肝纖維化的發(fā)病機制及其治療藥物研究進展

司晶，唐露，李臣誠，徐寒梅*

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 211198；2.南京安吉生物科技有限公司，江蘇 南京 210046）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是多種損傷因子持續(xù)作用下的創(chuàng)面愈合反應，以細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的累積以及瘢痕的形成為特征[1]。如果不及時治療，HF 可發(fā)展為肝硬化，并伴有一系列致命并發(fā)癥，如功能性肝功能衰竭、門脈高壓、腹水、肝性腦病，甚至肝細胞癌等[2]。目前尚無有效治療HF 的藥物獲批上市，唯一可行的治療方法是消除慢性應激和肝移植[3]。近年來，越來越多的抗HF 藥物逐步進入臨床研究階段。本文對HF 機制的最新研究以及抗HF 藥物的研發(fā)現(xiàn)狀進行概括和總結，希望能為今后HF 發(fā)病機制研究及相關藥物研發(fā)提供思路。

1 肝纖維化的發(fā)病機制

1.1 炎癥

炎癥反應參與大多數(shù)肝臟疾病的發(fā)病過程，包括病毒感染、化學性肝損傷、創(chuàng)傷和自身免疫性肝病[4]。炎癥反應一開始旨在保護肝臟免受進一步損害，但長期的炎癥是HF 形成和發(fā)展的重要驅動因素[5]。HF 過程中有許多炎癥相關通路被激活，導致肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化和肝內(nèi)膠原沉積[5]。

損傷相關的分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）是健康細胞中涉及多種細胞功能的內(nèi)源性因子。當肝臟受到刺激、損傷，誘導肝細胞凋亡或壞死時，DAMP 被釋放到細胞外介質中，可誘導無菌性炎癥[6]。尤其是肝細胞壞死，它包含一系列線粒體退化、膜電位損失和ATP 耗盡的過程，其特征是細胞腫脹、細胞質凝固和細胞膜破裂，然后在細胞外環(huán)境中釋放細胞內(nèi)容物，相比凋亡可產(chǎn)生更多的炎癥信號[7]。釋放到細胞外的DAMP 在HF 中發(fā)揮作用的方式復雜多樣。首先，DAMP 可以直接激活肝巨噬細胞（Kupffer 細胞，KC），也可以通過誘導炎癥細胞因子和趨化因子的釋放間接作用于肝細胞、HSC 以及DAMP 自身，來進一步誘導HF 的形成和發(fā)展；其次，DAMP 可以促進HSC 產(chǎn)生ECM、Ⅰ型膠原蛋白（Col Ⅰ）、纖維連接蛋白、基質金屬蛋白酶（MMP）-9 和-13、金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）-1 等纖維化相關物質，進一步激活HSC[6]。

1.2 細胞因子

多種細胞因子通過激活HSC 誘導肌成纖維細胞產(chǎn)生ECM 來參與HF 的形成。如轉化生長因子（TGF）-β1、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）、血小板衍生生長因子（PDGF）、腫瘤壞死因子（TNF）等，其中發(fā)揮關鍵作用的細胞因子主要是TGF-β1、PDGF 和IL。

1.2.1 轉化生長因子 TGF-β1 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的促纖維化細胞因子[8]，幾乎涉及HF 的所有關鍵環(huán)節(jié)。TGF-β1 主要通過3 種機制促進肝纖維的形成：1）TGF-β1 通過抑制MMP 以及促進TIMP 的活性來抑制ECM 降解；2）TGF-β1 通過上皮細胞-間充質轉化（EMT）誘導肌成纖維細胞的形成；3）TGF-β1 通過Smad 通路依賴性和非依賴性相關機制誘導ECM 的生成[9]。TGF-β1 對HSC 的主要作用是通過上調Notch 通路和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達刺激靜止HSC 向活化的肌成纖維細胞轉化，促進HSC 合成過量的基質蛋白，如纖連蛋白和Col Ⅰ、Col Ⅲ、Col Ⅳ[10]。TGF-β1 還 可 通 過HSC的AGAP2 因子介導來誘導PDGF 轉錄水平升高，促進PDGF 表達，從而間接促進HSC 的增殖[11]。

