副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)N1115菌株定量PCR檢測方法研究

張奕南，王越，張棟，張娜娜，朱宏，劉洋，王世杰

（1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221）

0 引 言

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）在細菌分類學(xué)上的位置屬于厚壁菌門（Firmicutes）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、乳桿菌目（Lactobacillales）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus），與干酪乳桿菌(L.casei)、副干酪乳酸菌（L.paracasei）和鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）在系統(tǒng)發(fā)育和表型上關(guān)系密切，它們一起被認為是干酪乳桿菌群，具有益生特性和食品發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)價值[1]。L.paracasei具有良好的耐酸、耐膽鹽能力，并具有提高腸道上皮細胞屏障的作用。研究發(fā)現(xiàn)L.paracasei的多個菌株具有通過調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，平衡炎癥反應(yīng)，以緩解過敏的功能[2-4]。通過代謝產(chǎn)物如有機酸、細菌素和苯乳酸可有效抑制致病菌和腐敗菌的生長[5-6]。該菌種胞外酶產(chǎn)生抑制血管緊張素（ACE）的小分子肽，并且有些菌株可以高產(chǎn)氨基丁酸（GABA），具有調(diào)節(jié)血壓的臨床效果[7-9]。另外，據(jù)報道L.paracasei菌株及發(fā)酵液還具有抗腫瘤和抗氧化的生理功能[10-11]。L.paracasei的多種生理功能決定了其在不同領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。近年來在食品工業(yè)中的開發(fā)和應(yīng)用研究報道較多，如：生產(chǎn)酸奶干酪等乳制品的優(yōu)良發(fā)酵菌株開發(fā)；具有一定生理功能的經(jīng)過口或黏膜途徑攝入的活菌及其代謝產(chǎn)物的乳酸菌制劑的研制；生產(chǎn)GABA、L-乳酸、苯乳酸發(fā)酵菌種篩選；以及干燥、微膠囊等相關(guān)產(chǎn)品的加工的工藝研究[12-13]。

聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織、世界衛(wèi)生組織定義益生菌（probiotics）為當攝入一定量時能對宿主產(chǎn)生健康益處的微生物活體[14]。L.paracasei就是一種非常具有應(yīng)用前景的益生菌。乳酸菌的益生功能與特定菌株和定植腸道內(nèi)活菌計量密切相關(guān)[15]。另外，從加工的角度來看，這些微生物必須適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，因此在食品的貨架期結(jié)束時，其菌含量應(yīng)達107CFU/g[16]。關(guān)于益生菌在食品中的使用，我國發(fā)布了一系列的法律法規(guī)，2010年衛(wèi)生部發(fā)布可用于食品的菌種名單21種[17]，對嬰幼兒食品中規(guī)定了可用菌株的目錄[18]，并通過《新資源食品管理辦法》（即2013年后《新食品原料安全性審查管理辦法》）進行申報批準，截至2020年10月已申報批準15株。隨著法規(guī)的進一步完善，食品菌種（株），包括發(fā)酵菌種的使用范圍、數(shù)量和安全性要求也將更加明確和規(guī)范[19]。

