真菌防治蝗蟲研究進(jìn)展

農(nóng)向群，閆多子，蔡 霓，王廣君，涂雄兵，張澤華

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

蝗災(zāi)是世界經(jīng)常性的自然災(zāi)害。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織FAO統(tǒng)計(jì)，全球常年發(fā)生蝗蟲的面積達(dá)4680萬km2，威脅到100多個(gè)國(guó)家或地區(qū)，時(shí)常在非洲和亞洲造成嚴(yán)重災(zāi)害。幾百年來，在我國(guó)以及澳洲、非洲都曾暴發(fā)多次大規(guī)模蝗災(zāi)，造成作物絕產(chǎn)、草地荒蕪。2002—2013年我國(guó)天然草地年均危害面積2099萬hm2，農(nóng)區(qū)飛蝗年均成災(zāi)面積約320萬hm2，對(duì)我國(guó)的農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重破壞[1]。2004—2014年沙漠蝗Schistocerca gregaria在非洲西北部接連5次暴發(fā)，生態(tài)系統(tǒng)破壞加劇。2019年再次在肯尼亞、埃塞俄比亞等國(guó)暴發(fā)，短短數(shù)月內(nèi)蝗蟲數(shù)量激增6400萬倍，并擴(kuò)散遷移。2020年初，已擴(kuò)張到其西南各國(guó)，并在當(dāng)?shù)赜中纬尚律N群，同時(shí)向東北一路越過了紅海、沙特阿拉伯、伊朗，進(jìn)入了巴基斯坦和印度西北地區(qū)，正發(fā)育成熟進(jìn)入產(chǎn)卵繁殖季節(jié)[2]，如果遭遇強(qiáng)勁的印度洋西南季風(fēng)，蝗蟲將有機(jī)會(huì)飛躍橫斷山脈，對(duì)我國(guó)構(gòu)成潛在威脅，形勢(shì)十分嚴(yán)峻。

全世界的蝗蟲已知有1萬種以上，其中對(duì)農(nóng)、林、牧業(yè)可造成為害的蝗蟲約300種，全球除南極洲、歐亞大陸北緯 55°以北地區(qū)外均可發(fā)生蝗害[3]。沙漠蝗被認(rèn)為是世界上最具破壞力的遷徙性害蟲之一，主要分布在北非、中東和西南亞的干旱和半干旱地區(qū)，其飛行能力強(qiáng)、繁殖快、食量大，可聚集形成巨大蝗群。每天可以隨風(fēng)飛行150 km，存活時(shí)間為3個(gè)月左右[4,5]，一只雌蝗可產(chǎn)卵大約300粒[6]，1平方公里規(guī)模的蝗群1 d的進(jìn)食量相當(dāng)于3.5萬人1 d的進(jìn)食[7]，是非洲、亞洲熱帶荒漠地區(qū)的河谷、綠洲上的重大農(nóng)業(yè)害蟲。

非洲中部、中南部、薩赫勒地區(qū)是蝗災(zāi)頻發(fā)地，常見蝗蟲有非洲飛蝗Locusta migratoria migratorioides、紅蝗Nommadacris septemfaciata、樹蝗Anacridium melanorhodonI；在亞洲中部、東南部地區(qū)，如中國(guó)、越南、哈薩克斯坦的蝗蟲優(yōu)勢(shì)種有15～20種，包括東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis、亞洲飛蝗Locusta migratoria migratoria、亞洲小車蝗Oedaleus asiaticus、意大利蝗Calliptamus italicus等；在澳大利亞昆士蘭、南澳大利亞、新南威爾士、維多利亞等5個(gè)州，常見蝗蟲有幾十種，有澳洲疫蝗Chortoicetes terminifera、飛蝗 Locusta migratoria、紅蝗等；在北美洲和墨西哥北部有美洲沙漠蝗 Schistocerca americana、血黑蝗Melanoplus sanguinipes、edaleonotus enigma等；在歐洲有摩洛哥蝗 Dociostaurus maroccanus、白邊雛蝗Chorthippus albomarginatus、意大利蝗等[8,9]。

在自然條件下，如果不加以人工防控，暴發(fā)的蝗害可迅速擴(kuò)張，直至因食物絕盡或蝗蟲病原在適宜條件下造成流行病才能最終控制。在20世紀(jì)40～70年代，化學(xué)農(nóng)藥興起并應(yīng)用到蝗蟲防治中，在蝗蟲大發(fā)生時(shí)能夠快速殺滅種群。然而，蝗蟲產(chǎn)卵滋生地通常較為偏遠(yuǎn)，發(fā)生面積巨大，成蟲可遠(yuǎn)程遷移，施藥措施難以全面跟進(jìn)。大量施用化學(xué)農(nóng)藥帶來了殺傷天敵、破壞生態(tài)等問題，加上氣候異常變化，致使蝗災(zāi)頻發(fā)甚至加劇。在尋求環(huán)境友好的可持續(xù)防蝗新策略、新技術(shù)研究中，利用昆蟲病原真菌的生物防治受到重視并顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。近30多年來，利用真菌防蝗的研究進(jìn)展較快，并在蝗蟲災(zāi)害防控中發(fā)揮了重要作用。

1 真菌殺蟲機(jī)理

昆蟲和真菌在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中，形成了多樣化的相互關(guān)系，包括致病、寄生、腐生、共生、攜播、噬菌、競(jìng)爭(zhēng)、捕食等[10]。昆蟲病原真菌（Entomopathogenic fungi）是指能夠侵入健康昆蟲（或其他節(jié)肢動(dòng)物）寄主，在其體內(nèi)增殖并引起早期生理病變，影響發(fā)育、生殖和導(dǎo)致死亡的一類真菌。這是功能性的類別而非系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的分類，這類真菌主要體現(xiàn)了上述的致病和寄生關(guān)系。

真菌對(duì)昆蟲的致病性是二者長(zhǎng)期共同進(jìn)化的結(jié)果。真菌對(duì)昆蟲感染致病過程即是與寄主相互作用，包括突破昆蟲寄主體表屏障和克服寄主免疫系統(tǒng)的過程，其進(jìn)程大致分為三個(gè)階段，①侵入階段：分生孢子在黏液和粘附蛋白的幫助下附著于昆蟲體表，并萌發(fā)和形成侵染結(jié)構(gòu)，穿透表皮；②與寄主互作早期階段：侵入昆蟲血腔的芽管通過斷裂增殖形成蟲菌體定居下來，同時(shí)影響昆蟲的正常生理代謝，激活寄主先天免疫應(yīng)答，包括體液和細(xì)胞防御；③病害形成階段：入侵的真菌逐步戰(zhàn)勝昆蟲的免疫系統(tǒng)，在寄主體內(nèi)增殖、產(chǎn)生毒素并致死昆蟲（圖1）。

圖1 昆蟲病原真菌與昆蟲免疫反應(yīng)之間相互作用的示意圖[11]Fig. 1 Schematic of interactions between entomopathogenic fungi and the insect immune responses[11]

1.1 突破寄主體壁屏障

昆蟲病原真菌通常直接穿透外表皮來感染寄主昆蟲。體壁是昆蟲抵抗感染的第一道屏障。真菌分生孢子首先特異性或非特異性地吸附于昆蟲體壁，萌發(fā)后可分泌孢外蛋白酶及粘附因子使之牢固地附著在昆蟲體壁上[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)了一些負(fù)責(zé)疏水性、粘附性和毒力的基因，例如，金龜子綠僵菌Metahizium anisopliae疏水基因 ssgA編碼的疏水蛋白可以幫助孢子附著于昆蟲體表[14]。金龜子綠僵菌在侵染寄主表皮時(shí)表達(dá)粘附蛋白 Mad1，促進(jìn)真菌孢子穩(wěn)定地吸附于寄主體表，如果缺失 Mad1基因，分生孢子的粘附能力與毒力都顯著降低[15]。另外，其他細(xì)胞壁蛋白如CWP10和CP15，它們參與了耐熱和抗氧化脅迫反應(yīng)，在粘附和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。

真菌孢子在昆蟲表皮上萌發(fā)后，形成附著胞。附著胞經(jīng)過一段時(shí)間的膨大并形成侵入釘，借助機(jī)械壓力及蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶等水解酶的多重作用來降解昆蟲表皮，穿透寄主體壁[17]。蛋白酶主要有兩大類，一是對(duì)底物短肽 Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-Nz具有活性的類枯草桿菌蛋白酶 Prl，另一類是對(duì)短肽Ben-Phe-Val-Arg-NA有活性的胰蛋白酶Pr2[18]，它們的同工酶氨基酸序列中具有相同的活性區(qū)域，但其他部分序列變化較大[19,20]。類枯草桿菌蛋白酶Pr1能溶解昆蟲表皮中的蛋白質(zhì)成分，有助于菌絲的入侵，同時(shí)為菌絲的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)[21]。Pr1類蛋白酶在昆蟲病原真菌侵入寄主和致病過程中是重要毒力因子，pr1a基因被破壞的金龜子綠僵菌菌株毒力顯著下降，而pr1a高水平表達(dá)的菌株殺蟲毒力明顯提高，殺蟲時(shí)間縮短25%[22]；昆蟲血淋巴中高濃度的Prla蛋白酶可引起昆蟲酚氧化酶的過度表達(dá)，導(dǎo)致昆蟲中毒死亡[23]。

幾丁質(zhì)是昆蟲體壁屏障的主要成分，真菌幾丁質(zhì)酶是真菌突破寄主體壁的另一個(gè)重要的因子。用昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑Dimilin處理煙草夜蛾Manduca sexta幼蟲，阻止其幾丁質(zhì)合成，結(jié)果試蟲體壁很容易被金龜子綠僵菌降解。幾丁質(zhì)酶有多種類型，包括外切幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，根據(jù)等電點(diǎn)分為酸性和堿性幾丁質(zhì)酶等。對(duì)多種幾丁質(zhì)同工酶作用研究表明，DGIDVDWEYP對(duì)真菌幾丁質(zhì)酶具有高度保守性，推定是底物結(jié)合酶（Processing enzymes）的作用位點(diǎn)[24]。幾丁質(zhì)酶是誘導(dǎo)酶，侵染寄主體壁過程中在稍后期才產(chǎn)生，需要蛋白酶作用使幾丁質(zhì)露出后再誘導(dǎo)產(chǎn)生[20]。

