華梅,王垚,肖支葉,原曉龍,王娟,楊宇明,王毅

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201;3.云南大學(xué) 中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650091;4.西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院,云南 昆明 650224)

綠僵菌屬于半知菌亞門叢梗孢目瘤座孢科綠僵菌屬(MetarhiziumSorokin)真菌，是1種具有很強(qiáng)致病性的昆蟲病原真菌，能寄生于螨類和線蟲體內(nèi)，共包含13個種[1-3]。目前對綠僵菌屬真菌的研究主要集中在以下幾個方面：綠僵菌的分離鑒定、固態(tài)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵及作為環(huán)境友好的真菌殺蟲劑等。杜開書等[4]、張亞波等[5]對1株綠僵菌進(jìn)行分離鑒定，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，經(jīng)培養(yǎng)特征和形態(tài)學(xué)鑒定確定此綠僵菌為金龜子綠僵菌(M.anisopliae)。研究人員對綠僵菌的固相發(fā)酵及液態(tài)深層發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，分析液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基及其厚度、淺盤固體發(fā)酵、袋裝固體發(fā)酵對金龜子綠僵菌生長及產(chǎn)孢量的影響[6-9]。除此之外，研究了綠僵菌對土壤害蟲的防治[10]、草原蝗蟲(Chorthippusspp.)防治[11]、馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)防治[12]及花生蠐螬(Holotrichiaparallela)的致病力[13]。目前，以綠僵菌為代表的昆蟲病原真菌已被開發(fā)為環(huán)境友好的真菌殺蟲劑。

以冬蟲夏草、蛹蟲草為代表的昆蟲病原真菌具有良好的醫(yī)藥保健功能，研究人員曾對蟲生真菌生防效果及其代謝產(chǎn)物活性進(jìn)行了研究[14]。對綠僵菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)綠僵菌代謝產(chǎn)物中含有聚酮化合物[15-16]、苦馬豆素[17]、生物堿[18]等有效成分。綠僵菌代謝產(chǎn)物還具有提高免疫力、抑制腫瘤、抗突變、抗輻射、抗氧化等生物活性[19-21]。綠僵菌代謝產(chǎn)物具有一定的抑菌潛能，焦彥朝等人發(fā)現(xiàn)戴氏蟲草(Cordycepstaii)的無性型—戴氏綠僵菌(Metarhiziumtaii)88-601菌株菌絲體乙醚浸提液對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(B.subtilis)有明顯的拮抗作用[22-23]。從已報道的對綠僵菌的研究來看，主要集中于金龜子綠僵菌及戴氏綠僵菌的研究。除楊俐等[24]對貴州綠僵菌(M.guizhouense)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶有一系列的研究外，對綠僵菌其余種在化學(xué)成分和生物活性方面的研究還存在大量的空白。

本研究擬采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，對蟲草中分離出的4種綠僵菌進(jìn)行液體培養(yǎng)。培養(yǎng)獲得的綠僵菌培養(yǎng)液經(jīng)乙酸乙酯處理后，得到綠僵菌初提物。將綠僵菌初提物分別對13種致病菌進(jìn)行活性篩選，以期找到能產(chǎn)生抗菌效果的綠僵菌，為下一步大量培養(yǎng)抗菌型綠僵菌真菌，分離提純抗菌活性化合物及功能基因的研究作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4株從蟲草中分離得到的綠僵菌由云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室虞泓教授饋贈，經(jīng)形態(tài)及ITS鑒定為黃綠綠僵菌(M.flavoviride)、貴州綠僵菌、棕色綠僵菌(M.brunneum)、金龜子綠僵菌。

1.2 供試菌種

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、緩慢芽孢桿菌(B.lentus)、無乳鏈球菌(Streptcococcusagalactiae)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、 副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、 溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、銅尿假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)、乙型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaparatyphiB)、大腸埃希菌(Escherichiacoilcoli)。13種供試菌種由昆明市食品藥品檢驗(yàn)所贈送。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 4種綠僵菌菌種的活化

配制MY固體培養(yǎng)基(麥芽糖提取物20g，葡萄糖6g，酵母提取物2g，瓊脂8g，用水定容至1L)，滅菌冷卻后，在無菌條件下，鉤取已經(jīng)鑒定好的母種綠僵菌接于斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫暗培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面后用于綠僵菌菌絲體的液體培養(yǎng)。