1.2.2 血小板衍生生長因子 PDGF 是HF 進展中的關鍵分子之一。在肝損傷期間，肝竇內(nèi)皮細胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）、肝巨噬細胞（Kupffer Cell，KC）和活化的HSC 均能表達PDGF[12]。PDGF 受體（PDGFR）在HSC 膜上表達，通過自分泌機制刺激HSC 的活化[13]。PDGF 結合在相應的受體上，誘導受體二聚和磷酸化，進而磷酸化細胞內(nèi)不同底物上的酪氨酸殘基。PDGFR 的刺激可激活多種信號通路，包括Ras/Raf 系統(tǒng)、磷脂酶C γ（PLCγ）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）通路以及Janus 激酶/信號轉導與轉錄激活子（JAK/STAT）通路。這些下游信號調節(jié)相關促纖維化因子的表達水平，如Col Ⅰ、MMP、TIMP 以及凋亡調節(jié)因子Bcl-2，從而促進HSC 的增殖和存活[14]。

1.2.3 白細胞介素 IL 在HF 中發(fā)揮的作用主要分為促炎和抗炎兩部分。IL-1 和IL-17 家族是重要的促炎因子。IL-1 包含IL-1α、IL-1β 等18 個成員，主要通過上調MMP9、MMP13 和TIMP-1 來促進HSC的成纖維特性。IL-1α 和IL-1β 協(xié)同促進HF。有研究證明，阻斷這兩者的表達可以緩解大鼠的HF[15]。IL-17 通過2 種不同的機制發(fā)揮其促纖維化作用：1）IL-17 可以誘導KC 和其他巨噬細胞表達IL-6、IL-1β、TNF-α 和TGF-β1，間接激活HSC；2）IL-17也可以通過促進HSC 中Col Ⅰ的沉積及α-SMA和TGF-β1 等纖維化相關標記物的表達來直接激活HSC[16]。

IL-10 和IL-22 在HF 中發(fā)揮抗炎作用[17]。在最近的一項研究中，IL-10 被證明可通過上調p53 和p21 的表達來誘導活化的HSC 死亡[18]。另一種抗炎細胞因子IL-22 激活HSC 中的信號轉導及轉錄活化因子3（STAT3），促進HSC 衰老，誘導其死亡。同時，IL-22 通過抑制HSC 中的TGF-β1/Notch 信號通路來抑制HSC 的活化[19]。

IL-6 是一種多效性細胞因子，主要由KC 產(chǎn)生，在急性和慢性炎癥中發(fā)揮的作用相反，即促炎或抗炎。IL-6 是STAT3 的主要激活因子，IL-6/STAT3 信號通路與HF 的形成和HSC 的活化相關[20]。

1.3 整合素

整合素（integrin）是由α 和β 2 個亞基以非共價連接形成的一個跨膜異二聚體蛋白家族，通過細胞膜傳遞雙向信號，是ECM 成分的主要受體[21]。整合素參與細胞黏附和維持組織完整性，在細胞存活、增殖、分化、遷移等生物學過程中也發(fā)揮重要作用[22]。在HF 進程中，整合素主要與ECM 蛋白結合，激活下游信號通路中的相關成員：1）生長因子受體，如表皮生長因子受體（EGFR）、PDGF；2）細胞因子受體，如影響細胞行為的IL-3；3）細胞內(nèi)相應配體，如p130Cas、Grb2；4）胞質酪氨酸激酶，如Src 家族激酶（SFK）及黏著斑激酶（FAK）[23]。這些被激活的受體、細胞因子直接或間接地激活HSC 以及其他成纖維細胞增殖分化為肌成纖維細胞，促進炎癥因子以及ECM 釋放，加快HF 的發(fā)生發(fā)展。

整合素家族由18 個α 亞基和8 個β 亞基通過不同的組合方式組成，已有24 種組合形式被發(fā)現(xiàn)[22]。正常組織中，TGF-β1 與潛在相關肽（LAP）以1∶1 結合成復合物的形式儲存在ECM 中，沒有活性[23]。這些整合素能夠識別并結合TGF-β1 上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，從而激活TGF-β1，發(fā)揮促纖維化的作用[24]。成纖維細胞主要表達4 種包含av 亞單位的整合素：avβ1、avβ3、avβ5 和avβ8。研究發(fā)現(xiàn)，使活化的成纖維細胞丟失所有的含av 亞單位整合素，可以保護小鼠包括肝臟在內(nèi)的多個器官免受纖維化，并且這種作用與組織中TGF-β1 信號的減少有關[23]。其中，avβ1 由于難以制備抗體，其功能一直被忽略。Reed 等[24]通過特殊方式制備avβ1 抑制劑，研究證明avβ1 是幾種原代成纖維細胞上的主要整合素，在HF 進程中TGF-β1 的活化步驟發(fā)揮重要作用。通過抑制avβ1可以很好地治療博來霉素誘導的小鼠肺纖維化以及四氯化碳誘導的小鼠HF。這項研究提示，除了avβ3、avβ5 和avβ8 之外，avβ1 也是治療HF 的關鍵靶點。