病原真菌如果突破體壁失敗，原因可能是體壁的某些成分抑制了真菌孢子的萌發(fā)，或是體壁的分子篩功能阻擋了真菌分泌物的滲透，還有昆蟲表皮自身的推陳出新，排除了病原真菌及其分泌物。另外，昆蟲已選擇進(jìn)化了抵抗病原的特異蛋白酶的抑制劑，如IMPI（Insect metalloprotease inhibitor）[25]，而真菌分泌的酶種類雖多但分泌量有限，從而影響了其對(duì)表皮的降解程度[26]。最新的轉(zhuǎn)錄組分析表明，在病原真菌附著寄主體表和侵入的早期（12～24 h）階段，寄主因識(shí)別到病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns）激活了天然免疫系統(tǒng)，出現(xiàn)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因（Myd88、Relish家族、Pelle等）以及下游一些氧化酶（PPO）、溶菌酶和防御素等基因的顯著差異表達(dá)，產(chǎn)生對(duì)入侵病原的防御，這可能也是限制病原真菌突破寄主體壁的重要因素之一[27]。

群居昆蟲還可以通過群體行為回避達(dá)到對(duì)真菌感染的有效防御。如白蟻和螞蟻，可利用嗅覺線索從遠(yuǎn)處探測(cè)到被污染個(gè)體上的有毒真菌。大型白蟻可通過真菌釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物區(qū)分真菌的毒性高低，并采取相應(yīng)的防御行為[28]。對(duì)病原真菌的行為防御還包括自我修飾以及攝入或產(chǎn)生具有抗病性的化合物，如一些群居昆蟲通過傳播唾液腺或表皮后胸腺產(chǎn)生的抗真菌分泌物（如甲酸、抗菌肽和蛋白樣液體），以保護(hù)自身及巢內(nèi)同伴[29]。還有研究表明沙漠蝗可通過曬太陽來提高體溫，以對(duì)抗綠僵菌感染[30]。當(dāng)種群密度高時(shí)，昆蟲宿主通過預(yù)防性免疫的增強(qiáng)對(duì)抗真菌，如群居性蝗蟲通過預(yù)防性免疫的增強(qiáng)來降低對(duì)真菌的易感性[31]。

1.2 抑制寄主體液免疫

昆蟲免疫系統(tǒng)由體液免疫（humoral immunity）和細(xì)胞免疫（cellular immunity）組成。體液免疫是指昆蟲體內(nèi)本身存在或受誘導(dǎo)由脂肪體和血細(xì)胞分泌的免疫因子，包括抗菌肽、抗菌蛋白、凝集素、溶菌酶、酚氧化酶等物質(zhì)，對(duì)病原微生物產(chǎn)生免疫作用。昆蟲體液免疫主要有4條信號(hào)通路，Toll、IMD通路是昆蟲抵御病原真菌的核心通路，而JAK/STAT信號(hào)通路則主要對(duì)病毒的侵染作出免疫應(yīng)答，JNK信號(hào)通路則是昆蟲通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡抵御病毒侵?jǐn)_[32]。病原真菌的侵入，激發(fā)了昆蟲體液免疫功能。Toll、IMD通路包含多種蛋白因子介導(dǎo)的黑化反應(yīng)、抗菌肽、溶菌酶、活性氧（ROS）、凝集素等產(chǎn)生的復(fù)雜免疫應(yīng)答反應(yīng)[33]。Toll的激活與反應(yīng)如圖1（左側(cè)）所示，革蘭氏陰性結(jié)合蛋白3（GNBP3）是β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白家族（βGRP3）的成員，能識(shí)別并結(jié)合真菌細(xì)胞成分，級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)Toll信號(hào)通路。Persephone和Sp?etzle加工酶（SPE）引起半胱氨酸結(jié)細(xì)胞因子（Cysteine knot cytokine）Sp?etzle（Spz）的裂解。當(dāng)?shù)鞍姿馇懈畹呐潴wSpz與受體結(jié)合時(shí)，Toll受體被激活。然后將信號(hào)傳遞到由MyD88、Tube和Pelle組成的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中，最終通過有效的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子Dorsal和Dif引起AMPs的表達(dá)。

酚氧化酶（Pheonloxidase，PO）及其相關(guān)酶類是重要的免疫激活機(jī)制。該酶平時(shí)以無活性的酚氧化酶原（Porpheonloxidase，PPO）形式存在，當(dāng)外來生物入侵時(shí)，可通過特異性絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（PPO級(jí)聯(lián)）而活化，產(chǎn)生黑化反應(yīng)，清除病原體[34,35]?？咕模ˋMPs）在脂肪體、表皮細(xì)胞和血細(xì)胞中產(chǎn)生。目前共發(fā)現(xiàn)了1500多種抗菌肽，近700種抗真菌肽。昆蟲受到微生物感染或損傷后，脂肪體和血細(xì)胞會(huì)迅速合成一些抗菌肽，分泌到血淋巴中消滅入侵的病原物。例如，在大蠟螟Galleria mellonella幼蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種識(shí)別綠僵菌的抗真菌肽gallerimycin[36]。溶菌酶是由昆蟲的脂肪體分泌并釋放到血淋巴中的一種免疫因子，其通過攻擊肽聚糖或水解微生物細(xì)胞壁上的 N-乙酰胞壁酸的糖苷位點(diǎn)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并破壞其結(jié)構(gòu)，最終殺死病原物[26]。從經(jīng)免疫誘導(dǎo)過的大蠟螟、家蠶Bombyx mori L.和甘薯天蛾Agrius convolvuli中純化得到溶菌酶，對(duì)真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌均具有顯著的抑制效果[37]。凝集素（Lectin）也是一種糖結(jié)合蛋白，通過改變真菌膜結(jié)構(gòu)或滲透性直接抑制真菌生長(zhǎng)，也可以通過連接到真菌細(xì)胞壁的糖蛋白上間接地影響菌絲的生長(zhǎng)。

真菌通過多種方式躲避或抑制寄主免疫。在穿過體壁后初期，真菌在寄主血腔內(nèi)以原生質(zhì)體、類似原生質(zhì)體和囊胞子等酵母狀形式存在，以短菌絲出芽方式繁殖。這種生長(zhǎng)形式一方面有助于在體血腔中的分散與群集，通過增加表面積獲取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，快速繁殖，以數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)“逃避”宿主有限細(xì)胞的免疫反應(yīng)[38]；另一方面，這類細(xì)胞表面的細(xì)胞壁多糖很少，可最大限度不激發(fā)或躲避寄主的免疫反應(yīng)[39]。病原真菌通過分泌各種毒力因子對(duì)抗寄主體液免疫和導(dǎo)致寄主病變，如將金龜子綠僵菌破壞素Destruxin A注射到果蠅體內(nèi)，可導(dǎo)致各類抗菌肽的表達(dá)量都下調(diào)[40]。金龜子綠僵菌在蝗蟲血淋巴中分泌含鋅的羧肽酶MeCPA和酸性磷酸酯酶，前者可消化寄主體內(nèi)蛋白作為自己的營(yíng)養(yǎng)來源，后者則改變其寄主血淋巴中與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而干涉寄主體內(nèi)免疫活動(dòng)[41]。綠僵菌分泌的海藻糖酶能夠有效降解昆蟲血淋巴中的海藻糖為葡萄糖，獲取能量吸收，破壞昆蟲的血液生理，從而對(duì)昆蟲起著致命的作用[42]。真菌分泌的氨，作為一種毒力因子，改變血淋巴 pH，破壞昆蟲組織和干擾昆蟲的免疫系統(tǒng)，間接減弱寄主免疫反應(yīng)[43]，同時(shí)真菌通過酶的代謝產(chǎn)物改變環(huán)境pH，使各種酶在最適宜的pH條件下產(chǎn)生并發(fā)揮有效功能[44]。

1.3 躲避寄主細(xì)胞免疫

昆蟲細(xì)胞免疫是由血細(xì)胞介導(dǎo)，完成對(duì)病原物或異物的吞噬、包囊和結(jié)節(jié)等一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。免疫細(xì)胞主要有血淋巴中的漿細(xì)胞和粒細(xì)胞，漿細(xì)胞具有吞噬功能，而粒細(xì)胞可包囊大分子物質(zhì)并去核化形成結(jié)節(jié)[45]。

當(dāng)把綠僵菌孢子注射到金龜子幼蟲體內(nèi)，血淋巴中會(huì)形成典型的包囊體，孢子在包囊體內(nèi)被黑化，喪失萌發(fā)能力[46]。當(dāng)昆蟲受傷時(shí)，血細(xì)胞會(huì)在傷口處迅速凝結(jié)，阻止血淋巴流失，防止病原微生物侵入[38]。細(xì)胞免疫通常與體液免疫協(xié)同作用，圖1中（右側(cè)）AMPs由脂肪、表皮細(xì)胞和血細(xì)胞產(chǎn)生，血淋巴中血細(xì)胞識(shí)別真菌，并產(chǎn)生吞噬作用和包囊反應(yīng)。

病原菌主要通過3個(gè)方面逃避昆蟲的細(xì)胞免疫：（1）殺死血細(xì)胞及抑制細(xì)胞吞噬和結(jié)節(jié)形成；（2）利用體表的脂類成分來逃避昆蟲血細(xì)胞的免疫識(shí)別和包裹；（3）分泌毒力因子，金龜子綠僵菌侵入煙草天蛾血腔后，大量表達(dá)MCL1蛋白覆蓋于菌體表面，以此來逃避煙草天蛾幼蟲血細(xì)胞的免疫識(shí)別[47]。萊氏野村菌Nomuraea rileyi感染棉鈴蟲Helicoverpa armigera后，在寄主血淋巴中分泌毒蛋白或次生代謝物等毒力因子，通過破壞血細(xì)胞的細(xì)胞骨架，抑制其延展能力，阻遏了血細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而能夠成功地在棉鈴蟲血腔中生長(zhǎng)和繁殖[48]。

