陸漢凌，任旻，唐玉寶，朱云祥

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225000)

0 引言

胃癌是全球常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在中國(guó)，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別在第三位和第二位[1]?，F(xiàn)階段的胃癌診斷方法中，主要依靠CT、胃鏡檢查及腫瘤標(biāo)志物等[2-4]。但胃鏡檢查屬于侵入性檢查，費(fèi)用相對(duì)較高，普通患者接受度不高，因此對(duì)于尋找有效胃癌基因標(biāo)志物成為新的熱門選擇。本文從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選胃癌相關(guān)基因芯片并分析其生物學(xué)功能及信號(hào)通路，同時(shí)篩選了胃癌相關(guān)核心差異表達(dá)基因，并探討了胃癌相關(guān)核心差異表達(dá)基因與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 GC相關(guān)數(shù)據(jù)的獲取

登錄GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，以“gastric cancer”為檢索詞，獲取到與GC相關(guān)的兩組數(shù)據(jù)集：GSE33651、GSE54129。GSE33651共有樣本數(shù)52個(gè)，其中GC組織組40個(gè)，正常黏膜組12個(gè)。GSE54129共有樣本數(shù)132個(gè)，其中GC組織組111個(gè)，正常黏膜組21個(gè)。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

利用在線平臺(tái)GEO2R分別對(duì)兩組芯片的胃癌組織組和正常黏膜組差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，以LogFC＞1或者LogFC＜-1且校正后P值(adj.Pvalue)＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)兩組數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。篩選得到的數(shù)據(jù)利用DrawVenn Diagram (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，繪制出兩組芯片差異表達(dá)基因的韋恩圖，得到共有的差異表達(dá)基因。

1.3 GC相關(guān)差異基因信號(hào)通路及生物學(xué)功能分析

登錄基因功能數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)，將差異基因?qū)?，?duì)其進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)分析，通過(guò)GO分析了解到差異基因的細(xì)胞組成(CC)、生物學(xué)過(guò)程(BP)及分子功能(MF)。接著進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，得到相關(guān)作用的信號(hào)通路。

1.4 GC相關(guān)核心基因的獲取

將上述篩選出的差異基因利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)進(jìn)行分析，得出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，以R-軟件對(duì)PPI進(jìn)行核心基因篩選，以節(jié)點(diǎn)聯(lián)系進(jìn)行排序，篩選出12個(gè)核心基因(FN1、CXCL8、CD44、COL1A1、MMP2、COL1A2、ITGB2、PECAM1、THBS1、ACTB、CXCR4、ITGAM)，對(duì)核心基因進(jìn)一步分析其表達(dá)及生存預(yù)期。

2 結(jié)果

2.1 GC相關(guān)差異表達(dá)基因結(jié)果

兩組GC相關(guān)芯片，以LogFC＞1或者LogFC＜-1且校正后P值(adj.Pvalue)＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)。GSE33651共有樣本數(shù)52個(gè)，其中GC組織組40個(gè)，正常黏膜組12個(gè)，共篩選出差異表達(dá)基因1821個(gè)。GSE54129共有樣本數(shù)132個(gè)，其中GC組織組111個(gè)，正常黏膜組21個(gè)，共篩選出差異表達(dá)基因2092個(gè)。將兩個(gè)芯片組基因用DrawVenn Diagram取交集得到韋恩圖，得到差異共表達(dá)基因330個(gè)，其中下調(diào)基因有123個(gè)，上調(diào)基因207個(gè)。具體可見(jiàn)圖1。

圖1 兩組芯片數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因韋恩圖

2.2 GC相關(guān)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能及信號(hào)通路

在GO分析中可以發(fā)現(xiàn)(表1)，330個(gè)差異共表達(dá)基因的分子功能(MF)主要集中在膠原結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、整聯(lián)蛋白結(jié)合、纖連蛋白結(jié)合等過(guò)程中。細(xì)胞組成(CC)主要參與在細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外基質(zhì)、胞外區(qū)域、細(xì)胞表面等。同時(shí)，在生物學(xué)過(guò)程(BP)中主要在膠原分解代謝過(guò)程、血管生成、細(xì)胞粘附、白細(xì)胞遷移等發(fā)揮著作用。KEGG分析中(表2)，差異表達(dá)基因主要集中于百日咳、阿米巴病、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移及ECM-受體相互作用等通路。

表1 GC相關(guān)差異表達(dá)基因GO分析

表2 GC相關(guān)差異表達(dá)基因KEGG分析

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(protein-protein interaction network，PPI)及核心基因獲取

登錄STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)，將差異表達(dá)基因?qū)霐?shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建出PPI，得到下圖2。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，以R-軟件對(duì)PPI進(jìn)行核心基因篩選，篩選后以節(jié)點(diǎn)聯(lián)系排序，得到下圖3。