1.4 以肝星狀細胞為中心的各類型細胞在肝纖維化中的作用

HF 的形成原因復雜多樣，發(fā)病機制目前尚不明確。隨著對HF 的研究深入，不斷有新的參與HF的細胞、因子、蛋白、信號通路等被研究發(fā)現(xiàn)。但自1971 年HSC 與HF 的關系被發(fā)現(xiàn)以來，其在HF中的主角地位從未被撼動。大多數(shù)HF 是由HSC 的激活驅動的。HSC 又稱Ito 細胞、肝臟貯脂細胞，位于肝竇內(nèi)皮細胞與肝細胞之間的竇周（Disse）間隙內(nèi)，約占肝臟細胞的10%[25]。生理狀態(tài)下，HSC表現(xiàn)為非增殖的靜止表型，細胞質富含維生素A 脂滴[26]。受到外界刺激時，HSC 從靜止向具有高增殖、成纖維性和收縮性的肌成纖維細胞表型轉化，同時降低儲存維生素A 的能力。激活的HSC 轉化為的肌成纖維細胞是肝纖維化中肌成纖維細胞的主要來源，約占各種慢性肝病中肌成纖維細胞的82% ～96%[27]。HSC 活化后分泌大量的ECM 蛋白，釋放一系列促炎因子（如IL-6 等）以及促纖維化因子（如TGF-β1）[28]，并高表達α-SMA、膠原蛋白、波形蛋白、骨橋蛋白、賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）以及TIMP-1[29]。因此，活化的HSC 一直被看作治療HF 的主要靶點。

1.4.1 肝星狀細胞的活化 一般情況下，HSC 活化分為2 個階段：初始活化和永久活化。如果誘導纖維化的因素消失，活化的HSC 可能會發(fā)展到第3 階段：消退。在此階段它們可能會發(fā)生凋亡、衰老或恢復到靜態(tài)表型[26]。在起始階段，HSC 接收分泌成纖維細胞因子和生長因子的鄰近細胞發(fā)出的分子信號，增強HSC 向肌成纖維細胞轉化以及分泌促纖維化因子的特性?；罨螅琀SC 不斷增殖并大量分泌ECM 蛋白，導致ECM 積累以及瘢痕形成。這個過程是永久且難以逆轉的[26]。

HF 中發(fā)生的幾乎所有變化都會影響HSC 的行為，誘導HSC 活化。HSC 與肝細胞、LSEC、肝巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK）、膽道上皮細胞（BEC）、肝祖細胞（HPC）以及血小板等形成一個相互影響的細胞網(wǎng)絡[30]。某個細胞一旦發(fā)生變化，釋放的趨化因子和分子信號便會直接或間接影響HSC 的狀態(tài)，通過抑制或激活HSC 調節(jié)HF 的進展。因此，理解HSC 與其他細胞之間的相互作用，闡明它們在HF 進程的不同階段的相互影響，對于HF 的治療至關重要[26]。

1.4.2 肝細胞對肝星狀細胞活化的影響 肝細胞是肝臟最豐富的細胞類型，易受各種有害物質的損害，如酒精、病毒感染、有毒化合物等，誘導肝細胞釋放一系列炎癥因子，如活性氧（ROS）[31]、Hedgehog（Hh）[32]、核苷酸、DAMP[6]等，直接或間接促進HSC 的活化。HSC 能夠吞噬肝細胞凋亡小體，誘導HSC 向肌成纖維細胞轉化[26]。受損肝細胞的外泌體可介導Toll 樣受體3（TLR3）的激活，增強HSC 中IL-1 和IL-23 的表達。此外，肝細胞中脾臟酪氨酸激酶（SYK）和PDGFRα 的上調可直接改變這兩者在HSC 中的表達，調節(jié)HSC 的活化和增殖[32]。