L.paracasei是近年從干酪乳桿菌中劃分出來的一個新種，其分類學(xué)地位一直存在爭議，2008年，國際細菌分類委員會駁回了Dick等將副干酪乳酸菌歸入干酪乳桿菌屬的分類建議，重新將副干酪乳酸菌及其亞種，從干酪乳桿菌劃分出來[20]。僅基于有限的DNA-DNA同源性比較試驗，如16SrDNA序列同源性分析，完成的分類及進化分析，很難將副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌區(qū)分開，需要與表型特征描述，如糖培養(yǎng)發(fā)酵試驗等，相結(jié)合[21-22]?；谌蚪M差異的分子生物學(xué)分析方法，實現(xiàn)了乳桿菌屬到種水平的鑒別，并可以實現(xiàn)株水平的遺傳多樣性分析及菌株分型[23]。2019年，Stijn Wittouck等通過全基因組分析方法，對NCBI數(shù)據(jù)庫中200多個乳酸桿菌屬基因組數(shù)據(jù)進行種水平分類分析[24]。2020年，Piotr Jarocki等對屬于L.casei，L.paracasei和L.rhamnosus3個種的30多株菌進行了屬及種的特異性多聚酶鏈式反應(yīng)（polymerase chains reaction，PCR）、多重PCR（multiplex-PCR）、實時高分辨溶解曲線分析（Real-Time HRM analysis）、PCR限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism-PCR,RFLP-PCR）、基于REP元件PCR指紋法（Repetitive extragenic palindromic elements-PCR，rep-PCR）、DNA隨機擴增多態(tài)性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、和PCR擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymerphism，AFLP）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）等方法進行研究。研究結(jié)果顯示multiplex-PCR和MALDI-TOF MS可用于種水平鑒別，而AFLP-PCR方法對于株水平鑒別分辨力更強[25]。傳統(tǒng)的多態(tài)性比較分析方法較為隨機，而且其最大的不足是這些標記都與性狀沒有直接的聯(lián)系。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）可在干酪乳桿菌群的持家基因中穩(wěn)定存在，分布密度較高，使得SNP成為理想的基因分型方法[26]。特別是單個堿基的差異可能決定一個基因功能的改變，從而影響所控制的性狀。近年來，隨著益生菌全基因組測序Whole Genome Sequencing（WGS）技術(shù)的發(fā)展，乳酸菌的比較基因組學(xué)研究得到了發(fā)展[27-29]，其中功能相關(guān)基因及SNP位點分析技術(shù)的發(fā)展為L.paracasei種內(nèi)株水平鑒別提供了研究基礎(chǔ)。

本項目研究對象為副干酪乳桿菌N 1115（L.paracasei N 1115，簡稱N 1115），是從內(nèi)蒙古牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的一株功能性菌株。已進行了全測序，并與L.casei ATCC 334和L.rhamnosus GG進行了比較基因組分析[30]。已進行的功能性研究表明，N 1115不僅具有耐酸、耐膽鹽、促進腸道細胞生長等特性，還可以刺激T細胞增殖分化，調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答過程，在提高機體抗感染能力的同時降低超敏反應(yīng)的發(fā)生[31-32]。而實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）技術(shù)，具有定量分析特異性高、靈敏度高、重復(fù)性良好、準確度高、分析通量大等優(yōu)點，相關(guān)設(shè)備普及度較高[33]。故本研究在N 1115比較基因組和基于菌株功能相關(guān)的cSNP位點分析基礎(chǔ)之上，建立了CDS 247開放閱讀框架中株特異性SNP位點探針的RT-qPCR分析方法。并建立了定量檢測飲料、菌粉中的N 1115副干酪乳桿菌方法。該方法的建立為益生菌株水平鑒別提供了應(yīng)用方法借鑒，并為保障相關(guān)新食品原料、新資源食品、以及保健食品的申請、生產(chǎn)及質(zhì)量安全監(jiān)管的順利進行提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本研究試驗菌株包括15株副干酪乳桿菌（包括分離株N 1115和標準菌株），5株干酪乳桿菌、13株其他類乳桿菌、1株嗜熱鏈球菌、3株乳酸乳球菌及16株雙歧桿菌的標準菌株或工業(yè)生產(chǎn)用菌株，菌株編號及標準菌株保藏號詳見表1。表1菌株購買獲贈后均由上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院自行保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

溶菌酶，北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K溶液（10 mg/m L），溶菌酶溶液（20 mg/m L），十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB），Na2EDTA，氯仿，異戊醇，無水乙醇，NaCl，中國醫(yī)藥集團；Tris飽和酚，北京索萊寶科技有限公司；TE buffer（p H 8.0），生工生物工程（上海）股份有限公司；Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0），Premix Ex TaqTM（Probe qPCR），ROX plus寶生物工程（大連）有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302），天根生化科技(北京)有限公司；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；所有分子生物學(xué)用水均為18 MΩ純水。