圖2 GC差異表達(dá)基因PPI圖

圖3 GC相關(guān)核心基因

2.4 核心差異基因的表達(dá)水平分析及生存分析情況

登錄在線分析網(wǎng)站GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)，比較所獲取的12個(gè)核心差異表達(dá)基因在胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)病人與正常人組織的表達(dá)水平情況(見(jiàn)圖4)。我們發(fā)現(xiàn)，除了PECAM1外，其余基因在STAD病人中均表達(dá)上調(diào)。在生存分析圖5中，可以找到基因FN1、THBS1、CXCR4、COL1A1是有益于胃癌患者的生存。

圖4 GC核心差異表達(dá)基因的表達(dá)分析

圖5 核心差異表達(dá)基因生存分析圖

3 討論

在2018年全國(guó)最新癌癥報(bào)告中指出，胃癌在我國(guó)的發(fā)病率為第二位[5]，它的發(fā)生發(fā)展與多種因素可能相關(guān)，例如性別、年齡、種族、生活飲食方式等[6]。為了更好、更方便地去了解胃癌相關(guān)發(fā)病機(jī)制，從而達(dá)到理想的診斷和治療效果，我們可以從基因芯片方面去入手。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，得到兩組基因芯片GSE33651、GSE54129，通過(guò)韋恩圖篩選出差異共表達(dá)基因330個(gè)，其中上調(diào)基因有207個(gè)，下調(diào)基因123個(gè)。結(jié)合GO及KEGG分析我們發(fā)現(xiàn)，這些差異共表達(dá)基因主要集中在膠原結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、整聯(lián)蛋白結(jié)合、纖連蛋白結(jié)合等過(guò)程中。主要參與在細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外基質(zhì)、胞外區(qū)域、細(xì)胞表面等。同時(shí)，在膠原分解代謝過(guò)程、血管生成、細(xì)胞粘附、白細(xì)胞遷移等發(fā)揮著作用。KEGG分析中，差異表達(dá)基因主要集中于百日咳、阿米巴病、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移及ECM-受體相互作用等通路。

為了進(jìn)一步篩選合適基因，我們利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建出PPI，并由R軟件利用節(jié)點(diǎn)聯(lián)系得出12個(gè)核心基因。為評(píng)估這些核心基因的表達(dá)情況及預(yù)后分析，我們利用GEPIA，比較所獲取的30個(gè)核心差異表達(dá)基因在胃腺癌病人與正常人組織的表達(dá)水平情況。根據(jù)所得圖表發(fā)現(xiàn)除了PECAM1外，其余基因在STAD病人中均表達(dá)上調(diào)。結(jié)合生存分析圖，可以找到基因FN1、CXCR4、COL1A1的低表達(dá)是有益于胃癌患者的生存。

纖維連接蛋白(FN1)是一種糖蛋白分子，它參與各種細(xì)胞的細(xì)胞粘附，遷移和運(yùn)動(dòng)[7]。先前有研究表明其與卵巢癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8,9]。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中，F(xiàn)N1可能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A相互作用，以此起到重要作用，且其相應(yīng)的蛋白質(zhì)可作為NSCLC患者診斷或治療的靶點(diǎn)[10]。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分析驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)FN1的低表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲有抑制作用[11,12]。趨化因子受體4(CXCR4)是CXCL12的主要受體[13]。相對(duì)于正常人而言，胃癌患者體內(nèi)的CXCR4和CXCL12呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[14]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CXCL12與CXCR4的結(jié)合上調(diào)了磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/雷帕霉素(mTOR)和c-MET途徑，從而使胃癌的侵襲性增加[15,16]。此外，CXCR4在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌中，也有報(bào)道說(shuō)明其高表達(dá)[17,18]。膠原蛋白是ECM的重要組成部分，能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附性[19,20]。I型膠原蛋白α1(COL1A1)是膠原蛋白家族的成員之一，有報(bào)道說(shuō)，在乳腺癌、肺癌、腎癌中，COL1A1與腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲性有關(guān)[21-23]。在肝細(xì)胞癌變和轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)里，COL1A1也被當(dāng)做可靠的生物標(biāo)志物[24]。在胃癌中，尚未有明確的實(shí)驗(yàn)證明COL1A1的作用和分子調(diào)控機(jī)制。但最新的一項(xiàng)研究猜測(cè)，COL1A1通過(guò)激活TGF-β信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)了GC細(xì)胞的遷移和侵襲[25]。

綜上所述，我們通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選分析，確定核心差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了FN1、CXCR4、COL1A1這三個(gè)基因，通過(guò)富集分析和蛋白互作、生存分析發(fā)現(xiàn)，這些基因可能作為胃癌的潛在標(biāo)志物來(lái)幫助胃癌的早期診斷、治療及預(yù)后判斷。在基因診斷技術(shù)愈發(fā)成熟的現(xiàn)在，更加簡(jiǎn)便、快捷、有效的方法一定可以得到進(jìn)一步的發(fā)掘。