1.4.3 肝竇內(nèi)皮細胞在肝星狀細胞活化及肝纖維化發(fā)展中的作用 LSEC 是肝臟非實質細胞的主要細胞群，約占肝細胞的15% ～ 20%[33]。肝實質由LSEC 排列形成的高效血管網(wǎng)絡支持。LSEC 表型的改變，包括LSEC 窗口缺失、毛細血管化和形成有組織的基底膜，已被證明是HF 形成的先兆[34]。LSEC 與肝細胞、HSC 相互作用，促進蛋白、脂質和糖代謝[35]。在正常肝臟中，肝細胞和HSC 旁分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）刺激的一氧化氮（NO）依賴性途徑和NO 非依賴性途徑都是維持LSEC 分化表型所必需的[36]。肝損傷后，LSEC 釋放不同的血管分泌信號來平衡肝臟再生和纖維化，最終維持肝臟穩(wěn)態(tài)。LSEC 的成纖維細胞生長因子受體（FGFR）-1 受到肝臟慢性損傷因素的激活而驅動纖維血管的形成，從而促進HF 的發(fā)生和發(fā)展[37]。受損的LSEC 逐漸毛細血管化，失去基底膜的窗孔。毛細血管化的LSEC 失去保護肝組織和滅活HSC 的能力，促進肝內(nèi)血管收縮和HF 的形成[35]。而活化的HSC 分泌過多的ECM，導致內(nèi)皮開窗功能喪失和LSEC 功能障礙，進一步促進HF。鑒于LSEC 在HF 中發(fā)揮的作用，保護LSEC 可能是減輕HF 的有效策略。

1.4.4 肝巨噬細胞對肝纖維化的雙重作用 KC 具有促進或抑制HF 的雙重功能。KC附著在竇狀內(nèi)皮層，可被血液循環(huán)的多種刺激激活，并分泌多種細胞因子，包括TGF-β1、TNF-α、MCP-1、趨化因子（如CCL3 和CCL5）和其他可溶性介質，對其他肝細胞產(chǎn)生影響[38]。KC 雙向調控HSC 的激活。一方面，KC 通過分泌IL-1 和TNF-α 作用于核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路來促進HSC 的活化。用柳氮磺胺吡啶誘導HSC 凋亡來抑制NF-κB 通路，可以發(fā)揮抗纖維化的作用[39]。抑制巨噬細胞浸潤可以直接抑制HSC 的活化和HF 的發(fā)生[40]。另一方面，KC 可以通過H2O2-IL-6 機制負向調控HSC 的成纖維性反應，還可以通過分泌MMP 來限制HF[41]?；谀壳暗难芯?，尚不清楚為何KC 對HSC 有2種相反的作用。進一步闡明KC 與HSC 激活之間的關鍵觸發(fā)機制，將有利于精準干預KC 對HF 的作用。

還有很多其他細胞可對HSC 的活化和HF 的形成產(chǎn)生影響。研究表明，NK 細胞通過殺死活化的HSC 并產(chǎn)生干擾素（IFN）-γ 發(fā)揮抗纖維化的作用[42]，NK 外泌體可抑制TGF-β1 誘導的HSC 的增殖和活化；膽管細胞（BEC）通過產(chǎn)生Hh 配體調節(jié)EMT，直接促進肌成纖維細胞的生長[43]。BEC 的增殖和旁分泌可以促進HSC 的活化和增殖。此外，BEC 自身可在TGF-β1 的誘導下向間充質轉化，導致膽管纖維化[44]。

2 肝纖維化相關治療藥物

在我國，肝病是常見病和多發(fā)病，主要包括乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。HF 是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，然而目前尚無有效治療藥物獲批。處于Ⅱ期和Ⅲ期臨床研究階段的HF 治療藥物有20 多種，包括吡非尼酮、CsA-TAC、Candesartan等（見表1）。截至目前，已有三家公司公布關鍵Ⅲ期研究結果：Intercept 公司的法尼醇X 受體激動劑奧貝膽酸（商品名：Ocaliva）獲得成功，F(xiàn)DA 已接受新藥上市申請（NDA），并授予優(yōu)先審評資格；吉利德的凋亡信號調節(jié)激酶1（ASK1）抑制劑selonsertib 的兩項關鍵Ⅲ期研究被宣告失?。?020年5 月11 日，Genfit 公司宣布在治療非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的Ⅲ期研究中，elafibranor 較安慰劑未能顯著改善患者NASH 組織學癥狀和減緩不斷加劇的肝臟纖維化，以失敗告終。

表1 肝纖維化治療藥物臨床研究情況Table 1 Clinical study of drugs for the treatment of liver fibrosis

3 結語

HF 是一個復雜的過程，各種細胞、趨化因子、分子信號等相互作用，形成一個龐大的互相影響、互相反饋的網(wǎng)絡。其中HSC 的激活是各種相互作用的最終結果。因此，研究HF 的發(fā)病機制歸根結底是研究HSC 的活化機制。近幾年新發(fā)現(xiàn)，miRNA、長鏈非編碼RNA（LncRNA）和外泌體等也參與HSC 的活化。正是由于HF 的發(fā)病機制錯綜復雜，靶向其中的某一個靶點或某一環(huán)很難有效發(fā)揮抗HF作用。因此，解密HSC 活化過程中細胞、因子、信號通路間相互作用的特殊機制，對于HF 的治療干預至關重要。