病原真菌分泌的毒素可抑制寄主細(xì)胞免疫反應(yīng)。已知的毒素主要有白僵菌素（beauverolides）、環(huán)孢素（cyclosporin）和破壞素（destruxin）等。已知破壞素由 6個(gè)氨基酸殘基通過酯鍵首尾相連形成環(huán)縮肽，環(huán)外加上不同類型羥基酸和氨基酸殘基，至少有19種類型[49]。綠僵菌通過釋放破壞素抑制沙漠蝗和美洲大蠊Periplaneta americana Linnaeus的酚氧化酶活性，破壞其參與體液免疫功能[50]，而白僵菌感染甜菜夜蛾后，能夠抑制寄主酚氧化酶的激活，使酚氧化酶的活性和分布明顯降低[51]。研究發(fā)現(xiàn)，破壞素通過改變寄主細(xì)胞的Ca2+平衡和細(xì)胞內(nèi)高分子蛋白的磷酸化來抑制吞噬細(xì)胞的粘附和擴(kuò)散能力，并影響漿細(xì)胞的細(xì)胞骨架形成[52]，破壞素還可引起昆蟲細(xì)胞的程序性死亡，從而減弱寄主的免疫能力[53]。結(jié)合表型反應(yīng)，破壞素可激活肌肉細(xì)胞的Ca2+通道，引起昆蟲痙攣后麻痹而死[54]；有些破壞素可影響寄主蛻皮激素合成，從而影響昆蟲的變態(tài)，如抑制煙草夜蛾新生4齡幼蟲向5齡的轉(zhuǎn)化進(jìn)程[55]。生理和病理的多重作用導(dǎo)致寄主機(jī)體病變直至死亡。

2 防蝗菌株選育

2.1 殺蟲真菌種類

在自然條件下病死的昆蟲中，有約60%起因于真菌感染罹病所致。全世界已報(bào)道的昆蟲病原真菌有約1000種。在早期，一些昆蟲病原真菌常常只見其無性循環(huán)的過程形態(tài)，如菌絲、分生孢子等，但未見或未知其有性循環(huán)過程，因此暫且歸為半知真菌類（門或綱）。隨著研究的深入和分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在半知真菌類的屬種多數(shù)都能夠鑒定到相應(yīng)的有性型，重新歸入分類系統(tǒng)的適當(dāng)?shù)匚?“半知菌（Imperfecti fungi）”、“不完全菌綱（Deuteromycetes）”等名稱已經(jīng)被放棄[56,57]。按照目前的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)，真菌類主要分7門和4個(gè)單列亞門[58,59]（圖2），其中子囊菌門Ascomycota和擔(dān)子菌門Basidiomycota為高級(jí)進(jìn)化類群；接合孢菌（Zygosporic fungi）和游動(dòng)孢子菌（Zoosporic fungi）進(jìn)化相對(duì)初級(jí)，且不是單系進(jìn)化，形態(tài)學(xué)上顯示多樣化；而微孢子菌門Microsporidia為低等真菌，最初認(rèn)為是散發(fā)的胞內(nèi)寄生物，歸為原生動(dòng)物 Protozoa，現(xiàn)根據(jù)多基因座測(cè)序和基因組學(xué)的證據(jù)表明應(yīng)屬于真菌類[60,61]。

圖2 真菌門類和大約物種數(shù)關(guān)系圖示[59]Fig. 2 Diagrammatic representation of relationships of fungal taxa and approximate number of species in each phylum or subphylum[59]

昆蟲病原真菌多屬于蟲霉亞門的蟲霉目Entomophthorales和子囊菌門的肉座菌目Hypocreales，還有一些屬于壺菌門 Chytridiomycota、球囊菌門Glomeromycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota和微孢子菌門 Microsporidia[59]。一般蟲霉目真菌的寄主比較專一，而肉座菌目真菌多數(shù)有較寬泛的寄主范圍（表1）。在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)中，有的物種可能是復(fù)合種或含有不同種群類型，例如，最為常見和研究最多的球孢白僵菌Beauveria bassiana和金龜子綠僵菌已積累眾多菌株，顯示具有高度的遺傳多樣性，近年分子系統(tǒng)研究已經(jīng)可以較好地區(qū)分和細(xì)化綠僵菌屬和白僵菌屬內(nèi)物種和類型[62,63]。即使同一物種，不同株系在寄主范圍、侵染水平、萌發(fā)率等方面也有所差異，表現(xiàn)了株系種群對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性?？傮w上。昆蟲病原真菌寄主范圍涵蓋了昆蟲綱中的大多數(shù)目類，至少有800種。最常見的綠僵菌屬和白僵菌屬寄主分別有200多種和700多種，包括鱗翅目Lepidoptera、鞘翅目Coleoptera、直翅目Orthoptera、同翅目Homoptera等中的多種重要農(nóng)林害蟲[64]。

表1 重要昆蟲病原真菌屬種的分類地位和寄主Table 1 Taxonomic status and hosts of important genera and species in entomogenous fungi

續(xù)表1

雖然蝗蟲類群龐大，直翅目蝗總科共有8科含1萬余種，中國(guó)已知700余種，但豐富的病原真菌種類為蝗蟲生物防治提供了廣泛資源。在蟲霉亞門的蟲霉目和子囊菌門的肉座菌目中都發(fā)現(xiàn)了蝗蟲的病原真菌。蟲霉目研究較多的是蝗噬蟲霉復(fù)合體 Entomophaga grylli complex，其至少包括 4種致病型，I型 E.macleodii主要寄生斑翅蝗亞科Oedipodinae的蝗蟲；II型E. calopteni主要寄生黑蝗亞科Melanoplinae的蝗蟲；III型E. praxibuli兩亞科均可寄生；IV型E. asiatica是從日本的一種蝗蟲體分離得到的。用分子標(biāo)記可將它們區(qū)分鑒別，我國(guó)主要有蝗噬蟲霉I型。噬蟲霉類真菌可采用接種蟲體培養(yǎng)，對(duì)人工培養(yǎng)基要求較高，如需要牛奶、蛋黃或加牛血清等，目前還難以大量繁殖利用。肉座菌目廣泛存在于自然界，是蝗蟲的主要病原真菌，包括綠僵菌 Metarhizium屬的金龜子綠僵菌、蝗綠僵菌 M. acridum、黃綠綠僵菌 M.flavoviride，白僵菌屬Beauveria的球孢白僵菌、曲霉屬Aspergillus的黃曲霉A. flavus等。綠僵菌和白僵菌是蝗蟲的主要寄生性病原真菌，種群類型多、致病力強(qiáng)且易于人工培養(yǎng)，尤其綠僵菌具有對(duì)蝗蟲的致病性優(yōu)勢(shì)，成為國(guó)內(nèi)外研究與開發(fā)利用的熱點(diǎn)，并不斷取得可喜進(jìn)展。

2.2 菌株篩選評(píng)價(jià)

通常可以從病死蟲體上或從土壤中分離獲得菌株，在實(shí)驗(yàn)室對(duì)靶標(biāo)害蟲和其他昆蟲接種進(jìn)行生物測(cè)定，評(píng)估菌株的殺蟲毒力和寄主范圍，同時(shí)接種在培養(yǎng)基上，評(píng)估菌株的碳氮源等營(yíng)養(yǎng)需求、適宜溫度、pH范圍、生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量等參數(shù)。在著名的撒哈拉地區(qū)蝗蟲生物防治國(guó)際合作LUBILOSA項(xiàng)目（1989—2002）中，英聯(lián)邦國(guó)際生物防治研究所聯(lián)合國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究所等多國(guó)團(tuán)隊(duì)，從西非、也門、馬達(dá)加斯加等地區(qū)的土壤或病蝗中分離出300多個(gè)對(duì)蝗蟲有效感染的真菌菌株，進(jìn)行了大規(guī)模生物測(cè)定以篩選高毒菌株，還評(píng)估了菌株遺傳穩(wěn)定性、產(chǎn)孢能力、孢子穩(wěn)定性、對(duì)紫外線和高溫的抗性、田間有效性、對(duì)非靶標(biāo)生物的安全性、對(duì)環(huán)境的影響和循環(huán)性等特性，確定了高效的金龜子綠僵菌IMI330189等菌株以及球孢白僵菌、小團(tuán)孢屬Sorosporella sp.的幾個(gè)優(yōu)良的潛力菌株。菌株IMI330189最初鑒定為黃綠綠僵菌，后來根據(jù)Driver等[65]的分子系統(tǒng)訂正為金龜子綠僵菌蝗變種M. anisopliae var. acridum，后來在Bischoff等[62]的多基因位點(diǎn)分類中將其獨(dú)立為蝗綠僵菌M. acridum。該菌株為項(xiàng)目的順利開展和后來產(chǎn)品的研發(fā)商業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

在澳大利亞，針對(duì)當(dāng)?shù)貫?zāi)害性蝗蟲Chortoicetes terminifera、Phaulacridium vittatum、Locusta migratoria、Austracris guttulosa、Valanga irregularis等進(jìn)行了生物測(cè)定篩選，獲得了高毒力的金龜子綠僵菌FI-985菌株[66,67]。在國(guó)內(nèi)，1993年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所通過國(guó)際合作，自英聯(lián)邦國(guó)際生物防治研究所（IIBC）引進(jìn)了防蝗系列菌株，并對(duì)東亞飛蝗進(jìn)行了毒力測(cè)定，顯示菌株Arsef 324（后來確定為金龜子綠僵菌）和IMI330189有較高毒力[68]；同時(shí)該研究所科研團(tuán)隊(duì)也從本土菌株中篩選到對(duì)東亞飛蝗、亞洲飛蝗、意大利蝗、亞洲小車蝗等高毒力菌株。其他研究者也先后報(bào)道了不同地區(qū)采集分離的高毒力的防蝗菌株[69,70]，以及利用溫度梯度熱激脅迫、誘導(dǎo)提升耐熱性和抗UV-B的防蝗優(yōu)良菌株[71]。

