解曉霜

摘 ?要：菌株是食品檢測(cè)微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)工作中不可缺少的重要生物資源，常用于培養(yǎng)基的驗(yàn)收、試驗(yàn)對(duì)照、人員培訓(xùn)考核、方法確認(rèn)等方面的質(zhì)量控制。因此為了確保工作菌株的生物特性和純度、實(shí)現(xiàn)工作菌株方便快捷地使用和溯源 ，菌株的相關(guān)管理工作在微生物實(shí)驗(yàn)室就顯得尤為重要，按統(tǒng)一操作程序制備的菌株是微生物試驗(yàn)結(jié)果一致性的重要保證。本文簡(jiǎn)要闡述了食品檢測(cè)微生物室在檢驗(yàn)工作中對(duì)菌株管理和使用的方法。

關(guān)鍵詞：菌株;管理;使用;方法

1前言

CNAS-CL01-A001-2018《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》中明確要求：實(shí)驗(yàn)室必須保存有滿足試驗(yàn)需要的標(biāo)準(zhǔn)菌種/菌株（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物），除檢測(cè)方法中規(guī)定的菌種外，還應(yīng)包括應(yīng)用于培養(yǎng)基（試劑）驗(yàn)收/質(zhì)量控制、方法確認(rèn)/證實(shí)、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、人員培訓(xùn)考核和結(jié)果質(zhì)量的保證等所需的菌株。故菌株的規(guī)范管理和使用直接關(guān)系到食品微生物檢測(cè)的質(zhì)量，以下將從實(shí)際工作中闡述菌株的管理和使用流程和方法。

2標(biāo)準(zhǔn)菌株的獲取

標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)。如：中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）、美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（ATCC）。菌株購(gòu)買(mǎi)前需根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需求制定采購(gòu)計(jì)劃，經(jīng)審批后，向認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外的菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，菌種管理人應(yīng)檢查其名稱、數(shù)量以及每一支的完整性，同時(shí)將菌種的所有信息填寫(xiě)記錄（包括菌種名稱、編號(hào)、數(shù)量、代數(shù)、來(lái)源、接收日期、接收人等），并將其貯存在規(guī)定溫度的冰箱里，首次購(gòu)買(mǎi)的菌株凍干粉一般保存在2～8℃冰箱中。

3標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、復(fù)壯和保存

標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、復(fù)壯或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說(shuō)明或按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行。復(fù)蘇、復(fù)壯應(yīng)選擇營(yíng)養(yǎng)成分豐富且全面的培養(yǎng)基（例如：TSA/TSB/NA/NB/SDB/SDA等），一般不使用選擇性較強(qiáng)的培養(yǎng)基;特殊的一些菌株在普通的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不好，可能還需添加生長(zhǎng)因子。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株復(fù)蘇后應(yīng)先進(jìn)行純度和特性確認(rèn)。純度確認(rèn)包括：平板劃線查看菌落形態(tài)、革蘭氏染色、顯微鏡觀察菌體形態(tài)等;關(guān)鍵特性確認(rèn)可選擇：特征生化反應(yīng)確認(rèn)、試劑盒鑒定、菌種鑒定儀鑒定等。需要注意的是，從開(kāi)啟、復(fù)蘇、復(fù)壯到純度和特性的確認(rèn)，都應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)記錄。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株保藏的方法有很多，包括定期移植法、液體石蠟法、磁珠保藏法、冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏、-80℃低溫保藏法，食品檢測(cè)微生物室一般采用比較多的是磁珠保藏法，并置于-80℃條件下，可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存的目的，一般保存周期可達(dá)10年。方法是取適量復(fù)蘇經(jīng)過(guò)確認(rèn)的菌懸液置于磁珠管中，加蓋充分搖晃，使菌株吸附于磁珠中，再將管中菌液吸出，加蓋并貼上含菌株信息的標(biāo)簽，迅速置于-80℃冰箱保存。菌種應(yīng)設(shè)專人管理，菌種保藏的地點(diǎn)應(yīng)采取一定的措施使非管理者不能輕易獲取，例如加鎖保管，雙人保管等。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周1次轉(zhuǎn)種的工作菌株。每次使用時(shí)取一顆磁珠置于復(fù)蘇液培養(yǎng)即可，并做好記錄。注意取完磁珠盡量在最短時(shí)間內(nèi)將剩余磁珠放回-80℃冰箱中，以防長(zhǎng)時(shí)間的溫度變化對(duì)菌株造成傷害。從保藏機(jī)構(gòu)獲取的凍干菌種為0代菌種，每轉(zhuǎn)接一次增加一代（1代是指將活的培養(yǎng)物接種到微生物生長(zhǎng)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，任何形式的轉(zhuǎn)種均被認(rèn)為傳代一次），工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過(guò)5代，以防止過(guò)度的傳代增加菌株變異的風(fēng)險(xiǎn)。

4標(biāo)準(zhǔn)菌株的衰退和銷毀

菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種衰退。菌種衰退不是突然發(fā)生的，而是從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。菌種衰退的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。合理的育種、選用合適的培養(yǎng)基、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件、采用有效的菌種保藏方法等可以有效的防止菌種的退化。

菌種衰退不是突然發(fā)生的，而是從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。開(kāi)始時(shí)，在群體細(xì)胞中僅有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生自發(fā)突變（一般均為負(fù)變），不會(huì)使群體菌株性能發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代，群體中的負(fù)變個(gè)體達(dá)到一定數(shù)量，發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)群體，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)為嚴(yán)重的衰退。

菌種衰退的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，則表現(xiàn)為產(chǎn)量下降;如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則產(chǎn)生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過(guò)程中會(huì)發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的幾率很低（一般為10-6～10-9），尤其是對(duì)于某一特定基因來(lái)說(shuō)，突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著傳代次數(shù)增加，衰退細(xì)胞的數(shù)目就會(huì)不斷增加，在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢(shì)，最終成為一株衰退了的菌株。造成菌株衰退的原因還包括了表型延遲、質(zhì)粒脫落、連續(xù)傳代、不適宜的培養(yǎng)和保藏條件等。

若標(biāo)準(zhǔn)菌株如果經(jīng)過(guò)確認(rèn)試驗(yàn)證明已經(jīng)老化、退化、變異、污染等或該菌株已無(wú)使用需要時(shí)，應(yīng)及時(shí)滅菌銷毀并做好記錄。

5菌株保藏的基本原則

微生物菌種的操作需符合《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、《人間傳染的病原微生物》和《動(dòng)物病原微生物分類名錄》以及GB 19486的有關(guān)要求。此外針對(duì)微生物菌種的特性選擇適宜的保藏方法，以保持菌種自身性狀的穩(wěn)定。另外微生物菌種的保藏工作不能對(duì)周?chē)沫h(huán)境造成污染和傷害。

6總結(jié)

菌種每次轉(zhuǎn)種傳代，必須做純度、特性等實(shí)驗(yàn)室所需關(guān)鍵指標(biāo)的確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立菌種管理（從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株）的文件和記錄，內(nèi)容包括菌株的申購(gòu)、進(jìn)出、收集、貯藏、確認(rèn)、轉(zhuǎn)種、使用以及銷毀等全過(guò)程。每支菌種都應(yīng)注明其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期、傳代數(shù)，并記錄菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、菌種保藏的位置和條件等信息，同時(shí)全過(guò)程要保證生物安全。

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