不同煎煮工藝對四君子湯有效成分和免疫調(diào)節(jié)功能的影響△

呂邵娃，郭喬馨，尚爾雨，吳茜，于新，郭玉巖，楊大宇，李永吉*，孫爽*

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081

由于現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的不斷加快，飲食不節(jié)、勞倦過度及久病體虛等多種因素常導(dǎo)致大量的亞健康人群存在脾虛表現(xiàn)，以不思飲食、神疲乏力、脾虛泄瀉及便溏等臨床癥狀為主要特征[1]。四君子湯是治療該類疾病的經(jīng)典名方，出自宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、茯苓、白術(shù)、甘草組成，具有益氣健脾的功效，主治脾胃氣虛證[2]。有文獻(xiàn)記載，四君子湯的水溶性成分主要來源于君藥人參和臣藥甘草[3]。四君子湯為補(bǔ)氣經(jīng)典方劑，對于慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍等疾病療效顯著。能夠改善胃腸的消化和吸收功能、增加胃腸推進(jìn)功能、緩解脾虛證[4]。實(shí)驗(yàn)研究表明，四君子湯可通過調(diào)整細(xì)胞因子間的網(wǎng)絡(luò)平衡，改善胃腸道的內(nèi)分泌功能，減輕胃腸黏膜的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對胃腸黏膜的保護(hù)作用[5-8]。古方記載四君子湯提取工藝為：“水一盞，煎至七分”[9]。然而，古代的單位與現(xiàn)代有一定的差異，因此，具體的加水量、煎煮時(shí)間、浸泡時(shí)間尚不清楚。一般傳統(tǒng)提取工藝都以方中有效成分含量、浸出率為檢測指標(biāo)，然而，中藥方劑成分復(fù)雜，作用機(jī)制尚不明確，僅以化學(xué)成分作為參考指標(biāo)并不能全面評價(jià)制劑工藝[10-11]。本研究結(jié)合《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版的人參和甘草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定指標(biāo)，選擇四君子湯中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和甘草酸含量及浸出率作為理化指標(biāo)[12-14]。

根據(jù)文獻(xiàn)記載，苦寒之藥損傷脾胃，連續(xù)灌服大黃，會出現(xiàn)與臨床相似的“脾氣虛”癥狀[15-17]。已知脾虛可使機(jī)體免疫功能降低，而腸道又是發(fā)揮局部免疫效應(yīng)的重要場所，且脾虛可導(dǎo)致胃腸黏膜分泌功能紊亂。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇苦寒瀉下法復(fù)制大鼠脾虛模型，考察四君子湯提取物對脾虛大鼠腸黏膜CD3陽性細(xì)胞占比的影響；采用L9(34)正交試驗(yàn)法，考察不同煎煮工藝參數(shù)對四君子湯有效成分及胃腸道免疫調(diào)節(jié)活性的影響，為四君子湯后續(xù)的研究提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為(200±20)g，購于青島大潤富城畜牧有限公司，合格證號：11401300029922，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2014-0001。所有關(guān)于大鼠的實(shí)驗(yàn)操作都遵守國際和本地實(shí)驗(yàn)動物使用和保護(hù)委員會頒布的條例，通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批(審批號為2019092805)。

1.2 試藥

四君子湯處方為人參9 g、白術(shù)9 g、茯苓9 g和炙甘草6 g。人參、茯苓、白術(shù)、炙甘草、大黃均購于哈爾濱市同仁堂大藥房，以上飲片經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)訓(xùn)教研室呂邵娃教授鑒定為正品，均符合《中國藥典》2015年版要求，標(biāo)本存放于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

乙腈、甲醇(色譜純，北京迪科馬科技有限公司)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；正丁醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；對照品人參皂苷Rg1(批號：wkq17043802)、人參皂苷Re(批號：wkq17963218)、甘草酸(批號：wkq17052701)均購于四川省維克奇生物科技有限公司，以上對照品純度均大于98%；淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；CD3-FITC抗體(賽默飛世爾科技公司)。

1.3 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；JY5002型電子分析天平(上海光學(xué)儀器廠)；SK8200H型超聲波清洗器(北京康林科技有限公司)；Mettler AE50型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Accuri C6型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選四君子湯最佳提取工藝參數(shù)

以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、甘草酸的含量，浸出率及CD3細(xì)胞百分率為評價(jià)指標(biāo)，在前期確定最佳煎煮次數(shù)為2次后，對影響提取效果的浸泡時(shí)間(A)、煎煮時(shí)間(B)和加水量(C)進(jìn)行考察，每個(gè)因素下設(shè)定3個(gè)水平，其因素水平見表1。采用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表2。

表1 四君子湯提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表2 四君子湯提取工藝L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.2 人參皂苷及甘草酸含量測定