2.3 菌株遺傳改良

為了提高菌株殺蟲毒力和抗逆生存能力，可以利用生物技術(shù)進(jìn)行菌株改良。真菌遺傳改良方法主要利用有性（或準(zhǔn)性）循環(huán)、原生質(zhì)體融合、輻射誘變和基因工程途徑來實(shí)現(xiàn)。真菌有性循環(huán)和準(zhǔn)性生殖（parasexual reproduction）是兩個(gè)異性生殖細(xì)胞或異核菌絲體結(jié)合，通過染色體交換產(chǎn)生遺傳重組的個(gè)體。真菌繁殖過程中普遍存在異核現(xiàn)象和準(zhǔn)性生殖。利用準(zhǔn)性生殖，可以將兩種基因型不同的具有親和性的個(gè)體進(jìn)行體細(xì)胞雜交（準(zhǔn)性雜交），得到預(yù)期新性狀的個(gè)體。用綠僵菌野生型菌株與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株作材料證實(shí)了準(zhǔn)性雜交現(xiàn)象，并獲得二倍體重組體且具有較高的產(chǎn)孢率和較強(qiáng)的致病性[72]。

輻射誘變除了常規(guī)的紫外照射處理，航天搭載能夠使生物種質(zhì)在太空環(huán)境的強(qiáng)輻射、超速度、高真空、微重力等因素的復(fù)合作用下，發(fā)生大幅度的生理變異和遺傳變異，因而成為高效率育種手段。從航天搭載后的綠僵菌突變株中檢測(cè)到的形態(tài)、生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、致病力等多項(xiàng)生物學(xué)特性發(fā)生了不同程度的變異，變異率高，變異趨向有正負(fù)雙向性，其中一些突變株的生長(zhǎng)特性和致病力優(yōu)于原始菌株[73]。

原生質(zhì)體融合是指不依靠生物體本身所具有的性別能力，而是人為地利用酶降解去除細(xì)胞壁，在滲透壓穩(wěn)定和pH適宜條件下，通過電脈沖或化學(xué)助溶劑使細(xì)胞融合，細(xì)胞壁再生后獲得新種細(xì)胞。這種方法可以克服菌絲不相容性，甚至能跨越種、屬間的界限，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交。以原生質(zhì)體進(jìn)行紫外照射處理可獲得較高的誘變效率。以白僵菌和綠僵菌為例，將0.5%纖維素酶和0.5%蝸牛酶的混合酶液、0.6 mol/L NH4Cl或KCl為滲透壓穩(wěn)定劑；在pH 6.5時(shí)30 ℃處理菌絲，可從1 g濕菌絲中獲得5×107個(gè)以上的原生質(zhì)體[74,75]。以球孢白僵菌和金龜子綠僵菌為出發(fā)材料，進(jìn)行相同物種不同菌株之間、不同屬物種之間的原生質(zhì)體融合試驗(yàn)，以 β-葡萄糖醛酸苷酶和 KCl作裂解酶和滲透穩(wěn)定劑，以聚乙二醇（PEG）為融合劑，融合再生率達(dá)到 0.84%～1.08%，獲得了菌絲生長(zhǎng)快和產(chǎn)孢量高的融合子，并發(fā)現(xiàn)由白僵菌和綠僵菌原生質(zhì)體融合的重組菌株中，胞外蛋白酶Pr1和Pr2的活性比親本增加了兩倍[76]。對(duì)蛹蟲草Cordceps militaris原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變處理，篩選出兩株蟲草多糖和子實(shí)體產(chǎn)量都明顯高于原始菌株的優(yōu)良菌株[77]。

遺傳工程改良菌株是近年的主要方向，至今已發(fā)現(xiàn)一些昆蟲病原真菌的毒力基因、抗逆基因及其調(diào)控相關(guān)基因，外源基因的導(dǎo)入方法日臻成熟。向絲狀真菌中轉(zhuǎn)化外源 DNA的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)，或制備原生質(zhì)體并借助PGE-CaCl2促進(jìn)融合，或借助電脈沖來完成轉(zhuǎn)化。蟲生真菌抗性育種中，第一個(gè)利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的成功范例是構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBENA3，將構(gòu)巢曲霉 Aspergillus nidulans的抗苯菌類基因BenA3導(dǎo)入金龜子綠僵菌的原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化率為9個(gè)轉(zhuǎn)化子/50 μg DNA/2×106原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化菌株對(duì)苯菌靈的抗性比原菌株高 10倍[78]?；蚬こ虒?duì)昆蟲病原真菌遺傳改造的另一個(gè)突破性進(jìn)展是試驗(yàn)選擇了MCL1作為啟動(dòng)子，利用綠色熒光報(bào)告基因，首次將一種北非蝎的昆蟲?；陨窠?jīng)毒素多肽AaIT（中性蝎毒）反編碼成真菌基因，構(gòu)建了帶有抗性標(biāo)記的替換質(zhì)粒，經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后，篩選抗性菌落，在受控操縱子的調(diào)節(jié)下使金龜子綠僵菌在侵染至昆蟲體內(nèi)時(shí)高水平表達(dá)。轉(zhuǎn)化的工程菌株顯著提高了殺蟲速率，對(duì)煙草天蛾的毒力提高22倍，對(duì)埃及伊蚊Aedes aegypti的毒力提高9倍；與此同時(shí)，還顯著減少了昆蟲的活動(dòng)性，降低了昆蟲的取食率[79]。還有，把來自一種鉗蝎Buthotus judaicus的殺蟲蝎毒素（Bj alpha IT）基因整合到蝗綠僵菌中，增強(qiáng)了對(duì)東亞飛蝗的毒力，使 LC50降低了 18.2倍，局部接種和注射工程菌的LT50分別減少了28.1%和30.4%[80]。近年研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了更多的昆蟲病原真菌毒力相關(guān)基因、抗逆生長(zhǎng)相關(guān)基因和產(chǎn)孢調(diào)控基因等，都可作為菌株遺傳改良的好材料。將酯酶基因（MestI）從通常廣譜寄主的羅伯氏綠僵菌M. robertsii轉(zhuǎn)移到特定的蝗綠僵菌，擴(kuò)大了宿主范圍[81]。如黑色素酶（melanin）在金龜子綠僵菌中的表達(dá)使得菌株對(duì)紫外線和高溫的抵抗力增強(qiáng)[82]；將高效的古細(xì)菌光解酶（photolyase）基因整合到羅伯氏綠僵菌基因組中，可以提高真菌的光修復(fù)能力，從而提高對(duì)陽光的抵抗力[83]；黃綠綠僵菌菌株用于防治巴西蚱蜢Rhammatocerus schistocercoides，轉(zhuǎn)化了苯菌靈抗性基因（beta-tubulin gene）后，高抗轉(zhuǎn)化子對(duì)苯菌靈抗性提高了 30倍，在非選擇性培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)代 20次后仍保持抗性穩(wěn)定，而且一些糜蛋白酶（Chymoelastase，Pr1）分泌量比野生型更大，分生孢子萌發(fā)率更高，在生產(chǎn)和應(yīng)用上更具潛力[84]。

3 規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用

在獲得對(duì)蝗蟲高致病力菌株的基礎(chǔ)上，還需要根據(jù)菌株生長(zhǎng)特性，建立大量培養(yǎng)或規(guī)?；a(chǎn)的方法，以獲得足夠的批量產(chǎn)品。

3.1 規(guī)?；a(chǎn)

3.1.1 液固兩相發(fā)酵工藝 大多數(shù)昆蟲病原真菌具有由分生孢子-萌發(fā)-菌絲體生長(zhǎng)-產(chǎn)生分生孢子的無性繁殖過程，此過程增殖快，分生孢子是侵染昆蟲的基本單元。因此，可利用營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的生活史兩個(gè)階段進(jìn)行人工介入，通過發(fā)酵實(shí)現(xiàn)菌劑的規(guī)?；a(chǎn)。菌株?duì)I養(yǎng)和環(huán)境條件是調(diào)控生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的關(guān)鍵因子，有很多關(guān)于不同種類真菌或菌株的營(yíng)養(yǎng)要求和生長(zhǎng)環(huán)境條件的研究報(bào)道?？傮w來看，多數(shù)真菌或菌株均有一定適宜范圍的碳源、氮源、無機(jī)離子和微量元素，溫度、濕度、pH和耗氧性，因此相關(guān)研究有較大的共通性。綠僵菌和白僵菌的大量培養(yǎng)和規(guī)模生產(chǎn)的方法和基本工藝流程大致相同，可以進(jìn)行液體深層發(fā)酵（Submerged fermentation）、固態(tài)發(fā)酵（Solid-state fermentation）和液固雙相發(fā)酵（Liquid-solid two-phase fermentation）。固體發(fā)酵相對(duì)于液體發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)列于表2。液固雙相發(fā)酵是以大量增殖的菌絲體接種到固體基質(zhì)，雖延長(zhǎng)了流程，但較好地取長(zhǎng)補(bǔ)短，發(fā)揮液、固相發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。3種類型發(fā)酵參數(shù)各有不同，最終產(chǎn)物也不同。液體發(fā)酵的產(chǎn)物是菌絲體、芽生孢子或液生分生孢子，而固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物是氣生分生孢子。不同的產(chǎn)物形式各具特性，從產(chǎn)物的活性、穩(wěn)定性和發(fā)酵控制條件考慮，氣生分生孢子是適合于規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用的產(chǎn)品形式。為了獲得高產(chǎn)并降低成本，通常需要根據(jù)所選用菌株的營(yíng)養(yǎng)需求和生長(zhǎng)條件進(jìn)行多因子優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)效益。

表2 固體發(fā)酵相對(duì)于液體深層發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)[85]Table 2 Advantages and disadvantages of solid state fermentation in comparison to submerged fermentation