1.3.2 綠僵菌菌絲體的液體培養(yǎng)

將4種綠僵菌菌絲體分別接種于100mL的OMAM液體培養(yǎng)基(大豆蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母提取物1g，蔗糖20g,用水定容至1L)中，置于28℃，轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床中培養(yǎng)10d。

1.3.3 綠僵菌初提物的提取

在4種綠僵菌培養(yǎng)物中分別加入100mL的乙酸乙酯，振蕩混勻，于室溫下超聲提取1h。將綠僵菌初提液倒入4層紗布中過濾，去除綠僵菌菌絲體。濾液在分液漏斗中混合均勻，靜置過夜分液，后取上層液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮致干，稱重，加入二甲基亞砜(DMSO)做抗菌活性篩選。

1.3.4 綠僵菌初提物抑菌活性檢測

13種供試細(xì)菌菌株懸浮液的制備、濾紙片法篩選綠僵菌初提物的抑菌活性及二倍稀釋法對最低抑菌活性(MIC)的測定方法參照文獻(xiàn)[25-27]。

1.3.5 綠僵菌初提物抑菌活性生物學(xué)重復(fù)

將活化的4種綠僵菌菌種分別按照菌絲體液體培養(yǎng)的方法平行培養(yǎng)各3瓶，培養(yǎng)物均按照1.3.3的方法進(jìn)行提取，所得乙酸乙酯初提物按照1.3.4的方法進(jìn)行抑菌活性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠僵菌乙酸乙酯萃取初提物的得率及被試液濃度

4種綠僵菌培養(yǎng)液經(jīng)1︰1乙酸乙酯萃取后初提物的得率及DMSO溶解后被試液濃度見表1。從表1可以看出，綠僵菌乙酸乙酯初提物平均得率最高的為棕色綠僵菌，得率為3.112mg/mL。

2.2 綠僵菌乙酸乙酯初提物抑菌活性

將4種綠僵菌分別在OMAM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用乙酸乙酯萃取后得初提物，將4種綠僵菌初提物對13種致病細(xì)菌進(jìn)行抗菌活性篩選，抑菌效果見表2。

表1 4種綠僵菌萃取液得率及被試液濃度 (means±SD,n=3)Tab.1 Extraction yield of four species of Metarhizium and concentration of the test solution

從表2可知，4種綠僵菌乙酸乙酯初提物具有一定的抗菌活性，其中黃綠綠僵菌初提物對蠟樣芽孢桿菌和緩慢芽孢桿菌具有抑制作用，貴州綠僵菌初提物對蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌和溶血性葡萄球菌具有抑制作用，棕色綠僵菌初提物對蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、藤黃微球菌產(chǎn)生抑制效果，金龜子綠僵菌對蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌產(chǎn)生抑制。4種綠僵菌均對蠟樣芽孢桿菌和緩慢芽孢桿菌產(chǎn)生抑制作用，抑菌效果最好的為金龜子綠僵菌，抑菌圈直徑分別為10.02±0.07mm和12.53±0.02mm。棕色綠僵菌和金龜子綠僵菌均對副溶血性弧菌革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抑制作用，金龜子綠僵菌抑制效果較好。除了黃綠綠僵菌外，其余3種綠僵菌均對溶血性葡萄球菌陰性菌產(chǎn)生抑制作用，由金龜子綠僵菌液體培養(yǎng)后所產(chǎn)生的粗提物的抑菌效果最好。僅有棕色綠僵菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能對藤黃微球菌產(chǎn)生抑菌效果。4種綠僵菌對表2中所列的5種供試菌有抗菌活性，對其余8種供試菌均不具有抗菌活性。綜上所述，4種綠僵菌中，金龜子綠僵菌具有較好的抗菌活性。

表2 4種綠僵菌乙酸乙酯粗提物抑菌活性(means±SD,n=3)Tab.2 Antibacterial activities of ethyl acetate extracts from 4 species of Metarhizium

2.3 綠僵菌抗菌初提物MIC

采用二倍稀釋法，對4種綠僵菌初提物進(jìn)行逐級稀釋，分別滴加10μL不同濃度的4種綠僵菌初提物稀釋液于試驗(yàn)樣片，滴加10μL原始濃度的4種綠僵菌作為陽性對照，滴加10μL DMSO液作為陰性對照。將試驗(yàn)樣片和對照樣片貼放培養(yǎng)皿表面與相應(yīng)致病菌進(jìn)行MIC測定，結(jié)果見表3。