2.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) Agela Venusil XBP C18型色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動相為水(含0.03%甲酸，A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～55.0 min，81%A；55.0～70.0 min，81%～71%A；70.0～110.0 min，71%～60%A)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；人參皂苷Rg1、人參皂苷Re檢測波長為203 nm，甘草酸檢測波長為250 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

在此色譜條件下，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和甘草酸能與雜質(zhì)完全分離，并取得較好的峰形和較高的理論塔板數(shù)。色譜圖見圖1。

圖1 四君子湯供試品與對照品色譜圖

2.2.2供試品溶液制備 取2.1項(xiàng)下1～9號提取方法制備的四君子湯藥液適量，6000 r·min-1離心10 min(離心半徑為8 cm)后取上清液50 mL置于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次，每次50 mL。合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量分次溶解，移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3對照品溶液制備 稱取對照品人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及甘草酸適量，加甲醇制成分別含人參皂苷Rg10.236 mg·mL-1、人參皂苷Re 2.580 mg·mL-1和甘草酸1.712 mg·mL-1的對照品溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4方法學(xué)考察 精密吸取2.2.3項(xiàng)下人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及甘草酸對照品溶液，分別稀釋0、2、4、5、10、15倍，配制成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別取5 μL在2.2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得人參皂苷Rg1回歸方程為Y=823 149X+ 9 662.1，r=0.999(n=5)，人參皂苷Re回歸方程為Y=925 963X-19 115，r=0.999(n=6)，甘草酸回歸方程為Y=3×106X-28 139，r=0.999(n=6)。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及甘草酸對照品質(zhì)量濃度分別在0.016～0.236、0.172～2.580、0.114～1.712 mg·mL-1內(nèi)線性良好；精密度試驗(yàn)RSD分別為2.17%、1.69%、0.92%，表明儀器精密度良好；分別于0、2、4、8、12、24 h對3種指標(biāo)性成分進(jìn)行定量測定，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD分別為2.27%、2.45%和0.91%；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD分別為2.90%、2.42%和2.22%；平均加樣回收率分別為98.75%、100.13%和100.26%，RSD分別為1.82%、0.94%和0.90%。

2.2.5樣品測定 精密量取正交試驗(yàn)湯劑1～9號樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。每份樣品重復(fù)測定3次，根據(jù)線性回歸方程，計(jì)算樣品中各指標(biāo)性成分平均含量。

2.3 浸出物測定

精密量取2.1項(xiàng)下1～9號提取方法制備的四君子湯藥液10 mL(相當(dāng)于生藥量1.40 g)，置于已干燥至恒定質(zhì)量的稱量瓶中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h至恒重，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，根據(jù)公式(1)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑浸出率[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

浸出率=干膏質(zhì)量/凈藥材投入質(zhì)量×100%

(1)

2.4 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1藥品制備 大黃水煎液制備：取一定量的大黃，加10倍水浸泡30 min后，煮沸30 min，濾過。藥渣再加7倍量水煮沸30 min，合并濾液并濃縮至生藥量為1 g·mL-1。

四君子湯供試品溶液制備：按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)工藝對四君子湯進(jìn)行煎煮，將所得的藥液濃縮至生藥量為1 g·mL-1。

2.4.2分組與脾虛模型制備 SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為11組，每組6只，分別為對照組、模型組及實(shí)驗(yàn)1～9組。對照組大鼠每次灌胃給予0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1，2次/d，連續(xù)給予28 d；其余各組大鼠每次灌胃給予大黃水煎液10 mL·kg-1，2次/d，連續(xù)給予14 d，制備脾虛大鼠模型。取造模成功的大鼠隨機(jī)分組。模型組大鼠于第十五天起每次灌胃給予0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1，2次/d，連續(xù)給予14 d；各實(shí)驗(yàn)組大鼠均在第十五天造模成功后灌胃給予相應(yīng)藥物，7.56 g·kg-1(以生藥量計(jì))，連續(xù)給予14 d。以上各組大鼠均自由采食和飲水。

2.4.3CD3細(xì)胞百分率測定 末次給藥后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，開腹，距回盲部5 cm處取回腸組織約20 cm，沿中線剪開腸管，用載玻片刮取腸內(nèi)組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解后用300目銅網(wǎng)濾過，制成腸組織細(xì)胞懸液，3000 r·min-1離心10 min(離心半徑為8 cm)，去上清液，加PBS 10 mL混勻后濾過2次，加入淋巴細(xì)胞分離液3 mL，3000 r·min-1離心10 min(離心半徑為8 cm)，取白色分層，預(yù)冷的PBS洗滌2次，懸浮至1 mL，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL左右，取細(xì)胞懸液1 mL，取專用試管2支，每管中加入細(xì)胞懸液100 μL，然后依次加入CD3-FITC抗體及其同型對照抗體，充分混勻，室溫避光孵育30 min。1500 r·min-1離心5 min(離心半徑為8 cm)，去上清液。用PBS 2 mL洗滌2次，加入PBS 0.5 mL懸起，4 ℃避光1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測，F(xiàn)lowjo 10軟件分析數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 不同煎煮方式四君子湯對脾虛模型大鼠腸組織CD3陽性細(xì)胞占比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和圖2。由結(jié)果可知，模型組CD3陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組與模型組相比均可在一定程度上提高CD3陽性細(xì)胞占比，表明四君子湯可通過增加CD3陽性細(xì)胞占比來改善脾虛所致的胃腸免疫功能紊亂的情況。

