白藜蘆醇通過(guò)上調(diào)annexin A1表達(dá)促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系向M2型極化

林 敏，張紅梅

(重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院 藥學(xué)部， 重慶 404000)

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的固有免疫細(xì)胞，是缺血性卒中發(fā)生后神經(jīng)炎性反應(yīng)的啟動(dòng)細(xì)胞和最主要的反應(yīng)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞獨(dú)特的經(jīng)典激活M1型和替代激活M2型兩種極化形式，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞由促炎M1型向抗炎M2型極化有利于減輕缺血性腦損傷。白藜蘆醇作為天然的抗炎物質(zhì)，可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化從而減輕急性缺血卒中后神經(jīng)炎性反應(yīng)，但具體機(jī)制尚不清楚。

研究證實(shí)，annexin A(ANXA1)是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，富集于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞，在外周和中樞免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要的抗炎作用。ANXA1可促進(jìn)氧糖剝奪的小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而減輕神經(jīng)元損傷[1]。目前，白藜蘆醇對(duì)ANXA1的作用尚無(wú)報(bào)道，本研究通過(guò)體外構(gòu)建氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型，首次探討白藜蘆醇對(duì)OGD/R小膠質(zhì)細(xì)胞ANXA1表達(dá)的影響，及ANXA1在白藜蘆醇調(diào)控OGD/R小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：兔抗ANXA1抗體(Abcam公司)、兔抗β-actin抗體(CST公司)，HRP-conjugated Affinipure羊抗兔IgG和594-conjugated羊抗兔IgG(H+L)(Proteintech公司)，5%牛血清白蛋白、Prime ScriptTMRT with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司)和DME/F12培養(yǎng)基(Gibco公司國(guó))、白藜蘆醇(Sigma-Aldrich公司)，ANXA1相關(guān)慢病毒(上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)公司)。

1.1.2 細(xì)胞：大鼠來(lái)源的小膠質(zhì)細(xì)胞系N9(上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理:將N9細(xì)胞隨機(jī)分組，未經(jīng)OGD/R處理組細(xì)胞：OGD/R(-)組，構(gòu)建OGD/R模型細(xì)胞：OGD/R(+)組，經(jīng)Res處理的OGD/R(+)細(xì)胞：OGD/R(+)+Res組，經(jīng)Res及空載慢病毒LV-Scramble處理的OGD/R(+)細(xì)胞：OGD/R(+)+Res+LV-Scramble組，經(jīng)Res及沉默慢病毒LV-Scramble處理的OGD/R(+)細(xì)胞：OGD/R(+)+Res+LV-Scramble組。

構(gòu)建N9細(xì)胞OGD/R模型：將正常培養(yǎng)的N9小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基更換為D-Hanks液，并將細(xì)胞置于厭氧孵育箱中培養(yǎng)3 h，取出細(xì)胞，將D-Hanks液更換為完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h(見參考文獻(xiàn)[2])。

慢病毒干預(yù)：慢病毒LV-shAnxA1(1×109transduction unit，TU/mL)和LV-Scramble(1×109transduction unit，TU/mL)按MOI=10(TU/細(xì)胞)感染慢病毒，培養(yǎng)3天后采用RT-qPCR和Western blot驗(yàn)證慢病毒感染效率，感染成功方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)ANXA1、TNF-α、IL-1β、IL-10、Arg-1和IL-1β mRNA表達(dá)：選取20 μmol/L濃度的白藜蘆醇處理OGD/R模型N9細(xì)胞(見參考文獻(xiàn)[3])，24 h后收集各組細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書提取各組細(xì)胞的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。以1.0 μL cDNA為模板，按10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primer

1.2.3 Western blot檢測(cè)ANXA1和CD11b蛋白含量:白藜蘆醇處理24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑(100∶1)提取細(xì)胞全蛋白，BCA`法測(cè)定各樣品的蛋白質(zhì)濃度。按照30 μg進(jìn)行上樣，10% SDS-PAGE分離蛋白，加入含細(xì)胞裂解液和PMSF(100∶1)的混合液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白上樣量為30 μg。采用10% SDS-PAGE分離蛋白，后采用250 mA恒流對(duì)0.45 μm PVDF膜進(jìn)行電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜先后進(jìn)行封閉、分別孵育ANXA1和CD11b相應(yīng)的一抗(4抗過(guò)夜)，次日取出PVDF膜，TBST漂洗后孵育相應(yīng)二抗。采用Fusion凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影、分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)ANXA1蛋白表達(dá)：白藜蘆醇處理24 h后，采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS反復(fù)漂洗細(xì)胞，先后采用0.1% Triton X-100破膜、5% BSA封閉細(xì)胞、孵育相應(yīng)ANXA1一抗(4 ℃過(guò)夜)，次日取出細(xì)胞爬片，孵育相應(yīng)二抗，PBS漂洗后孵育DAPI，最后用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察、攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇上調(diào)OGD/R模型N9細(xì)胞內(nèi)ANXA1表達(dá)

與OGD/R(-)組相比，OGD/R(+)組細(xì)胞內(nèi)ANXA1 mRNA和蛋白含量顯著增多(P<0.01)，OGD/R(+)+Res組ANXA1 mRNA和蛋白較OGD/R(+)組進(jìn)一步增多(圖1A,B)。OGD/R(+)組ANXA1蛋白核轉(zhuǎn)位較OGD/R(-)組明顯增多，OGD/R(+)+Res組ANXA1蛋白主要分布在細(xì)胞漿(圖1C)。