表3 4種綠僵菌提取物MIC測定Tab.3 The minimum inhibitory concentration (MIC) of ethyl acetate extracts from 4 Metarhizium spp. mg/mL

從表3中可以看出，同種綠僵菌所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對不同的供試細(xì)菌的最低抑制濃度各不相同，不同綠僵菌所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對相同的供試細(xì)菌的最低抑制濃度也各不相同。貴州綠僵菌對蠟樣芽胞桿菌和緩慢芽孢桿菌的最低抑制濃度為6.45mg/mL，對溶血性葡萄球菌的最低抑制濃度為3.23mg/mL(為4種綠僵菌中對對應(yīng)細(xì)菌最低的MIC)。金龜子綠僵菌對副溶血性弧菌的最低抑菌濃度為6.86mg/mL。棕色綠僵菌對5種細(xì)菌均有抑制作用，對藤黃微球菌的最低抑菌濃度為13.9mg/mL。

3 結(jié)論與討論

昆蟲內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物具有廣泛的生物活性，從已報道的幾株昆蟲內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物中分離到多種具有抗菌、抗腫瘤及抗氧化的活性化合物[28]，同時發(fā)現(xiàn)昆蟲內(nèi)生真菌對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性。

蟲草是一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的藥理作用[29]。隨著經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，人們對蟲草市場需求與日俱增，在利益的驅(qū)動下，蟲草野生資源瀕臨枯竭。研究表明，人工發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌絲體與天然冬蟲夏草在活性組分、藥理作用等方面具有高度相似性。綠僵菌為蟲草蟲體部位的內(nèi)生真菌，綠僵菌代謝產(chǎn)物具有一定的抑菌潛能，已報道戴氏蟲草的無性型—戴氏綠僵菌88-601菌株菌絲體乙醚浸提液對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、枯草桿菌有明顯的拮抗作用[23]。

本研究采用液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法，將蟲草中分離得到的4種綠僵菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)乙酸乙酯處理后旋干得初提物。采用抑菌圈法對4種綠僵菌乙酸乙酯初提物進(jìn)行抑菌活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種綠僵菌均具有一定的抑菌活性，棕色綠僵菌初提物同時對5種供試細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，其中對藤黃微球菌的最低抑菌濃度為13.9mg/mL。貴州綠僵菌初提物對蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌和溶血性葡萄球菌具有抑制作用，對溶血性葡萄球菌的最低抑菌濃度為3.23mg/mL。貴州綠僵菌提取物對蠟樣芽胞桿菌的最低抑菌濃度(MIC 6.45mg/mL)明顯優(yōu)于南五味子(Kadsuralongipedunculata)乙醇提取物(MIC 15.62mg/mL)及甜葉菊(Steviarebaudiana)廢渣提取物(MIC 12.5mg/mL)對蠟樣芽胞桿菌的最低抑菌濃度[30-31]。黃綠綠僵菌初提物對蠟樣芽孢桿菌和緩慢芽孢桿菌具有抑制作用，對緩慢芽孢桿菌的最低抑制濃度為16.5mg/mL。金龜子綠僵菌初提物對蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌產(chǎn)生抑制，對后3種細(xì)菌的最低抑菌濃度均為6.86mg/mL。因4種綠僵菌均具有不同程度的抑菌效果，可進(jìn)行菌絲體大量的液體培養(yǎng)，獲得較多的抗菌初提物，以期分離純化其中的抗菌化合物，對抗菌化合物進(jìn)行分析和鑒定，為開發(fā)蟲生真菌抗菌劑奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]全宇,劉永翔,劉作易.綠僵菌屬分類的研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(10):113-117.

[2]黃勃,樊美珍,李增智.綠僵菌屬系統(tǒng)分類的研究進(jìn)展(綜述)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,29(2):169-172.

[3]Gao Q,Jin K,Ying S H,etal.Genome sequencing and comparative transcriptomics of the model entomopathogenic fungiMetarhiziumanisopliaeandM.acridum[J].PLoS Genet,2011,7(1):e1001264.

[4]杜開書,柴立英,徐艷聆,等.一株綠僵菌的分離研究[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(6):57-60.

[5]張亞波,吳盼盼,舒金平.一株綠僵菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].林業(yè)科學(xué),2012,48(12):134-140.

