民族藥菠菜子質量標準提高研究

謝 莉 艾買提江·阿依甫別克 徐 鴻 于新蘭

新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830054

菠菜來源于藜科菠菜屬植物菠菜SpinaciaoleraceaL，為藥食同源類植物，別名為波斯菜、赤根菜，系屬外來中藥資源，一般以其地上部分、果實和根入藥，現(xiàn)全國各地均有栽培[1-2]。菠菜子為菠菜的果實，又稱菠薐菜子，是維吾爾醫(yī)常用藥材，維吾爾語名為 Palek Urughi。主要用于異常膽液質過剩、熱性傷寒、發(fā)燒不退、體弱、便秘、熱性心痛等疾病[3-4]。目前，菠菜子收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》維吾爾藥分冊中[5]，但該標準內容簡單，僅對菠菜子的性狀和顯微進行簡單描述，質量標準偏低，不足以控制本藥材的質量。現(xiàn)有研究報道多為原植物種植方法、組織形態(tài)和藥理作用等方面[6]，目前國內文獻未見有關菠菜子藥材質量標準的研究報道。因此，為促進中藥民族藥產業(yè)化發(fā)展，推動民族藥材標準化提高，故本研究對菠菜子的性狀、TLC 鑒別、水分、總灰分、浸出物及含量測定項目進行研究，以期為菠菜子質量標準的提高和完善提供理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津(LC-20AT)高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(日本島津公司)；JA 12002 型電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)；SK7210LHC 型超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；成像顯微鏡(日本 OLYMPUS 公司)；冷凍切片機( Thermo 公司)；GZX-9140MBE 型鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；DZKW-D-6 型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；KLZ-UP 型艾柯純水儀(臺灣艾柯，成都康寧試驗專用純水設備廠)。

1.2 試藥 乙醇(分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司，批號 20171008)；甲酸(分析純，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司，批號 20170703)；甲醇(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司，批號 2018101012)；硅膠 G 薄層板(青島海洋化工分廠，批號 20170812)；乙腈(Fisher 公司，Lot 18356)；磷酸(天津永晟精細化工有限公司，批號 20160215)β-蛻皮甾酮對照品(批號 H918750)購自于加拿大多倫多 Toronto Research Chemical(TRC) 公司。

菠菜子藥材從市場上收集，共計25批，產地分布于新疆和田、安徽亳州、山東臨沂、甘肅隴西、河北安國等地，藥材基源由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院蘇來曼·哈力克主任藥師進行鑒定為圓葉菠菜的果實，樣品信息見表1。

表1 菠菜子藥材信息表

2 方法與結果

2.1 性狀 菠菜子的外形與中藥蒺藜科蒺藜TribulusterrestrisL.干燥的果實外形相似，常被人混用[7]，目前常被視為蒺藜的偽品之一。故結合藥材實際性狀，本文對菠菜子性狀進行了規(guī)范化的描述。菠菜子呈近或扁圓形，直徑 2～4 mm。表面淺綠色或灰白色，略粗糙，側面有 2～4個縱棱；一端圓形，中部有突起，另一端有稍尖的合點，帶有殘留的果柄或已脫落；果皮堅硬，種皮深棕色、光滑有光澤，種臍部凹陷，具一環(huán)狀縱溝；胚乳類白色，粉性。無臭，味淡。如圖1所示。

圖1 菠菜子性狀

2.2 定性鑒別 菠菜子中含有黃酮類、甾體類等活性成分，其中甾體類活性成分分為植物甾醇類和昆蟲蛻皮激素等，植物甾醇主要含 α-菠菜甾醇、Δ7-豆甾烯醇、β-谷甾醇、蛻皮甾酮、羥基蛻皮激素等[8-10]，本試驗為菠菜子中 β-蛻皮甾酮進行定性鑒別，并對展開劑、顯色劑、展開環(huán)境等色譜條件進行了考察。

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品粉末 3g，加 80% 甲醇 5 mL，超聲處理 20 min，靜置，取上清液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 取β-蛻皮甾酮對照品，加甲醇制成 1 mL含 0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.新疆和田；2.安徽亳州；3.山東臨沂；4. β-蛻皮甾酮；5.甘肅隴西；6.河南南陽；7.河北安國圖2 菠菜子供試品薄層色譜

2.2.3 薄層色譜條件 分別吸取供試品溶液 10 μL，對照品溶液 5 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，選取三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(8∶2∶0.3∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視，如圖2所示。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯示相同顏色的斑點，可用于菠菜子中 β-蛻皮甾酮的鑒別。不同采集地樣品色譜基本一致，說明該方法可靠穩(wěn)定。

2.3 檢查 水分和總灰分測定分別參照《中國藥典》2015 年版四部通則 0832 (第二法)和 2302 進行試驗，檢驗結果見表 2。根據(jù)測定結果可得，樣品水分在 5.76%～10.06% 范圍內，為 (8.37±1.37)%(n=25)；樣品總灰分在 4.27%～5.41% 范圍內，為 (4.65±0.27)%(n=25)，在各批次樣品測定值的基礎上上浮 20%，作為各指標的上限，暫定菠菜子質量標準中水分不得過 11.0%，總灰分不得過 6.0%。

2.4 浸出物 參照《中國藥典》 2015 年版四部中“藥材和飲片檢定通則( 0212 )”項下的浸出物測定法試驗。選取稀乙醇為提取溶劑，采用冷浸法提取菠菜子樣品中的浸出測定結果見表3。