在LUBILOSA項(xiàng)目中，對(duì)高效防蝗菌株金龜子綠僵菌IMI330189進(jìn)行了液體深層培養(yǎng)、固體表面培養(yǎng)和液固兩相培養(yǎng)研究。深層培養(yǎng)的菌絲體制成干粉，使用時(shí)可加水噴霧或噴灑，而在大米或小米表面培養(yǎng)獲得分生孢子粉，產(chǎn)量可達(dá)100 g/kg固體基料，使用時(shí)將孢子粉配置成油懸浮劑進(jìn)行超低量噴霧[86]。比較幾種大量培養(yǎng)球孢白僵菌和擬青霉Paecilomyces fumosoroseus的培養(yǎng)基表明，在松散固體培養(yǎng)基中，大米最適合生長(zhǎng)和孢子形成；在液體培養(yǎng)基中，椰子水最適合[87]。對(duì)綠僵菌金龜子和黃綠綠僵菌的大量標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件研究顯示，以大米為固相產(chǎn)孢基質(zhì)，高密度聚乙烯袋為容器，接種分生孢子懸浮液，在25 ℃下孵育15 d，產(chǎn)孢水平分別達(dá)到30×108和70×108CFU/g，顯著高于接種孢子經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d的產(chǎn)物[88]。對(duì)金龜子綠僵菌IMI330189的液體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，利用Sigmoid函數(shù)構(gòu)建了該菌株液體發(fā)酵過程中的菌體生長(zhǎng)和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型，所建模型能夠較好地?cái)M合金龜子綠僵菌IMI330189液體發(fā)酵過程，并擬合求解出各模型參數(shù)，優(yōu)化參數(shù)后，生長(zhǎng)速率在發(fā)酵第22.8 h達(dá)到最大值，為0.084/h；總糖比消耗速率在第9.6 h達(dá)到最大值，為0.246/h；總氮比消耗速率在第10.3 h達(dá)到最大值，為0.007/h；菌體對(duì)總糖的得率系數(shù)在39.8 h達(dá)到最高，為0.861 g/g[89]。比較2株金龜子綠僵菌菌絲生長(zhǎng)及次代產(chǎn)孢的環(huán)境因素，經(jīng)過優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)條件，菌株1為28 ℃、pH 7、裝液比為75 mL/250 mL、加入微量元素Mn、全光照培養(yǎng)；菌株2為28 ℃、pH 9、裝液比為75 mL/250 mL、加入微量元素Cu，黑暗培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)最好、次代產(chǎn)孢量最高?？梢姴煌陮?duì)光照、通氣、微量元素的需求有明顯差異[90]。

對(duì)于固體培養(yǎng)，基質(zhì)有多種選擇，可直接用谷物?；蚴杷奢d體加谷物粉為主的營(yíng)養(yǎng)配方，并采用適宜的溫度、光照等控制條件，主要考慮最終產(chǎn)孢量和價(jià)格成本。在金龜子綠僵菌的三級(jí)固體放大培養(yǎng)中，以90%麥麩加10%玉米粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基，加水量約60%，經(jīng)過優(yōu)化，得到最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)條件為初始基質(zhì)pH 6.0、27 ℃、避光，培養(yǎng)6 d孢子產(chǎn)量可達(dá)1.21×1010孢子/g干培養(yǎng)基[91]。研究表明，蛭石和稻殼均可作為綠僵菌固相培養(yǎng)的優(yōu)良載體，玉米粉和麥麩組合是良好的營(yíng)養(yǎng)源，與不同載體配合的產(chǎn)孢量達(dá)到20×108孢子/g以上。液固接種比以8:10最佳；接種后適宜的基質(zhì)含水量約為55%，產(chǎn)孢量達(dá)28.9×108孢子/g；恒溫培養(yǎng)時(shí)以25 ℃為宜，而采用調(diào)溫方式是先在25 ℃下培養(yǎng)16 d后轉(zhuǎn)移到21 ℃下再培養(yǎng)5 d，可獲得最高產(chǎn)孢量；光照調(diào)節(jié)對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢有重要影響，前期暗環(huán)境培養(yǎng)14 d，再光照培養(yǎng)7 d的產(chǎn)孢量最高；高通氣量利于菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢[92]。為了降低固體基質(zhì)成本，考察了重復(fù)利用大米基質(zhì)的產(chǎn)孢量，通過響應(yīng)面方法，確定重要變量為時(shí)間和溫度，相互作用為溫度×糖蜜和溫度×?xí)r間，重復(fù)利用大米基質(zhì)和新大米同樣在25 ℃培養(yǎng)20 d內(nèi)獲得了最高產(chǎn)孢率。鑒于糖蜜具有增加產(chǎn)孢作用但其濃度對(duì)產(chǎn)率并不關(guān)鍵，建議設(shè)定 5%以降低成本[93]。還有不少類似的研究結(jié)果，可構(gòu)成金龜子綠僵菌規(guī)?；幕A(chǔ)平臺(tái)和技術(shù)參數(shù)。為了控制產(chǎn)品質(zhì)量，建議使用基質(zhì)碳、氮比作為控制指標(biāo)，確定接種量、溫度等培養(yǎng)條件，使用農(nóng)副產(chǎn)品為潛在基質(zhì)，加上可循環(huán)利用的油形成配方，這可能是一種低成本且對(duì)環(huán)境可持續(xù)的規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)[94]。

3.1.2 其他培養(yǎng)方式 金龜子綠僵菌的分生孢子的另一種形成方式是微循環(huán)產(chǎn)孢。孢子萌發(fā)后，當(dāng)培養(yǎng)條件適宜時(shí)，可不經(jīng)過營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)階段，或營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)受到極大限制時(shí)，就直接重復(fù)產(chǎn)孢[95]。理論上，如果能夠控制好微循環(huán)產(chǎn)孢條件，將可以縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本，但這種微循環(huán)產(chǎn)孢方式只在一些菌株觀察到，并與培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件密切相關(guān)，且不易控制，產(chǎn)量有限。

微菌核（microsclerotia，MS）是絲狀真菌生活史中一種較常見的特化結(jié)構(gòu)，是由菌絲緊密連接交織而形成的黑化、緊實(shí)的休眠體，可形態(tài)多樣、大小不一。菌核外面通常有一層由緊密相連的菌絲頂端構(gòu)成的皮層，中間菌髓由松散的、寬大的菌絲構(gòu)成，是微菌核的主要部分，菌髓的細(xì)胞中聚集了許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其能夠應(yīng)對(duì)不良環(huán)境。當(dāng)環(huán)境適宜時(shí)，能萌發(fā)產(chǎn)生新的營(yíng)養(yǎng)菌絲或分生孢子等繁殖體。這種結(jié)構(gòu)的抗逆性和穩(wěn)定性具有十分誘人的開發(fā)潛力。第一例報(bào)道的昆蟲病原真菌微菌核是在金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的，由此提出了以微菌核作為一種產(chǎn)品的新形式。研究還報(bào)道，微菌核只能在液體深層發(fā)酵后期才能生成，碳源濃度與碳氮比影響微菌核的產(chǎn)量，碳源濃度為36 g/L、碳氮比在30:1和50:1時(shí)MS的產(chǎn)量最大，分別達(dá)到2.7×108和2.9×108MS/L，產(chǎn)微菌核方法獲得了美國(guó)專利[96]。

綠僵菌破壞素的培養(yǎng)條件也被積極探討，以期開發(fā)作為殺蟲劑。用響應(yīng)面法優(yōu)化了金龜子綠僵菌破壞素A的培養(yǎng)條件，得到1個(gè)擬合程度高、誤差小的模型，該模型給出的最佳培養(yǎng)條件為：蔗糖22.7 g/L、蛋白胨13.4 g/L和發(fā)酵時(shí)間9.70 d，預(yù)測(cè)綠僵菌破壞素A最大質(zhì)量濃度為6.90 μg/mL，實(shí)際測(cè)得質(zhì)量濃度為6.89 μg/mL[97]。此結(jié)果為綠僵菌大規(guī)模發(fā)酵獲得破壞素產(chǎn)品提供理論依據(jù)，有望使綠僵菌毒素得到廣泛的開發(fā)和應(yīng)用。

芽生孢子是通過出芽方式產(chǎn)生的無性孢子，許多真菌在液體發(fā)酵中都可以大量產(chǎn)生。在3 L容量的攪拌釜式生物反應(yīng)器中，通過響應(yīng)面方法得到了優(yōu)化的蝗綠僵菌M. acridum芽生孢子生產(chǎn)的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵參數(shù)，玉米漿69.25 g/L、酪蛋白80.68 g/L加磷酸氫二鉀15.17 g/L，控制條件為26 ℃，pH 3.3，恒定攪拌速度635 r/min，發(fā)酵120 h，可獲得最大產(chǎn)量1.25×108芽生孢子/mL[98]。這些可作為擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)的基礎(chǔ)。但由于芽生孢子難于保存，至今未得到推廣。

3.2 制劑工藝

為了提高田間應(yīng)用效果，還需要研制菌劑配方和改進(jìn)加工技術(shù)，以保持菌劑中真菌的活力，并使之滿足貯存、運(yùn)輸和田間施用的要求。

早期的昆蟲病原真菌田間應(yīng)用都是直接采用發(fā)酵產(chǎn)品，并不受制劑加工，產(chǎn)品貯存和施用方式的限制。為了便于產(chǎn)品貯藏、施用和提高防效，需要將生產(chǎn)的菌體制劑化。制劑化的產(chǎn)品有利于標(biāo)準(zhǔn)化和登記管理，是產(chǎn)品商業(yè)化的重要前提。產(chǎn)品制劑化技術(shù)隨著生產(chǎn)技術(shù)和規(guī)模的發(fā)展不斷改進(jìn)和成熟，但由于商業(yè)利益的原因，制劑關(guān)鍵技術(shù)很少公開，只能從產(chǎn)品數(shù)量、用量及有限的文獻(xiàn)中獲知一些信息。以綠僵菌為例，2015年，全球有13個(gè)國(guó)家或地區(qū)的83個(gè)綠僵菌產(chǎn)品注冊(cè)在案，適用于蝗蟲防治應(yīng)用的主要有可超低量噴霧的油懸浮劑（有的稱油劑，應(yīng)糾正）[99]，在不同環(huán)境和使用器具條件下可濕性粉劑、粉劑、餌劑也適于應(yīng)用。

當(dāng)初開展防治沙漠蝗國(guó)際合作項(xiàng)目 LUBILOSA的一個(gè)重要基礎(chǔ)是英國(guó)已經(jīng)研發(fā)獲得了綠僵菌的油懸浮制劑，他們篩選到適宜的油基，能夠在應(yīng)用時(shí)很容易地將孢子均勻懸浮在油基中，制成可超低量噴霧的配方。該制劑優(yōu)點(diǎn)是使感染性孢子很好地附著于昆蟲表皮，同時(shí)孢子在油滴中得到保護(hù)，可避免在高溫低濕環(huán)境下因快速失水干燥而失活。后來該產(chǎn)品經(jīng)過毒理安全性、環(huán)境安全性評(píng)估，最終由南非的BCP公司和法國(guó)的NPP公司成功開發(fā)，在幾個(gè)非洲國(guó)家獲得注冊(cè)，商品名為“GreenMuscle”，被FAO準(zhǔn)許為蝗蟲防治產(chǎn)品，并大量生產(chǎn)，多年在非洲和亞洲多個(gè)國(guó)家用于防治沙漠蝗[100]。