CTAB裂解液（p H 8.0）：稱取4.00 g CTAB，16.38 g NaCl，2.42 g Tris，1.50 g Na2EDTA，用適量水溶解后，調(diào)節(jié)p H，定容至200 mL，高壓滅菌，存放于4℃?zhèn)溆谩?/p>

CTAB-II裂解液（pH 8.0）：稱取1.00 g CTAB，16.38 g NaCl，2.42 g Tris，1.50 g Na2EDTA，用適量水溶解后，調(diào)節(jié)p H，定容至200 mL，高壓滅菌，存放于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗菌株及編號

（續(xù)表1）

1.2 儀器與設(shè)備

高速臺式離心機（Eppendorf 5417R），德國Eppendorf公司；微量移液器（2μL，10μL，100μL，1 000μL），法國吉爾森公司；微量分光光度計（DeNovix DS-11），美國DeNovix公司；分析天平（Mettle toledo AL204（感量0.0001 g）），梅特勒-托利多（常州）稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)（ANOXOMAT MARK II），荷蘭Mart Microbiology B.V；電熱恒溫培養(yǎng)箱，美國Shellab公司；ESCO LA2-4A1生物安全柜，新加坡藝思高公司；熒光定量PCR儀（ABI 7500），賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SNP分析

下載GenBank數(shù)據(jù)庫中多個副干酪乳桿菌菌株基 因 組，包 括ATCC_334、BD-II、CAUH 35、EG、FAM 18149、HD1.7、HDS-01、IIA、JCM_8130、KL1、L9、LC2W、LC355、LOCK919、Lpc10、TK1501、TMW、Zhang全基因組序列，以N 1115菌株作為參考菌株，通過變異檢測軟件SAMtools進行SNP Calling，并對原始結(jié)果進行過濾，得到SNP位點分析結(jié)果。對差異位點，用R語言轉(zhuǎn)化矩陣,做hclust聚類分析，得到基于SNP位點的聚類分析圖。相關(guān)分析由上海昂樸生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.2 糖代謝相關(guān)序列在線分析

使用在線RAST[34-36]進行N 1115全基因組序列注釋，得到N 1115代謝預(yù)測途徑。通過NCBI在線Blast對假基因進行分析，用http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/進行N 1115染色體組序列的基因島分析[37]。

1.3.3 RT-qPCR引物的設(shè)計與合成

結(jié)合現(xiàn)有N 1115菌株基因組注釋信息，尋找位于開發(fā)閱讀框架中的特異性位點。特異位點前后共約200 bp片段，使用Primer Express 3.0進行引物探針設(shè)計，選擇探針包含特異性位點的探針引物組。通過引物特異性位點個數(shù)及位置，并結(jié)合Tm值、引物末端穩(wěn)定性、GC含量、二級結(jié)構(gòu)等參數(shù)，得到30套理論可行的引物及探針，并優(yōu)選其中的5套引物及探針進行合成。最終經(jīng)過試驗驗證，得到一組引物探針組，位于開放閱讀框架CDS 247，具體序列見表2。引物由上海英俊生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 DNA模板的提取

裂解液提取法過程如下：樣液1 mL，加至2 mL的微量離心管中，12 000 g離心10 min后，加入40μL 20 mg/mL的溶菌酶，37℃孵育30 min后，加入56℃預(yù)熱的700μL CTAB裂解液（或CTABII裂解液）和10μL蛋白酶K，振蕩混勻，置于56℃水浴中處理2 h（或水浴過夜），期間每隔30 min混勻一次；取出冷卻至室溫后按照核酸提取步驟抽提核酸[38]。試劑盒提取DNA模板過程按照試劑盒說明書進行。煮沸法提取DNA過程為：取樣液1 mL加至2 mL的微量離心管中，100℃煮沸5 min后，10 000 g離心10 min后取上清。