[6]宋漳.液體深層培養(yǎng)貴州綠僵菌分生孢子的研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報,1997,17(3):205-208.

[7]宋漳.液體深層培養(yǎng)綠僵菌分生孢子的研究[J].林業(yè)科學(xué),2001,37(5):134-139.

[8]許天委,張世清,黃俊生.金龜子綠僵菌的液固雙相發(fā)酵研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,42(2):93-97.

[9]蔡守平.綠僵菌MaZPTR-01菌株固體發(fā)酵條件篩選研究[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,36(5):100-105.

[10]張學(xué)玲.一株綠僵菌的生物學(xué)特性和殺蟲活性的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[11]劉宗祥,常明,代建聰,等.綠僵菌防治草原蝗蟲田間效果[J].草業(yè)科學(xué),2004,21(8):68-70.

[12]宋漳,陳輝,盧鳳美.綠僵菌液體培養(yǎng)的條件及其對馬尾松毛蟲的毒力[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2002,8(4):403-407.

[13]申劍飛,王中康,張建偉,等.兩株綠僵菌菌株的分離鑒定及其對花生蠐螬的致病力[J].中國生物防治學(xué)報,2012,28(3):334-340.

[14]楊運(yùn)華.四株蟲生真菌生防效果及其代謝產(chǎn)物活性研究[D].新鄉(xiāng)：河南科技學(xué)院,2013.

[15]路宏朝.金龜子綠僵菌代謝產(chǎn)物中有效成分的初步研究[D].咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.

[16]Kong X,Ma X,Xie Y,etal.Aromatic polyketides from a sponge-derived fungusMetarhiziumanisopliaemxh-99 and their antitubercular activities[J].Archives of Pharmacal Research,2013,36(6):739.

[17]李錫杰.金龜子綠僵菌菌絲體及發(fā)酵液中苦馬豆素的提取與分離[D].咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué),2009.

[18]孔平,李倩,李永娟,等.金龜子綠僵菌代謝產(chǎn)物成分預(yù)試驗(yàn)及其生物堿的獲得[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(2):226-228.

[19]何亞瓊,胡豐林,王利,等.蟲草及其無性型中的抗腫瘤細(xì)胞活性成分[J].生物學(xué)雜志,2008,26(1):1-4.

[20]張曉杰.戴氏綠僵菌抗腫瘤活性及其次生代謝產(chǎn)物的測定與分離純化[D].遵義：遵義醫(yī)學(xué)院,2012.

[21]莊夢敏.幾株綠僵菌清除自由基活性物質(zhì)及代謝組學(xué)的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[22]焦彥朝,梁宗琦.戴氏蟲草無性型的研究—Ⅰ.抗生素[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,1992,9(4):46-48.

[23]Xiao D M,Xiao J H,Zhang Z M,etal.Antimicrobial potential ofMetarhiziumtaiiinvitro[J].Zhong yao cai,Journal of Chinese medicinal materials,2010,33(6):952-957.

[24]楊俐,張濤,李曉紅,等.固態(tài)發(fā)酵貴州綠僵菌產(chǎn)殼聚糖酶的親和層析純化及其性質(zhì)研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2007,38(4):713-716.

[25]肖支葉,胡唐閣然,王四海,等.蒜頭果根粗提取物的抑菌活性研究[J].西部林業(yè)科學(xué),2017,46(2):68-73,82.

[26]趙能,原曉龍,華梅,等.地衣型真菌次級代謝產(chǎn)物抗菌活性初步研究[J].廣西植物,2017,37(2):242-247.

[27]馬長樂,黃曉霞,艾星梅,等.云南榧內(nèi)生菌的分離及抗植物病原菌活性篩選[J].西部林業(yè)科學(xué),2014,43(4):10-14.

[28]郭玲芝,劉呈雄,徐幫,等.一株昆蟲內(nèi)生真菌Alternariasp.次級代謝產(chǎn)物研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2014,26(2):306-310.

[29]王曉瑞,林善,柳志強(qiáng).冬蟲夏草人工培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015,34(7):1569-1574.

[30]劉麗,于新,劉文朵,等.南五味子不同溶劑提取物抑菌活性及其組分性質(zhì)研究[J].中國食品學(xué)報,2013,13(9):147-151.

[31]趙磊,林文軒,遲茜,等.甜葉菊廢渣提取物抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技,2016,38(24):168-172.