[7]。因此，本課題組通過(guò)查閱云南省地方標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出日常大量食用或安全性報(bào)道較少的52種藥食兩用傣族藥，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》GB/T 15193.3—2014進(jìn)行經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)研究，以期為藥食兩用傣族藥品種的使用和開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，5周齡，體質(zhì)量為(18±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滇)2019-0002]，飼養(yǎng)7 d，給予維持飼料和飲用水，自由進(jìn)食和進(jìn)水，保持室溫為(23±2)℃，相對(duì)濕度為(55±10)%，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。本研究中所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2019003。

1.2 樣品

受試樣品均采自西雙版納地區(qū)，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李學(xué)蘭研究員鑒定，具體信息見表1。

1.3 儀器與試劑

DV215CD型分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)；FD5-3P型凍干機(jī)[金西盟(北京)儀器有限公司]；FORMA900型超低溫冰箱(賽默飛世爾科技有限公司)；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；3K15型離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(泰斯特儀器有限公司)；羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 供試品制備

樣品的處理方式主要依據(jù)其常見的食用方式，生食的低溫干燥或者凍干后粉碎；需加熱烹飪食用的均經(jīng)水提濃縮后用于實(shí)驗(yàn)。其中部分花類樣品質(zhì)地輕，提取物收率極低，經(jīng)水提后烘干粉碎與提取物混合均勻共同用于毒性評(píng)價(jià)。各樣品的處理方法見表1。

表1 藥食兩用傣族藥樣品信息及處理方法

2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

各受試樣品按照最大劑量(最大濃度、最大體積)給予6只小鼠，觀察24 h，無(wú)動(dòng)物死亡的樣品使用限量法進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，若出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象則進(jìn)行半數(shù)致死量(LD50)實(shí)驗(yàn)。

2.3 限量法評(píng)價(jià)毒性

取小鼠10只，雌雄各半，受試樣品以最大劑量給予小鼠。對(duì)照組給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液0.8 mL。給藥后觀察14 d，記錄小鼠的中毒表現(xiàn)，每天飼料、飲用水消耗量和體質(zhì)量變化情況。采用One-way ANOVA法，將各實(shí)驗(yàn)組小鼠日均消耗水、飼料質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體質(zhì)量與對(duì)照組比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 寇氏法測(cè)定LD50

每個(gè)劑量組3只小鼠，按照1∶0.7等比遞減給藥劑量，觀察小鼠全部死亡和不死亡的最高劑量和最低劑量。將最高、最低劑量換算成對(duì)數(shù)后，按照對(duì)數(shù)差分為等距的5個(gè)劑量組，每組6只小鼠。給藥后，觀察動(dòng)物死亡數(shù)和中毒表現(xiàn)，按照公式(1)計(jì)算LD50。

lgLD50=XK-d(∑P-0.5)

(1)

式中，XK為最高劑量對(duì)數(shù)，ΣP為各組動(dòng)物死亡百分比之和，d為組間劑量對(duì)數(shù)值之差。

3 結(jié)果

3.1 限量法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

百花洋紫荊、臭茉莉等45種傣族藥未引起小鼠死亡，其中木薯、銅錘玉帶草組小鼠的日均攝食量明顯減少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示上述2種傣族藥對(duì)小鼠的消化系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的影響。實(shí)驗(yàn)初各組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異，百花洋紫荊、大薊和腎茶組小鼠給藥14 d后體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，但對(duì)小鼠的攝食量和飲水量未產(chǎn)生明顯影響。結(jié)果表明，百花洋紫荊、大薊和腎茶可能會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)成分吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道的腎茶糖苷酶抑制作用一致[8]。各樣品給藥劑量和小鼠飲水、攝食、體質(zhì)量數(shù)據(jù)見表2。

表2 香椿、石梓等45種傣族藥急性毒性限量法測(cè)定結(jié)果

3.2 LD50實(shí)驗(yàn)結(jié)果

苦竹、刺芹等傣族藥提取物給藥后，較高劑量下可引起小鼠死亡，采用寇氏法測(cè)定LD50值，按照國(guó)際化合物經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]，LD50>5000 mg·kg-1為無(wú)毒級(jí)，苦竹、刺芹等7種傣族藥LD50值均大于5000 mg·kg-1，因此,均屬于無(wú)毒級(jí)別(表3)。從毒性反應(yīng)來(lái)看，均涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，刺芹、革命菜的中樞毒性可能與其含有的黃酮類成分的中樞性抑制作用相關(guān)，但是其他5種因報(bào)道較少，尚無(wú)法判斷[10-12]。

表3 苦竹等7種傣族藥對(duì)小鼠的LD50

4 討論

隨著生活水平的日益提高，食療、藥膳、養(yǎng)生學(xué)等已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[13]。西雙版納地區(qū)植物資源豐富，其中不乏有毒植物，常引起中毒事件的發(fā)生[14-15]。明確藥食兩用傣族藥植物的毒性，對(duì)于避免中毒事件的發(fā)生和合理應(yīng)用藥食兩用傣族藥具有重要意義。因傣醫(yī)用藥和傣族飲食習(xí)慣的特殊性，食用的植物部位和入藥部位、食物烹飪與藥物炮制方法存在差異等多方面的因素導(dǎo)致了評(píng)價(jià)藥食兩用傣族藥食用安全性可參考的資料較少。因此，本研究在準(zhǔn)確鑒別植物種類的基礎(chǔ)上，參考慣用的烹飪方法處理食用部位后進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)。

本研究中，香椿等45種藥食兩用傣族藥食用部位經(jīng)過(guò)最大限量實(shí)驗(yàn)，未引起小鼠死亡。其中木薯、龍葵雖然含有毒性成分，但實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)明顯毒性，或許跟加工方法和食用部位有關(guān)[16-18]?？嘀竦?種傣族藥按照LD50也劃分到無(wú)毒級(jí)別。綜上所述，本研究中的52種藥食兩用傣族藥經(jīng)過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)明顯毒性。但是引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡并不能作為毒性評(píng)價(jià)的唯一指標(biāo)。本研究?jī)H開展了急性毒性實(shí)驗(yàn)，所獲得的數(shù)據(jù)十分有限。建議進(jìn)一步開展亞急性毒性或長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)以保障食品安全。