A.expression of ANXA1 mRNA in each group was detected by RT-qPCR; B.expression of ANXA1 protein in each group was detected by Western blot; C.expression of ANXA1 protein microglia was detected by immunofluorescence; *P<0.01, **P<0.001 compared with OGD/R (-) group; #P<0.01, ##P<0.001 compared with OGD/R (+) group; scale bar=100 μm圖1 白藜蘆醇有效上調(diào)OGD/R小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ANXA1 mRNA和蛋白表達(dá)Fig 1 Resveratrol effectively up-regulated the expression of ANXA1 mRNA and protein in OGD/R

2.2 慢病毒LV-shAnxA1有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ANXA1表達(dá)

OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組細(xì)胞內(nèi)ANXA1 mRNA和蛋白含量較OGD/R(+)+Res+LV-Scramble組和OGD/R(+)+Res組明顯下降(P<0.01)(圖2A,B)。與OGD/R(+)+Res組相比， OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組ANXA1蛋白含量很低(P<0.01)，ANXA1主要位于細(xì)胞核(圖2C)。

A.expression of ANXA1 mRNA in each group was detected by RT-qPCR; B.expression of ANXA1 protein in each group was detected by Western blot; C.expression of ANXA1 protein in microglia was detected by immunofluorescence; *P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res group; #P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res+LV-Scramble group; scale bar=100 μm圖2 慢病毒LV-shAnxA1有效抑制ANXA1表達(dá)Fig 2 Lentivirus LV-shAnxA1 effectively inhibited ANXA1

2.3 沉默ANXA1對(duì)白藜蘆醇抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組細(xì)胞內(nèi)CD11b蛋白含量較OGD/R(+)+Res組明顯增高(P<0.01)。

與OGD/R(+)+Res組相比，OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組TNF-α和IL-1β mRNA含量均明顯增高(P<0.001)，Arg-1和IL-10 mRNA含量均顯著降低(P<0.01，P<0.001)(圖3)。

A.expression of CD116 protein in group was detected by Western blot; B.histogram represents quantative analysis of CD116 protein content in each group; C.expression of TNF-α, IL-1β, Arg-cand, IL-10 mRNA in each group was detected by RT-qRCR;*P<0.001, **P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res group; #P<0.001, ##P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res+LV-Scramble group圖3 白藜蘆醇通過(guò)上調(diào)ANXA1抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活Fig 3 Resveratrol inhibited microglial activation by up-regulating

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)是急性缺血性卒中后諸多復(fù)雜病理機(jī)制的核心環(huán)節(jié)。調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞由促炎M1型向抗炎M2型轉(zhuǎn)換是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)鍵策略。明確白藜蘆醇調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化的具體機(jī)制是探索白藜蘆醇減輕急性缺血性卒中后神經(jīng)炎性反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)[4-5]。ANXA1是膜聯(lián)蛋白家族中第一個(gè)以鈣依賴的方式與細(xì)胞膜結(jié)合，受糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖及分化等[6]。卒中實(shí)驗(yàn)鼠和患者外周ANXA1的水平明顯降低與血栓炎性反應(yīng)相關(guān)，而外源性給予ANXA1可減少血小板活化和血栓形成，該效應(yīng)與體內(nèi)整合素合成被抑制有關(guān)[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)OGD/R在誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ANXA1合成增多，這與報(bào)道[8-9]一致。研究證實(shí)，富集于CNS小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的ANXA1可通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，從而減輕急性缺血性卒中后神經(jīng)炎性反應(yīng)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可促進(jìn)OGD/R小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ANXA1表達(dá)增多。為證實(shí)上述變化是一種伴隨現(xiàn)象抑或具有生理學(xué)意義，采用慢病毒LV-shAnxA1沉默AnxA1表達(dá)后，白藜蘆醇未能有效上調(diào)ANXA1表達(dá)，且ANXA1蛋白核轉(zhuǎn)位明顯減少，推測(cè)這與ANXA1表達(dá)減少相關(guān)。

生理狀態(tài)下ANXA1蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)，OGD/R可誘導(dǎo)ANXA1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，參與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，這與ANXA1與BH3相互作用域死亡激動(dòng)劑(BH3-interacting-domain death agonist，Bid)啟動(dòng)子直接作用，后肌球蛋白IIA以TRPM7激酶依賴性方式協(xié)助ANXA1發(fā)生細(xì)胞核易位從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[10]。亦有研究發(fā)現(xiàn)ANXA1可能通過(guò)神經(jīng)元核轉(zhuǎn)位信號(hào)通路與 importin β相互作用，隨后通過(guò)增強(qiáng)p53轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)促凋亡基因bid等介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。ANXA1在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)位機(jī)制尚不清楚，ANXA1與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-18KDa(translocator protein-18 KDa，TSPO)相互作用介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路，從而調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)[12]。基于小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎及抗炎介質(zhì)的特性，本研究選取經(jīng)典的M1型炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1β和M2型炎性介質(zhì)Arg-1、IL-10作為小膠質(zhì)細(xì)胞極化的標(biāo)志。沉默AnxA1后，白藜蘆醇未能降低小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物M1型標(biāo)志物表達(dá)，而M2型標(biāo)志物表達(dá)明顯減少，因此白藜蘆醇抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化及向M2型極化的作用明顯與白藜蘆醇上調(diào)ANXA1相關(guān)。但白藜蘆醇抑制ANXA1蛋白核轉(zhuǎn)位的具體機(jī)制及作用暫不清楚，需后續(xù)深入研究。

綜上所述，白藜蘆醇可上調(diào)ANXA1表達(dá)抑制OGD/R模型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，為白藜蘆醇抑制缺血性卒中后的神經(jīng)炎性反應(yīng)提供了一定的理論基礎(chǔ)。