澳大利亞針對(duì)當(dāng)?shù)貒?yán)重為害的蝗蟲，也成功研發(fā)了高毒力金龜子綠僵菌FI-985的油懸浮劑，獲得澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織（Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization，CSIRO）許可登記注冊(cè)，商品名為“Green Guard”，并由SGB Australia Pty Ltd公司進(jìn)行了大量生產(chǎn)，多年用于蝗災(zāi)防控，取得了巨大的成功。應(yīng)用表明綠僵菌對(duì)其他昆蟲、水生環(huán)境都沒有不利影響，且無殘留物，是對(duì)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展友好的產(chǎn)品。Green Guard油懸浮劑（金龜子綠僵菌60億孢子/mL）產(chǎn)品曾在2008年由澳大利亞貝克安德伍德公司在中國(guó)取得注冊(cè)登記和應(yīng)用。在美國(guó)，已注冊(cè)了一種基于球孢白僵菌的產(chǎn)品，名為“Mycotrol”，可用于防治各種害蟲，包括蝗蟲和蚱蜢。

近20年來，我國(guó)真菌制劑研發(fā)和注冊(cè)登記進(jìn)展加快，自2002年第一個(gè)真菌殺蟲劑獲得注冊(cè)登記，至今已登記的防蝗真菌農(nóng)藥有6個(gè)（種次）金龜子綠僵菌和5個(gè)（種次）球孢白僵菌（表3），防治對(duì)象為飛蝗、草原蝗蟲、竹蝗等。近年來，有研究開發(fā)綠僵菌的餌劑、粉劑、可乳化粉劑，以利于在各環(huán)境下選擇適合的劑型應(yīng)用。產(chǎn)品的防治對(duì)象為飛蝗、草原蝗蟲、竹蝗等。

表3 我國(guó)已注冊(cè)的真菌防蝗產(chǎn)品Table 3 Fungal pesticides registered for controlling locusts and grasshoppers in China

4 真菌防蝗技術(shù)和應(yīng)用

4.1 真菌防蝗技術(shù)及其評(píng)價(jià)

真菌病害在蝗蟲中的自然流行機(jī)率很低，需要人工增殖并釋放到自然蝗蟲種群中，提高蝗蟲的感病率，才能將蝗蟲種群密度控制在經(jīng)濟(jì)為害水平以下。

已報(bào)道了很多有潛力的蝗蟲病原真菌在田間的防效試驗(yàn)，但付諸大規(guī)模應(yīng)用的較少。應(yīng)用產(chǎn)品主要是綠僵菌和少量白僵菌，劑型主要是孢子的油懸浮劑、可濕性粉劑，還有餌劑和粉劑。施用與評(píng)價(jià)方法參照化學(xué)農(nóng)藥，以施藥處理后在較短時(shí)期內(nèi)的蝗蟲死亡率作為指標(biāo)?？傮w來看，報(bào)道的防效是在施菌后1周內(nèi)可見蝗蟲死亡，在2～4周是死亡率上升期，4周后仍有少數(shù)死亡，總死亡率可達(dá)到60%以上，有的超過90%。由于產(chǎn)品中菌株毒力差異、劑型和施用方法差異等導(dǎo)致最終死亡率有較大范圍波動(dòng)。相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥，真菌的致死速率較慢而持續(xù)時(shí)期較長(zhǎng)是一個(gè)顯然的事實(shí)和重要特征。

實(shí)際上，對(duì)于田間蝗蟲發(fā)生的不同情況如發(fā)生面積、發(fā)生量和種群發(fā)育階段等，可采用不同的防治方案，包括在嚴(yán)重發(fā)生區(qū)、農(nóng)作區(qū)的應(yīng)急控害方案和在荒漠區(qū)、蝗蟲幼齡階段的適度容忍持續(xù)控制方案。方案的選擇可依據(jù)經(jīng)濟(jì)與生態(tài)損失評(píng)估來制定閾值。對(duì)于我國(guó)內(nèi)蒙古草原，根據(jù)5種優(yōu)勢(shì)蝗蟲即亞洲小車蝗、毛足棒角蝗Dasyhippus barbipes、寬須蟻蝗Myrmeleotettix palpalis、狹翅雛蝗Chorthippus dubius和小蛛蝗Aeropedellus variegates minutus的自然種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量、蝗蝻和成蟲的平均壽命、不同發(fā)育階段的日食量等數(shù)據(jù)，通過估算蝗蟲造成的牧草損失，提出了優(yōu)勢(shì)種蝗蟲（3齡蝻期）的防治經(jīng)濟(jì)閾值為17～38頭/m2，其中亞洲小車蝗最?。?6.9）、小蛛蝗最大（37.4）[101]。對(duì)于不同區(qū)域的生產(chǎn)效益和生態(tài)承受能力，經(jīng)濟(jì)閾值有所變化，特別對(duì)于天然草場(chǎng)和荒漠區(qū)，其生態(tài)功能更為重要。然而，由于生態(tài)因子較多且變化復(fù)雜，很少有蝗蟲防治的生態(tài)閾值的報(bào)告。生態(tài)閾值需要增加考慮生物多樣性資源指數(shù)、受害指數(shù)、干旱因子、補(bǔ)償易害指數(shù)等，一個(gè)可參考的生態(tài)閾值（Ecological threshold）簡(jiǎn)化模型定義為：ET=[(-1)/(D×LnR)]×[K/FL_n＋CC/(FL_n×P×EC)]，其中R為草原投影蓋度；K為α%草原平均生產(chǎn)力水平；FL_n為蝗蟲混合種群每蟲損失估計(jì)；CC為防治費(fèi)用；EC為防治效果；P為產(chǎn)品價(jià)格；D為干旱因子[102]。一項(xiàng)在內(nèi)蒙古通遼草場(chǎng)進(jìn)行的天然罩籠與人工模擬試驗(yàn)，對(duì)主要為害的亞洲小車蝗不同蝻齡的取食量與產(chǎn)草量損失曲線進(jìn)行了擬合，并且考慮了補(bǔ)償生長(zhǎng)因子，確定該草場(chǎng)的防治指標(biāo)應(yīng)在5～15頭/m2，防治適期為3齡或3齡以前，并結(jié)合防蝗生態(tài)閾值模型，計(jì)算出當(dāng)?shù)夭輬?chǎng)的生態(tài)經(jīng)濟(jì)閾值為11.04頭/m2，可見計(jì)算結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果相符，說明采用生態(tài)經(jīng)濟(jì)閾值比傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)閾值評(píng)估更貼合實(shí)際[103]。

在防蝗應(yīng)急方案中，針對(duì)大量發(fā)生的遷移性蝗蟲，研究人員研發(fā)了菌藥互補(bǔ)、混配復(fù)配與間隔施藥等應(yīng)急防控技術(shù)，可克服真菌起效慢的弱點(diǎn)，提高防治效果，同時(shí)有效減少化學(xué)農(nóng)藥用量，有利于蝗蟲可持續(xù)防控。研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌與一些化學(xué)農(nóng)藥具有協(xié)同增效作用。比較氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）與金龜子綠僵菌處理的蝗蟲體上10種酶活性變化，表明谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、酯酶（ESTs）和苯酚氧化酶（PO）的活性在初期被抑制，而超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的活性則在處理后的較晚期下降；芳基?；福ˋA）和幾丁質(zhì)酶（CHI）在初期增加，而乙酰膽堿酯酶（AChE）在以后一段時(shí)間增加，它們分別在不同階段調(diào)節(jié)昆蟲對(duì)病原體的免疫和抗性能力。而且菌藥聯(lián)合處理增加了蝗蟲死亡率，研究者推測(cè)協(xié)同作用破壞了宿主中Ca2+的響應(yīng)機(jī)制和宿主體內(nèi)的狀態(tài)的平衡，從而誘導(dǎo)死亡[104]。經(jīng)過兼容性篩選，確定了1%高效氯氰菊酯與100億孢子/mL的綠僵菌油懸浮劑復(fù)配，共毒系數(shù)為263；噴施處理東亞飛蝗，第5 d的死亡率達(dá)到90%以上，比單獨(dú)100億孢子/mL綠僵菌油懸浮劑處理提前7～8 d，并降低化學(xué)農(nóng)藥用量90%，減少了對(duì)環(huán)境的非目標(biāo)生物影響[105]。