表2 N1115擴增引物探針名稱、序列及基因來源

1.5 RT-qPCR方法

1.5.1 反應(yīng)體系

按照Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）說明書，配置反應(yīng)液，包含：Mix反應(yīng)緩沖液7.5μL，上下游引物終濃度為400μmol/L，探針終濃度為400μmol/L，DNA模板1.0μL，去離子水（DW）補充至15μL。

1.5.2 反應(yīng)過程

將混合物置于熒光PCR儀中實時監(jiān)控擴增反應(yīng)，反應(yīng)程序為：第一階段95℃2 min；第二階段95℃5 sec，64℃35 sec 40個循環(huán)；于64℃35 sec處收集熒光信號，熒光通道為FAM/none。

1.6 RT-qPCR檢測方法驗證

1.6.1 擴增引物的特異性及傳代穩(wěn)定性測試

對目標序列進行在線比對分析方法的特異性，并分別提取15株副干酪乳桿菌菌株（種內(nèi)株間）、31株近緣及生產(chǎn)常見乳酸菌（種間）、以及10株其他生產(chǎn)常見益生菌基因組DNA為模板。采用所設(shè)計的引物對上述各種DNA分別進行擴增，確定檢測方法對N 1115菌株的特異性。以無菌水作為陰性對照。N 1115連續(xù)傳代3至8代得到的菌液提取DNA，調(diào)節(jié)模板濃度一致，分析Ct值差異性。沒有顯著差異性，表明特異性序列傳代穩(wěn)定性好。

1.6.2 N 1115染色體DNA RT-qPCR方法的檢出限、精確度及線性檢測

對N 1115提取的染色體DNA溶液進行稀釋，核酸質(zhì)量濃度依次為50、5、0.5、0.05、0.005、0.0005、0.00005 ng/μL，進行RT-qPCR擴增。每個質(zhì)量濃度設(shè)置10個平行，計算Ct值的標準偏差（Standard Deviation，SD）和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。確定方法檢出限、精確度及線性。以無菌水作為陰性對照樣品。

1.6.3 N 1115菌懸液定量檢測方法的確度、線性、及定量檢出限

對N 1115菌懸液的6個濃度梯度進行DNA提取和擴增，每個菌濃度10個平行，計算Ct值的SD和RSD。確定方法的檢出限、精確度及線性。同時參考菌液的常規(guī)菌落計數(shù)結(jié)果，得到方法的準確度。

1.6.4 N 1115菌體定量檢測方法的專屬性驗證

專屬性驗證包括在干擾菌專屬性和基質(zhì)專屬性，具體試驗如下。

（1）干擾菌專屬性驗證。

在高濃度干擾菌兩歧雙歧桿菌存在的情況下，制備N 1115菌的6個濃度梯度按照CTAB裂解方法提取DNA后，以提取液原液為模板進行RT-qPCR擴增，做3個平行?？疾焖ǚ椒ǖ臏蚀_度、線性及檢出限。

（2）基質(zhì)專屬性驗證。

制備N 1115菌液，以企業(yè)提供的3種菌粉溶液為稀釋液進行稀釋。稀釋6個菌濃度梯度，按照CTAB裂解方法提取DNA后。以DNA提取液原液為模板，進行RT-qPCR擴增。以傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法進行菌液的活菌計數(shù)為參考，比較3種菌粉中N 1115菌株計數(shù)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果的差異。

1.7 模擬樣品檢測

利用建立好的RT-qPCR技術(shù)對模擬樣品進行檢測，模擬樣品的制作：N 1115培養(yǎng)至109CFU/m L，以不含N 1115的菌粉和飲料作為基質(zhì)，進行梯度稀釋，最終將稀釋液進行核酸提取，以該核酸為模板擴增。每個濃度進行3個平行。