表2 水分、總灰分測定結果 (n=25)

表3 浸出物測定結果

由上表可知，樣品測定值范圍為6.65%～13.25%，實測值 (%) 為 (10.12±2.03)%(n=25)，在各批次樣品測定值的基礎上下浮 20%，作為各指標的下限，暫定菠菜子質量標準中浸出物不得低于 8.0%。

2.5 含量測定[11-14]

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ODS C18 (250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.02% 磷酸溶液(16∶84)，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

2.5.2 對照品儲備液的制備 精密稱取 β-蛻皮甾酮對照品 25.81 mg，置 20 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，定容，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取菠菜子藥材粉末約 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 80% 甲醇 25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率 250 W，頻率 40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用 80% 甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。除加樣品外以同法操作，制得空白溶液。結果如圖 3所示。

圖3 高效液相色譜圖

2.5.4 線性關系 從對照品儲備液中精密量取各溶液0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、2.0 mL和1.0 mL，分別置于 50 mL、50 mL、25 mL、25 mL和10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，依法測定，以溶液濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程：Y=14404×C-28065，r=0.9991。結果表明 β-蛻皮甾酮在 0.1290～1.2905 μg·mL-1(n=2) 范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在制備 0、2、4、6、8、12、14、18、24 和 32 h后，進樣測定，測得 β-蛻皮甾酮含量的平均值為0.12%，RSD 為 0.78%。表明供試品溶液在室溫放置 32 h內基本穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收 取已知含量的樣品 0.5 g共9份，精密稱定，分別加入不同量濃度的對照品儲備液，按供試品方法處理；在250 nm波長下進行含量測定，測得平均加樣回收率為 100.16%，RSD為 1.87%，表明該方法準確可靠。結果見表 4。

表4 加樣回收率試驗結果

2.5.7 重復性 取同一供試品共 6 份，精密稱定，按供試品的處理方法處理，并在 250 nm 波長下進行測定，測得樣品平均質量濃度為 0.120%，RSD 1.50%(n=6)。結果表明，該方法重復性好，測定方法可行。

2.5.8 樣品測定 取收集到的 25 批菠菜子藥材，精密稱定，按照“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件測定供試品中β-蛻皮甾酮的 含量，結果見表5。

表5 菠菜子中β-蛻皮甾酮的含量 (n=2)

根據(jù)25批樣品的測試結果，暫定本品按干燥品計算，含 β-蛻皮甾酮(C27H44O7)，不得少于0.07%。

3 討論

3.1 TLC鑒別 筆者同時對該方法進行系統(tǒng)耐用性實驗，比較不同廠家(青島海洋化工有限公司、煙臺市化學工業(yè)研究所及上海盛亞化工有限公)的 3 種硅膠 G 薄層板進行比較，在不同濕度(25%、30%、40%)、不同溫度(18 ℃、25 ℃、30 ℃)時對實驗結果的影響。結果顯示，供試品和對照品斑點均清晰，沒有本質區(qū)別，說明該方法通用性較好。

3.2 浸出物考察 筆者采用不同濃度的(20%、40%、60%、80%、95%)乙醇溶液，分別用冷浸法和熱浸法對菠菜子的浸出物得率進行考察，結果冷浸法得率較熱浸法高，且冷浸法中 20%～60% 乙醇提取時，浸出物得率差異不明顯。因此，選用稀乙醇為提取溶劑，采用冷浸法測菠菜子中浸出物。

3.3 供試品溶液的考察 分別對不同提取溶劑(70%、80%、90%、100%)甲醇和(70%、80%、90%、100% )乙醇、不同提取時間(20 min、3 min、40 min)、不同提取方式(超聲提取、回流提取)、不同物料比(1∶25、1∶30、1∶40)進行考察，結果表明：在80% 甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，物料比為1∶25時，供試品中 β-蛻皮甾酮的含量最高。

3.4 HPLC測定結果 菠菜子中 β-蛻皮甾酮含量范圍在 0.073%～0.205%，其中產地為山東臨沂、甘肅隴西、安徽亳州、河北安國及河南南陽的5批菠菜子中β-蛻皮甾酮含量顯著高于產地為新疆和田的菠菜子。說明菠菜子中 β-蛻皮甾酮的含量高低可能與菠菜子的種植地有關，受種植環(huán)境的影響，β-蛻皮甾酮的含量會有所差異；也可能是由于這5批菠菜子采收時間較近，存放時間較短，造成含量有所差異。這為菠菜子的種植環(huán)境和存儲的要求提供了參考，具體含量差異原因，后期會進一步深入研究。

4 小結

目前，國內對菠菜的研究僅限于種植方法、原植物組織形態(tài)和藥理作用等方面，對菠菜及其果實中化學成分及其含量分析尚未見報道。筆者參照《中國藥典》2015年版一部牛膝藥材項的TLC鑒別和含量測定方法，建立菠菜子中β-蛻皮甾酮的TLC 鑒別和含量測定的方法，該方法簡便、可靠、重現(xiàn)性好，并根據(jù)25批樣品的測定結果，暫定本品按干燥品計，含β-蛻皮甾酮，不得少于0.07%，用于控制菠菜子藥材的質量。本實驗研究旨在為菠菜子安全用藥和化學成分研究提供理論依據(jù)，為菠菜子藥材標準提高奠定基礎，也為更好的控制維藥的質量和標準的提高提供參考。