荒漠區(qū)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對(duì)較低，蝗蟲幼齡階段為害相對(duì)有限，可適度容忍蝗蟲種群短期生存，此類情形適于應(yīng)用真菌防控。施用的真菌可在幾天或十幾天內(nèi)感染致病蝗蟲，抑制種群發(fā)展，并且在種群及環(huán)境中定殖下來，持續(xù)防治當(dāng)代和后代蝗蟲。在非洲貝寧北部防控稻蝗Hieroglyphus daganensis的田間試驗(yàn)期間，監(jiān)測(cè)到應(yīng)用黃綠綠僵菌油制劑的感染性呈指數(shù)下降，半衰期為6.8 d，但殘存孢子可繼續(xù)感染蝗蟲并占施菌12 d時(shí)總感染量的40%～50%；還開發(fā)了一個(gè)簡(jiǎn)單的宿主-病原體模型用于檢測(cè)殘留孢子在當(dāng)季內(nèi)和季后的感染，結(jié)果表明，殘留孢子濃度的少量增加可使總死亡率大大增加，在蝗蟲種群長(zhǎng)效控制中起至關(guān)重要的作用[106]。在墨西哥使用蝗綠僵菌防治農(nóng)田蝗蟲Sphenarium purpurascens試驗(yàn)中，用分子方法和培養(yǎng)技術(shù)，監(jiān)測(cè)了噴灑的綠僵菌在空氣、土壤和營(yíng)養(yǎng)覆蓋層中的生存持久性，表明在施菌后的 66個(gè)星期內(nèi)，綠僵菌在地表持續(xù)存活，種群數(shù)量顯著波動(dòng)，最高時(shí)達(dá)到初始濃度的4倍，后期逐漸下降到其初始濃度的一半左右?？諝夂蜖I(yíng)養(yǎng)覆蓋層中綠僵菌濃度則穩(wěn)步下降，8個(gè)月后完全消失[107]。在我國(guó)內(nèi)蒙古錫林浩特牧場(chǎng)，應(yīng)用金龜子綠僵菌防治蝗蟲2年后，從試驗(yàn)區(qū)23個(gè)隨機(jī)樣點(diǎn)采集土壤，進(jìn)行了菌株特異性SCAR標(biāo)記檢測(cè)，證明了施用的綠僵菌在田間可長(zhǎng)期保持存活[108]。金龜子綠僵菌能夠在植物根際和根內(nèi)的宿存是其維持田間種群的重要原因，在干旱的內(nèi)蒙古草原監(jiān)測(cè)，綠僵菌施用后種群數(shù)量在30 d內(nèi)快速下降，但能夠在蝗蟲喜食的羊草Leymus chinensis、針茅Stipa grandis根際土壤中以低密度延續(xù)宿存至少75 d；采用菌株熒光蛋白標(biāo)記基因egfp的特異PCR檢測(cè)，證明了綠僵菌在羊草和針茅根內(nèi)宿存[109]。

綠僵菌能夠在蝗蟲種群中擴(kuò)散傳播，是維持長(zhǎng)效防控的重要基礎(chǔ)。當(dāng)種群中病蟲達(dá)到一定比例，綠僵菌疾病可由病蟲傳播給健康蟲體。亞洲小車蝗3齡蝗蝻的罩籠試驗(yàn)表明，將綠僵菌處理3 d后的蝗蝻與未處理蝗蝻按 10:50、20:40、30:30、40:20混合飼養(yǎng)時(shí)，疾病傳播幾率分別可達(dá) 24.6%、31.0%、39.0%和52.0%。以同樣處理和比例進(jìn)行短星翅蝗Calliptamus abbreviatus的混合飼養(yǎng)，疾病傳播幾率分別為15.6%、23.5%、32.7%和40.0%。進(jìn)一步田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在圓形核心區(qū)施用綠僵菌后，施菌區(qū)外都出現(xiàn)蝗蟲感染，感染率隨時(shí)間的推移逐漸上升，在處理后40 d施藥區(qū)外400 m八個(gè)方向的疾病感染率均值可達(dá)8.95%。由此，研究者提出間隔施菌的技術(shù)方案，并進(jìn)行了試驗(yàn)評(píng)價(jià)，結(jié)果在間隔30、60、120 m 的間隔區(qū)域，施菌后49 d校正蟲口減退率分別達(dá)到 58.39%、63.41%、57.17%，證明了蝗蟲移動(dòng)擴(kuò)散的習(xí)性可以有效地將病原傳播到未處理區(qū)域，這種間隔施藥方式可以降低成本、提高效益，在推廣綠僵菌防治蝗蟲技術(shù)中有重要意義[110]。

4.2 真菌防蝗應(yīng)用

鑒于沙漠蝗的大規(guī)模暴發(fā)和為了減少化學(xué)農(nóng)藥的污染，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織在 21世紀(jì)初成立了一個(gè)獨(dú)立的咨詢機(jī)構(gòu)，即農(nóng)藥裁判組（PRG），其作用是基于糧農(nóng)組織獲得的各類科學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)可能用于蝗蟲防控的制劑提出有效性、環(huán)境安全性和對(duì)非靶標(biāo)生物風(fēng)險(xiǎn)性等預(yù)測(cè)，為受蝗災(zāi)影響的國(guó)家選擇合適的殺蟲劑提供建議。在咨詢的備用產(chǎn)品庫(kù)中，生物農(nóng)藥綠僵菌和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被推薦為新的替代品[111]。在美國(guó)，為了防治西部種植區(qū)每年夏天的蝗蟲和蟋蟀侵?jǐn)_，美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)局和相關(guān)科研機(jī)構(gòu)專家建議采用綠僵菌、白僵菌等真菌殺蟲劑，并對(duì)種植者進(jìn)行技術(shù)培訓(xùn)[112]。在我國(guó)，20年來持續(xù)開展以綠僵菌為主的草原蝗蟲綠色防控技術(shù)研究和推廣，在內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等草原區(qū)域進(jìn)行了大規(guī)模示范，自 2012年起綠僵菌產(chǎn)品被列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部防控蝗蟲災(zāi)害的推薦產(chǎn)品。

利用綠僵菌防治蝗蟲是國(guó)內(nèi)外微生物防治害蟲最成功的實(shí)例之一。國(guó)際合作 LUBILOSA項(xiàng)目成功研發(fā)了綠僵菌產(chǎn)品GreenMuscle，連續(xù)多年在撒哈拉地區(qū)和非洲其他地區(qū)應(yīng)用。通常的用法是在2 L的油基中加100 g孢子粉，配置成均勻懸浮劑，超低容量噴霧用于1 ha，即用量大約5×1012孢子/ha。在貝寧3個(gè)區(qū)域的環(huán)境系統(tǒng)進(jìn)行了防蝗示范，調(diào)查顯示，貝寧南部區(qū)域在施菌后10 d，蝗蟲5齡或成蟲的數(shù)量下降了90%；貝寧北部試驗(yàn)區(qū)中，茂密的植被不適于噴霧，但蝗蟲的取食活動(dòng)能從植物中補(bǔ)償?shù)揭欢ㄦ咦?，在施菌?4 d防效可達(dá)70%。在其他區(qū)域的示范也獲得了類似的結(jié)果[113]。項(xiàng)目結(jié)束后，產(chǎn)品繼續(xù)商業(yè)化應(yīng)用于非洲、亞洲多國(guó)的沙漠蝗和其他蝗蟲防控。

另一個(gè)成功應(yīng)用案例是綠僵菌防蝗產(chǎn)品 Green Guard被澳大利亞蝗災(zāi)管理委員會(huì) APLC（Australia’s Plague Locust Commission）批準(zhǔn)，在1998年11月到1999年3月間，用于超低容量的飛機(jī)噴灑，在東亞飛蝗的若蟲發(fā)生地帶進(jìn)行防治。經(jīng)調(diào)查，在高粱作物、開闊的草原或開闊的林地，施菌量3～4×1012分生孢子/hm2的條件下，處理后蝗蟲的存活率下降到10%以下。在較低劑量或茂密的林地中，蝗蟲種群下降較小，施菌處理后一周內(nèi)，蝗蟲種群數(shù)量變化不大，但隨后移動(dòng)范圍迅速減小、速度變慢。在植被高大、茂密的區(qū)域，噴灑后，幼蟲種群數(shù)量下降較慢，有的幼蟲移動(dòng)范圍擴(kuò)大，有的甚至移出處理區(qū)域。在用綠僵菌處理過的地帶，若蟲很少蛻變?yōu)槌上x，即種群受到了抑制。相比之下，在鄰近未經(jīng)處理的地區(qū)有許多成蟲集群，必須使用化學(xué)殺蟲劑加以控制。澳大利亞APLC據(jù)此制定并實(shí)行了蝗蟲防控指導(dǎo)方案，為在集群小、直接為害力有限的若蟲階段開始介入處理。試驗(yàn)示范明確了綠僵菌Green Guard能夠有效抑制本地低容度飛蝗種群，它可作為蝗害預(yù)防控制計(jì)劃的重要組成部分。綠僵菌對(duì)蝗蟲的致死作用較慢，但不會(huì)妨礙其在此類方案中抑制蝗害的作用[114]。中國(guó)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和田間試驗(yàn)下也評(píng)估了澳大利亞Green Guard產(chǎn)品的防蝗效果。在實(shí)驗(yàn)室中，Green Guard產(chǎn)品導(dǎo)致東亞飛蝗4齡若蟲70%～80%的死亡率。在天津和河南省進(jìn)行的田間試驗(yàn)中，應(yīng)用Green Guard油懸浮劑，使用背負(fù)式噴霧器處理了40 hm2（2002年）和160 hm2（2003年）草地，劑量為50～125 g孢子配制在1125～1500 mL油基中，用于1 hm2的超低容量噴霧，施菌處理8～11 d后，田間種群減少了65%～97%[115]。

在墨西哥，也利用綠僵菌防治包括蝗蟲在內(nèi)的多種害蟲。根據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)食品質(zhì)量安全管理局SENASICA（Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria）2017年的報(bào)告，在墨西哥不同州，應(yīng)用蝗綠僵菌在 41698 hm2進(jìn)行了施菌處理，以控制不同種類的蝗蟲和蚱蜢，包括 Schistocerca piceifrons piceifrons，Melanoplus sp.，Sphenarium sp.，Brachystola sp.[116]。

在埃及，對(duì)商業(yè)制劑Bioranza（金龜子綠僵菌）和Biovar（球孢白僵菌）進(jìn)行了沙漠蝗防效評(píng)估，結(jié)果表明，無論對(duì)若蟲直接噴灑油性菌劑，還是通過土壤處理的間接施用，綠僵菌對(duì)蝗蟲的感染死亡率和快速效果均比球孢白僵菌高得多[117]。