1.8 數(shù)據(jù)與圖像處理方法

實驗使用的儀器自帶軟件7500 System Software v1.3.2在擴增過程中自動進行分析并得出Ct值。

1.9 N 1115菌粉實際樣品檢測過程

企業(yè)提供N 1115菌粉及其產(chǎn)品不同批次共2份，按建立的RT-qPCR方法對樣品進行檢測。每個樣品4個平行。取標準菌株N 1115菌液109CFU/mL進行10倍系列稀釋5個濃度。檢測樣品根據(jù)標簽明示值，稱取0.1g（A）樣品至10 mL（B）的無菌稀釋液，并用無菌稀釋液進行10倍稀釋，使菌粉樣本濃度在105～109CFU/mL之間，記錄稀釋倍數(shù)（C）。標準菌懸液和樣品溶液在同樣的條件下使用CTAB-II法提取核酸。以標準菌濃度對數(shù)值（lg Co）為x軸，Ct值為y軸作圖，得到標準線性擬合曲線及公式。樣品Ct平均值，帶入線性擬合公式得到菌濃度對數(shù)值x。樣品中菌濃度按照以下公式計算：

式中：M為樣品中菌量（CFU/g）；A為檢測樣品稱取質(zhì)量（g）；B為稀釋液體積（mL）；C為樣品菌液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組特異性序列分析

2.1.1 L.paracasei菌株SNPs位點及聚類分析

比較公共資源可獲得的20株L.paracasei基因組序列，得到9219個N 1115特異性SNPs位點。SNP位點聚類分析結(jié)果顯示，分析的20株菌L.paracasei由聚類成3簇，包括菌株L9、IIA、LC355、TMW、ATCC334、EG、X 8700.2、HD1.7、HDS.01、LOCK919、Lpc10、Zhang和TK1501（第1簇）；菌株FAM 18149、CAUH 35、JCM 8130、KL1、LC2W、BD.II（第2簇）；菌株N 1115（第3簇），如圖1。SNPs聚類分析顯示N 1115與其他株相似度較低。據(jù)報道，SNP分析在一定程度上可以表現(xiàn)L.paracasei種內(nèi)的進化過程，但由于這種突變有可能是種間重組造成的，也可能造成進化上分析的誤差，所以并不能完全反映菌株的進化關(guān)系。

圖1 公共資源獲得的20株L.paracasei中SNP位點預(yù)測及聚類分析

2.1.2 代謝功能性相關(guān)基因及SNP位點選擇

經(jīng)過對N 1115全基因組注釋，對N 1115株代謝途徑進行了預(yù)測如圖2。注釋基因占全基因組23%。其中糖代謝、蛋白代謝以及氨基酸及其同系物代謝分別對應(yīng)功能基因個數(shù)163、131和131，分別占注釋基因總數(shù)（935）的17.43%、14.01%和14.01%。乳酸菌可利用的碳源種類與環(huán)境或在腸道中的生態(tài)位適應(yīng)密切相關(guān)[27]。生態(tài)位碳源代謝能力對于乳酸菌益生功能的發(fā)揮及相關(guān)生產(chǎn)能力的開發(fā)非常關(guān)鍵。相關(guān)的研究報道指出，基因水平轉(zhuǎn)移事件在細菌基因組引入多種功能，從而增強細菌在自然環(huán)境中的競爭力。編碼糖轉(zhuǎn)運蛋白和碳水化合物水解的基因是水平轉(zhuǎn)移獲得的大部分菌株水平特異性基因的代表[39]。另外，昱宿主作用相關(guān)的胞外定位蛋白也與生態(tài)位適應(yīng)性有關(guān)[28]，但沒有相關(guān)研究顯示其對應(yīng)基因差異具有菌株水平的特異性。

關(guān)于L.paracasei泛基因組相關(guān)研究指出，糖盒在L.paracasei基因組中的分布及其多變，特別是在糖島A和B中，泛基因組顯示共有74個糖盒，但各個菌株含有糖利用盒的數(shù)量差異很大。只有15個糖盒屬于核心基因組，且位于糖島A和B之外。L.paracasei的進化復(fù)雜，并不總是與生態(tài)位適應(yīng)有關(guān)，預(yù)測可以利用的糖源為果糖、蔗糖、肌醇、葡萄糖酸鹽、氨基半乳糖、山梨醇、纖維二糖、核糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖、木糖、半乳糖苷、β-葡萄糖苷、α-葡萄糖苷、葡萄糖苷、透明質(zhì)酸鹽、半乳糖醇、抗壞血酸和某些未知糖源[29]。除了乳酸菌常規(guī)的乳糖和半乳糖途徑、糖原代謝途徑、以及甘露糖、D-核糖、脫氧核糖等單糖代謝途徑外，N 1115還預(yù)測出較為獨特的糖代謝途徑，包括幾丁質(zhì)（Chitin）/N-乙酰葡萄糖氨（NAG）代謝途徑、D-葡萄糖酸和酮葡萄糖酸鹽單糖代謝途徑。