注：A.不加FITC-CD3抗體的空白對照組；B～L.對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)1～9組。

表3 各組大鼠回腸組織中CD3陽性細(xì)胞占比

3.2 四君子湯不同煎煮方式對人參皂苷、甘草酸含量及浸出率的影響

隨著浸泡時(shí)間的延長，湯劑中的主要指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度先增加后減??；隨著煎煮時(shí)間的延長，湯劑中人參皂苷Rg1的含量及浸出物不斷增加，而人參皂苷Re和甘草酸的含量不斷減?。浑S著加水量的增加，湯劑中的主要指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度及浸出物有所增加。結(jié)合各組CD3細(xì)胞占比結(jié)果，對四君子湯質(zhì)量進(jìn)行綜合評分及方差分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 不同煎煮方式四君子湯中人參皂苷、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，浸出率及綜合評分

由正交試驗(yàn)直觀分析表明，3個(gè)主要因素對四君子湯質(zhì)量的影響程度依次是A>C>B，D列是空白列，主要作用是減小誤差。再通過表5方差分析表進(jìn)一步分析，因素A對四君子湯的煎煮工藝有顯著影響(P<0.05)，故浸泡時(shí)間確定為2.0 h。因素B、C對四君子湯煎煮工藝的影響不顯著，結(jié)合極差的大小，考慮到節(jié)約能源和時(shí)間的角度等實(shí)際生產(chǎn)情況，可以確定最佳煎煮工藝為A3B1C1，即藥材浸泡2 h，煎煮2次，每次加8倍量水，每次煎煮40 min。

表5 方差分析表

4 討論

脾胃是機(jī)體與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的場所，攝取生命活動過程中所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。胃主“受納”水谷，脾主“運(yùn)化”水谷精微物質(zhì)。脾胃虛證是現(xiàn)代臨床中較為常見的中醫(yī)內(nèi)科疾病，是一組集中反映脾生理功能不足的綜合癥候群。本課題選擇治療脾胃病證的代表方劑四君子湯作為研究對象，方中所含君藥人參主要成分為人參皂苷，具有滋陰強(qiáng)壯、扶正固本的功效，起到健脾養(yǎng)胃、提高患者免疫力的作用；白術(shù)為臣藥，有健脾燥濕的功效；茯苓為佐藥，有抗腫瘤、健脾安神的功效。甘草為使藥，甘緩和中，有抗病毒功效；四藥相輔，溫而不燥，補(bǔ)而不峻，共奏益氣健脾之功，故名四君子湯[18]。四君子湯對治療中醫(yī)內(nèi)科疾病脾胃虛證具有積極的作用，有一定的研究意義。

研究表明，脾虛會導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)紊亂[19]，而T細(xì)胞是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫的主要細(xì)胞成分。其中，CD3細(xì)胞是所有T細(xì)胞的重要標(biāo)志，其分布和數(shù)量可以反映腸黏膜局部的細(xì)胞免疫及體液免疫功能，在T細(xì)胞免疫中起著必不可少的作用[20]。本研究中，大鼠脾虛時(shí)，CD3陽性細(xì)胞占比顯著降低(P<0.01)，說明脾虛大鼠血中的T淋巴細(xì)胞總數(shù)下降，細(xì)胞免疫水平明顯下降[21]。給藥后，與模型組比較，不同煎煮方式的四君子湯對CD3陽性細(xì)胞占比有不同程度的回調(diào)，細(xì)胞免疫水平明顯上升，因此將CD3陽性細(xì)胞占比作為考察藥效學(xué)的指標(biāo)。

在以往關(guān)于優(yōu)化提取工藝參數(shù)的研究中，多采用正交設(shè)計(jì)選取1個(gè)或多個(gè)化學(xué)成分作為評價(jià)指標(biāo)，然而，中藥制劑成分復(fù)雜，僅考察理化指標(biāo)具有局限性。因此，本研究將理化指標(biāo)和藥理活性指標(biāo)相結(jié)合，研究不同煎煮工藝對四君子湯有效成分及其胃腸道免疫調(diào)節(jié)功能的影響，使優(yōu)化的提取工藝參數(shù)更具有評價(jià)效力和合理性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果依據(jù)極差的大小分析，確定出最佳煎煮工藝，為四君子湯的后續(xù)研究提供參考。