在國(guó)內(nèi)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所（原生物防治研究所）從20世紀(jì)90年代初期開始昆蟲病原真菌防蝗應(yīng)用研究，不僅評(píng)估了不同綠僵菌菌株對(duì)東亞飛蝗的毒力[67]，還在天津北大港水庫(kù)蝗區(qū)，以綠僵菌孢子不同濃度的油劑噴霧進(jìn)行防蝗試驗(yàn)，在田間處理后第10 d校正死亡率為81.5%，人工模擬小區(qū)試驗(yàn)在第10 d供試蟲全部死亡[118]，另外進(jìn)行了10 hm2的田間試驗(yàn)，證明綠僵菌田間治蝗的良好效果[119]。20多年來，綠僵菌菌劑在北方多省區(qū)草原大面積應(yīng)用。在新疆，用綠僵菌油劑防治干旱荒漠草原和山地草原蝗蟲試驗(yàn)，表明真菌殺蟲劑油劑具有殺蟲譜廣（對(duì)蝗總科昆蟲均有效）、容易大規(guī)模生產(chǎn)、便于低容量噴霧和適于干旱氣候等優(yōu)點(diǎn)[120,121]。在內(nèi)蒙古草原進(jìn)行了用綠僵菌油劑超低量噴霧防治蝗蟲的試驗(yàn)，表明菌劑對(duì)5種蝗蟲（亞洲小車蝗、紅翅皺膝蝗、毛足棒角蝗、白邊痂蝗、輪紋異痂蝗）的防效顯著。噴藥后8 d，對(duì)主要蝗蟲亞洲小車蝗（占混合蟲口的92.2%）的防治效果達(dá)48.0%，12 d后增至88.1%。死亡蟲體上的綠僵菌孢子的擴(kuò)散有可能繼續(xù)起著控制蝗蟲蟲口密度的作用[122]。在甘肅用黃綠綠僵菌餌劑和油劑防治草原蝗蟲，蟲種有祁連山痂蝗Bryodema qilianshanenensis等幾種，投撒餌劑后用樣筐取樣調(diào)查，顯示7和12 d的平均防效為66.5%和76.7%；油劑試驗(yàn)以靜電超低容量噴霧，防效高于綠僵菌餌劑，7和12 d的平均防效為75.8%和84.6%。施藥后3～4 d感病死亡的蟲態(tài)多為4～5齡若蟲，25 d后出現(xiàn)死亡成蟲，之后2周仍陸續(xù)有死亡蟲體，表明綠僵菌有較好持續(xù)控制效果[123]。多年來，在新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、青海等地都有大面積示范推廣試驗(yàn)，表明綠僵菌制劑可迅速達(dá)到控制高密度蝗群的目標(biāo)，還能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期傳播控制，致使蝗群不能為害成災(zāi)[1]。綠僵菌產(chǎn)品還在河灘、湖區(qū)荒灘等蝗蟲滋生地防治東亞飛蝗的低齡蝗蝻[124,125]，有效抑制其種群發(fā)育，防止成蟲集群起飛，把可能對(duì)農(nóng)區(qū)的大規(guī)模為害遏制在種群遷飛之前。

另外，還有廣譜的球孢白僵菌產(chǎn)品可用于防治蝗蟲及其他害蟲，如在美國(guó)注冊(cè)的產(chǎn)品Mycotrol可防治各種害蟲，包括蝗蟲和蚱蜢。LUBILOSA項(xiàng)目在西非的試驗(yàn)中也測(cè)試了球孢白僵菌，但發(fā)現(xiàn)在田間環(huán)境的高溫度下，其效力不如綠僵菌菌株。在中國(guó)黑龍江齊齊哈爾索伯臺(tái)草原，應(yīng)用白僵菌100億孢子/mL油懸浮劑防治草原蝗蟲，用量為2250～3000 mL/hm2，藥后7 d達(dá)到作用高峰，平均防效為68.24%～77.44%，防效可持續(xù)7 d[126]。在竹林中用球孢白僵菌防治黃脊竹蝗Ceracris kiangsu跳蝻，得到的校正死亡率達(dá)到68.2%[127]。

有記錄噬蟲霉類真菌可導(dǎo)致田間發(fā)生蝗蟲流行病，說明此類真菌對(duì)蝗蟲具有高致病力，也分離到相關(guān)菌株，但由于難以人工大量培養(yǎng)和貯存，至今未能用于蝗蟲防治實(shí)踐。

5 討論與展望

5.1 昆蟲病原真菌防蝗的優(yōu)勢(shì)與不足

昆蟲病原真菌資源廣泛，專性侵染昆蟲（節(jié)肢動(dòng)物）而對(duì)脊椎動(dòng)物無毒無害，與環(huán)境友好兼容，還具有對(duì)寄主不易產(chǎn)生抗藥性、許多種類可人工大量培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，使之成為最有前景的生物殺蟲劑。近 30年來，針對(duì)蝗蟲的研究進(jìn)展顯示，從綠僵菌、白僵菌等種類可篩選出對(duì)蝗蟲高毒力的菌株，并且可通過常規(guī)篩選或遺傳改良來提高菌株毒力、生長(zhǎng)性狀和抗逆能力，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和可控條件大量培養(yǎng)菌劑，通過改善劑型技術(shù)來維持貯存活力和增強(qiáng)對(duì)蝗蟲的侵染，研究改善施用技術(shù)，使其盡可能適應(yīng)蝗蟲習(xí)性和生態(tài)，以提高防治效果。利用綠僵菌和白僵菌防蝗已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室走向田間應(yīng)用并商業(yè)化。

然而，研究和實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問題，以至于產(chǎn)品注冊(cè)和大規(guī)模示范后也未能大規(guī)模持續(xù)商業(yè)化應(yīng)用。究其原因，在研究和技術(shù)方面可能有以下幾點(diǎn)：1）蝗蟲種類繁多，而菌株殺蟲毒力通常只對(duì)某些蝗蟲種類強(qiáng)而對(duì)其他蝗蟲種類較弱，因此產(chǎn)品對(duì)不同區(qū)域的蝗蟲的防效有波動(dòng)，而市場(chǎng)的普適性要求較高；2）根據(jù)自然規(guī)律，真菌對(duì)蝗蟲的致病過程需要一定時(shí)間，通常需要3～5 d甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能見效，而市場(chǎng)通常期待快速應(yīng)對(duì)嚴(yán)重蝗害；3）真菌防蝗產(chǎn)品價(jià)格相對(duì)較高，即使已研究改進(jìn)了發(fā)酵工藝，仍然由于工藝過程較復(fù)雜，活體貯存條件較高，在應(yīng)用規(guī)模有限的情況下，成本競(jìng)爭(zhēng)力仍不敵化學(xué)農(nóng)藥；4）真菌制劑的使用技術(shù)要求相對(duì)較高，一般需要專業(yè)人員或需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，指導(dǎo)用戶使用時(shí)把握蝗蟲發(fā)育進(jìn)度和掌握避免真菌失活的時(shí)機(jī)，以達(dá)到高效防治。

5.2 真菌防蝗應(yīng)用的策略與展望

鑒于真菌防蝗產(chǎn)品的特點(diǎn)以及當(dāng)前的研究進(jìn)展，作者認(rèn)為，在未來研究中，可進(jìn)一步通過菌種的遺傳改良來提高菌株的毒力、普適性和殺蟲速度，通過改進(jìn)發(fā)酵工藝降低產(chǎn)品成本，通過制劑技術(shù)提高田間殺蟲效果。然而，一個(gè)重要的防治策略是在蝗蝻幼齡期施菌干預(yù)種群發(fā)展以防止蝗災(zāi)暴發(fā)。因?yàn)榛谡婢c蝗蟲各自的生物學(xué)特點(diǎn)及其致病關(guān)系，蝗蟲在幼齡階段擴(kuò)散較慢、為害較小。試驗(yàn)證明，低齡期（2～4齡）比高齡期（5齡）或成蟲更容易感然病害；當(dāng)出現(xiàn)末齡幼蟲或成蟲遷飛時(shí)施菌，可能效果甚微或無濟(jì)于阻止和減少已經(jīng)造成的損害[64,128]。在幼齡蝗蝻期間施用菌劑如綠僵菌等，可使病原真菌在蝗蟲種群中侵染定殖，即使沒有快速引起多數(shù)蟲體發(fā)病死亡，也能夠抑制發(fā)育、減緩擴(kuò)散，同時(shí)蟲體攜帶病原真菌移動(dòng)擴(kuò)散，一旦罹病死亡，便能夠大量增殖病原體并釋放出來，作為新的侵染源再度影響蝗蟲發(fā)育和種群擴(kuò)張。另外，病原真菌具有田間擴(kuò)散性和在根際土壤及植物體內(nèi)中有一定的宿存能力[129,109]，加上一些制劑手段有助于真菌的宿存和增殖，有可能在蝗蟲棲境中長(zhǎng)期保存一定密度的病原種群，借助環(huán)境因子實(shí)時(shí)捕捉機(jī)會(huì)侵染寄主，介入蝗蟲種群的消長(zhǎng)，從而抑制蝗蟲種群暴發(fā)增長(zhǎng)。

為了實(shí)施蝗蝻早期人工干預(yù)的策略，對(duì)蝗蟲滋生發(fā)源地帶的發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)十分重要。蝗蟲多在水域附近荒灘產(chǎn)卵孵化，這些區(qū)域通常遠(yuǎn)離監(jiān)視，無人治理或無主管理，因此蝗蝻種群得以順利發(fā)展、集群乃至暴發(fā)遷飛到農(nóng)田為害作物。對(duì)于無人治理或無主管理的蟲源地帶，因經(jīng)濟(jì)效益低，還不能商業(yè)化進(jìn)入，只能依靠政府和公益性組織的聯(lián)合，通過大數(shù)據(jù)如高空遙感監(jiān)測(cè)結(jié)合氣象與生物學(xué)信息等，發(fā)布監(jiān)測(cè)預(yù)警，及時(shí)組織人工干預(yù)或征購(gòu)商業(yè)服務(wù)。

蝗災(zāi)防控涉及經(jīng)濟(jì)和生態(tài)的長(zhǎng)期綜合管理，當(dāng)前沙漠蝗嚴(yán)重?cái)U(kuò)張為害，再次引起各國(guó)政府和相關(guān)行業(yè)的重視。從真菌防蝗研究與應(yīng)用進(jìn)展上看，以綠僵菌為主的真菌防蝗技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，無論在不同地區(qū)的防蝗效果或規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)都能夠支持參與大規(guī)?；群Ψ揽兀勺鳛榛认x防控的重要組成部分。根據(jù)其特點(diǎn)和防效評(píng)估，真菌防蝗更適于在蝗蝻期施用，以干預(yù)種群發(fā)展、避免暴發(fā)成災(zāi)。通過技術(shù)完善和市場(chǎng)優(yōu)化，具有高效、長(zhǎng)效和環(huán)境友好特性的昆蟲病原真菌產(chǎn)品必將在蝗災(zāi)防控中發(fā)揮更重要的作用。