圖2 N1115代謝途徑預(yù)測

N 1115株預(yù)測得到的Chitin/NAG代謝途徑，含有5個代謝相關(guān)基因，包括2個NAG核心基因nag A和nag B。預(yù)測結(jié)果顯示，該途徑?jīng)]有NAG激酶，也沒有NAG磷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）。推測可能與唾液酸的利用有關(guān)，即該途徑與NAG-P的NAG利用途徑進行了合并。而經(jīng)過進一步比對，CDS 247與N-乙酰氨基葡萄糖的PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的subunit IIB序列十分相似，但僅有417 nt堿基，翻譯產(chǎn)物為139 aa，而典型的具有糖轉(zhuǎn)運活性的nag E基因約為1,947 nt，產(chǎn)物包括ABC三個亞單位，大小約為648 aa。分析該CDS 247可能為序列上被刪減的沒有功能的假基因。細菌基因組中的假基因是在不斷發(fā)生的突變過程中不斷產(chǎn)生的，并且會隨著突變的進一步積累而退化，最終被去除。與真核生物進化尺度上的假基因保守性截然不同，細菌假基因的保留時間似乎非常短，即使與非常接近的細菌相比，屬于同一種細菌的菌株之間也很少有相同的假基因[40]。本次實驗，僅進行了序列比對，并未進行進一步的功能性研究。但CDS 247在多株L.paracasei中都有發(fā)現(xiàn)，說明該基因?qū)τ贚.paracasei來說遺傳較為穩(wěn)定，位于該基因的SNP位點，適合用于種內(nèi)菌株鑒別。經(jīng)分析該基因并不位于基因島（Genomic island），說明該序列水平轉(zhuǎn)移獲得可能性較低，遺傳上也更為穩(wěn)定。

2.2 引物特異性及傳代穩(wěn)定性驗證

2.2.1 引物特異性驗證及傳代穩(wěn)定性

使用設(shè)計的引物對15株L.paracasei種內(nèi)株進行擴增（圖3）。擴增結(jié)果顯示，除N 1115外的其他株擴增均為陰性，N 1115株擴增為陽性，對應(yīng)兩平行樣品Ct值分別為19.0297和20.2145。41株其他種乳桿菌和食品及保健品常見益生菌擴增結(jié)果均為陰性，空白對照均未發(fā)生擴增。這表明本項目所設(shè)計引物對N 1115菌株檢測具有很好的特異性（表3）。

圖3 N1115DNA擴增引物特異性

N 1115菌株傳代3到8次，特異性檢測Ct值相對標準偏差為2.89%，方法對于傳代多次的檢測精確度高，特異性擴增的傳代穩(wěn)定性好，可用于有限代數(shù)菌株的檢測（表4）。

2.3 N 1115菌液定量檢測方法的檢出限、線性檢測及精確度

用9.9×108CFU/mL菌液提取的DNA溶液用無菌水進行10倍系列梯度稀釋，稀釋至對應(yīng)菌濃度為99 CFU/mL。每個濃度3個平行。擴增結(jié)果顯示對應(yīng)菌濃度990 CFU/mL及以上時，RT-qPCR為擴增陽性。以菌濃度對數(shù)值（Log[菌濃度]）為x軸，Ct值為y軸作圖，做線性擬合得到公式y(tǒng)=-3.6487x+46.716，R2=0.9993，線性擬合度好。這種情況下，定量檢出限可達到990 CFU/mL，見圖4。

表3 特異性檢測結(jié)果

表4 特異性擴增的傳代穩(wěn)定性驗證

同時，用無菌生理鹽水對厭氧培養(yǎng)得到的菌液做10倍系列稀釋，得到6個濃度梯度的菌液。取菌液1 mL，采用CTAB法進行DNA提取。提取后DNA為模板進行RT-qPCR擴增。每個菌濃度10個平行，同時對菌液進行培養(yǎng)計數(shù)。擴增結(jié)果顯示，菌濃度大于等于9.9×103CFU/mL時，每個菌濃度的10個檢測結(jié)果均為陽性。Ct值的SD介于0.29～0.66之間，RSD介于1.03%～3.02%之間，均在可接受范圍內(nèi)。證明建立的RT-qPCR方法的DNA濃度定量精確度較好。以菌濃度對數(shù)值（Log[菌濃度]）為x軸，Ct值為y軸作圖，做線性擬合得到公式y(tǒng)=-3.9332x+51.006，R2=0.9984，線性擬合度好。定量檢出限可達到9.9×103CFU/m L，見圖4。

在B.bifidum為4.8×107CFU/mL時，N 1115菌株的10倍系列稀釋液采用CTAB裂解液提取DNA后，進行擴增。每個梯度3個平行。各濃度Ct值的SD介于0.33～0.57之間，RSD介于1.06%～3.05%之間，與未加干擾菌的情況相似。擴增結(jié)果顯示：對應(yīng)菌濃度2.9×104CFU/mL及以上時，RT-qPCR擴增為陽性。以菌濃度對數(shù)值（Log[菌濃度]）為x軸，Ct值為y軸作圖，做線性擬合得到公式y(tǒng)=-4.0903x+52.961，R2=0.983，線性擬合度好。這種情況下，定量檢出限可達到2.9×104CFU/mL，見圖4。

圖4 N 1115菌液梯度稀釋檢測結(jié)果及線性擬合

通過比較梯度濃度N 115菌株DNA，梯度濃度N 1115菌液提取DNA和添加高濃度（至107CFU/mL）干擾菌的梯度濃度N 1115菌液提取的DNA，分別為模板擴增得到的線性擬合曲線可以看出，3組曲線線性擬合度較好（R2＞0.98）。菌液的擬合曲線位于DNA直接為模板的擬合曲線之上，說明菌液DNA的提取效率不能達到100%，而且菌液的擬合曲線的斜率絕對值相較于DNA直接為模板的擬合曲線也有增加，這說明隨著菌濃度的減少，DNA提取效率呈逐漸降低的趨勢。提示qPCR方法并不能實現(xiàn)樣品中N 1115菌的絕對定量，需要對照已知菌濃度的標準品進行換算。

2.3.1 針對菌粉基質(zhì)的提取方法優(yōu)化

提取方法的穩(wěn)定性對于菌的定量檢測的準確度也非常重要，故通過考察提取DNA質(zhì)量和濃度相對偏差對DNA提取方法進行了選擇優(yōu)化。選擇較低濃度菌液（約105CFU/mL）用4種方法提取DNA優(yōu)化結(jié)果顯示，使用CTAB-II裂解液的方法菌粉DNA產(chǎn)物質(zhì)量好（A260/A280約為2）、準確度在4種方法中最好（4次提取得到的DNA濃度RSD最低），試劑盒在菌濃度為105CFU/mL時提取回收率較低，數(shù)據(jù)未列出，見表5。

以菌濃度對數(shù)值（Log[菌濃度]）為x軸，分別以CTAB-II裂解液方法提取的DNA和試劑盒提取DNA為模板進行擴增的Ct值為y軸作圖，線性擬合分別得到公式y(tǒng)=-3.68x+48.478，R2=0.9994和y=-3.9588x+45.899，R2=0.9872，線性擬合度較好，但曲線斜率為-3.9588，絕對值超了出RT-qPCR理論斜率值。一般來說，試劑盒提取DNA純度較高，不易產(chǎn)生反應(yīng)體系抑制現(xiàn)象。故有可能隨著菌濃度的降低，試劑盒提取得率降低，導(dǎo)致DNA濃度偏低，反映到擴增效果上為斜率與理論值不符。故在菌濃度＞104CFU/mL時，CTAB-II和試劑盒法兩種提取方法得到的模板DNA，定量分析結(jié)果準確。菌濃度＜104CFU/mL時，改良CTAB法提取得到的模板DNA準確度更高。

2.3.2 模擬樣本檢測

使用CTAB-II裂解法提取模擬菌粉DNA，并進行RT-qPCR擴增結(jié)果（圖5）顯示：對應(yīng)菌濃度2.0×104CFU/mL及以上時，RT-qPCR擴增為陽性。以菌濃度對數(shù)值（Log[菌濃度]）為x軸，Ct值為y軸作圖，各菌粉基質(zhì)中梯度加入N 1115菌株線性擬合得到公式為：L45植物乳桿菌菌粉基質(zhì)中y=-3.505x+48.107，R2=0.9981；植物乳桿菌菌粉基質(zhì)中y=-2.9183x+42.496，R2=0.9838；嗜酸乳桿菌菌粉基質(zhì)中y=-3.4358x+46.185，R2=0.9994；3種菌粉線性擬合度好，定量檢出都可達到2.0×104CFU/mL，且擴增效率較穩(wěn)定。

表5 DNA提取方法比較

圖5 CTAB-II裂解法提取各種菌粉中DNA的N1115特異基因擴增Ct值及線性擬合

2.3.3 N 1115菌粉實際樣本檢測結(jié)果

標準曲線擬合方程為：y=-3.68x+48.478，R2=0.9994。菌粉1稱取0.1 g至10 mL，稀釋100倍后，檢測4平行Ct值分別為23.25，23.91，23.40，23.02平均為23.40，帶入標準曲線擬合方程得到x=6.81，故菌粉1中N 1115菌量M=106.81CFU/m L×10 m L/0.1 g×100=6.46×1010CFU/g；菌粉2稱取0.1 g至10 mL稀釋10倍后，檢測4平行Ct值分別為21.72，22.72，22.30，22.20平均為22.24，帶入標準曲線擬合方程得到x=7.13，故菌粉2中N 1115菌量M=107.13CFU/mL×10 mL/0.1 g×10=1.35×1010CFU/g。計算結(jié)果與產(chǎn)品明示值相符，建立的方法對含有大量低聚糖及輔料的菌粉樣品適用。

3 結(jié) 論

每種益生菌的獨特的益生功能與一定數(shù)量的特定菌株密切相關(guān)。方便快速的益生菌株水平特異性鑒別和定量檢測方法對于益生功能評價，新食品原料的申請，新資源食品研制和申報，以及后續(xù)產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制不可或缺。針對株功能性的位點的特異性PCR目前仍是方法開發(fā)的首選方法。SNPs位點的分析可以在一定程度上體現(xiàn)株間的進化關(guān)系，是尋找株水平特異性的一個切入點。結(jié)合對菌株的特殊功能的不同需求，通過生物信息學(xué)手段，對功能性基因、水平轉(zhuǎn)移基因、假基因等多種進化來源中SNPs位點進性篩選，結(jié)合目的菌株益生功能、生境、進化特點，找到較為穩(wěn)定的突變位點，可以有效地簡化益生菌株水平的特異性位點分析過程，從而建立較為可靠的菌株檢測方法。本研究針對糖代謝功能基因上的SNPs位點分析，建立RT-qPCR檢測方法，實現(xiàn)了菌粉中N 1115株水平的定量檢測，方法特異性、精確度和穩(wěn)定性較好。隨著對益生功能基因水平研究的不斷深入，與菌株獨特表型相關(guān)的功能基因、轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控等多特異性位點的分析和篩選，將有助于菌株功能、活性、定植能力等多角度的量化評價方法的開發(fā)，進一步促進益生菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。