馮穎博 葉 倩 羅雄燕

(1 四川省巴中市中心醫(yī)院腎臟內(nèi)科，巴中市 636000，電子郵箱：liwanyu9862@163.com；2 四川省巴中市中醫(yī)院消化內(nèi)科，巴中市 636000；3 四川大學(xué)華西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，成都市 610041)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)可累及腎臟，常可引發(fā)狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)，即免疫復(fù)合性腎炎，而LN又可增加SLE患者病死率[1]。SLE的主要特征為自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物形成，研究顯示B淋巴細(xì)胞異常增殖及分化可促進(jìn)SLE的發(fā)生及發(fā)展，而SLE病情的快速進(jìn)展常可導(dǎo)致腎臟損傷進(jìn)而引發(fā)LN[2]。目前，臨床上采用的抗雙鏈DNA(double-stranded DNA,ds-DNA)抗體、免疫復(fù)合物及補(bǔ)體等生物標(biāo)志物輔助診斷LN，但其靈敏度及特異度較低，且不能有效預(yù)測(cè)LN患者疾病的活動(dòng)性，因此尋找新型生物學(xué)標(biāo)志物用于評(píng)估LN患者的疾病進(jìn)展，對(duì)臨床診斷及治療具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛分布于腫瘤組織、外周血單核細(xì)胞及血清中，是一類具有潛在應(yīng)用價(jià)值的標(biāo)志物，研究證實(shí)SLE患者外周血單核細(xì)胞中部分miRNA表達(dá)水平異常[3]。相關(guān)研究表明，miRNA-155參與機(jī)體固有及獲得性免疫反應(yīng)，可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的分化并調(diào)控其功能，進(jìn)而參與免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展[4]；而miRNA-146a異常表達(dá)與局部或系統(tǒng)性炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，調(diào)控miRNA-146a表達(dá)可有效治療多種炎癥性疾病[5]。因此，本研究分析LN患者血清miRNA-146a、miRNA-155表達(dá)水平及其與LN疾病活動(dòng)性的相關(guān)性，評(píng)估兩者預(yù)測(cè)LN病情活動(dòng)的效能。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月至2018年6月巴中市中心醫(yī)院收治的122例LN患者為研究對(duì)象，所有患者均符合系統(tǒng)性紅斑狼瘡國(guó)際合作組制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。根據(jù)SLE疾病活動(dòng)度指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)[7]將LN患者分為L(zhǎng)N活動(dòng)組(SLEDAI評(píng)分≥10分，65例)與LN穩(wěn)定組(SLEDAI評(píng)分<10分，57例)。另選同期于本院體檢的48例健康志愿者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)。(1)所有LN患者均經(jīng)腎穿刺病理檢查確診；(2)未患有其他免疫性疾??；(3)對(duì)本研究知情且簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)性或其他繼發(fā)性腎臟疾病患者；(2)合并惡性腫瘤或嚴(yán)重心血管疾病患者；(3)近期患有感染病患者；(4)近期或既往接受糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒類藥物治療患者；(5)精神疾病患者。LN活動(dòng)組女性54例，男性11例，年齡30～45(37.69±6.28)歲；LN穩(wěn)定組女性41例，男性16例，年齡30～47(38.47±6.41)歲；對(duì)照組男性12例，女性36例，年齡32～50(39.12±6.52)歲。3組研究對(duì)象性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。具有可比性。本研究已通過(guò)巴中市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑及儀器：TRIzol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司(批號(hào)：15596026、K1622)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司(批號(hào)：4367659)；抗ds-DNA抗體酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)：ml025867)。ABI 7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；引物由上海生工有限公司合成；SYSMEX XE-2100全自動(dòng)血液分析儀購(gòu)自希森美康醫(yī)用電子有限公司；HITACHI 7600-210自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自杭州瑞析科技有限公司；Access 2全自動(dòng)免疫分析儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2.2 血清miRNA-146a、miRNA-155表達(dá)水平的檢測(cè)：采集研究對(duì)象空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，吸取上清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用TRIzol法提取樣本總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，采用Agilent 2100生物分析儀鑒定總RNA質(zhì)量；將1.5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miRNA-146a、miRNA-155相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green qPCR Mix(2×)10 μL、cDNA 2 μL、正反向引物各1 μL、ddH2O 6 μL，以U6為內(nèi)參，miRNA-146a、miRNA-155及U6的引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為95℃ 15 min、95℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集熒光，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算miRNA-146a、miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè)：按照1.2.2方法采集血標(biāo)本，應(yīng)用SYSMEX XE-2100全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)；采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐；采用免疫比濁法檢測(cè)補(bǔ)體C3、C4，儀器為IMMAGE 800型全自動(dòng)特定蛋白分析儀(美國(guó)貝克曼公司)，并采用配套試劑盒檢測(cè)(批號(hào)：1709-2)；采用免疫印跡法檢測(cè)抗ds-DNA抗體滴度，儀器為全自動(dòng)免疫分析儀；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)抗C1q抗體含量，儀器為MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷柏公司)，并采用配套試劑盒檢測(cè)(批號(hào)：17031)。計(jì)算估測(cè)腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)，eGFR=186×血清肌酐-1.154×年齡-0.203×0.742(女性)。收集LN患者24 h尿液，記錄體積并分別留取10 mL用于24 h尿蛋白含量檢測(cè)。

1.2.4 相關(guān)評(píng)分：采用Austin評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估LN患者腎組織活動(dòng)性指數(shù)和慢性指數(shù)、腎小管間質(zhì)病變?cè)u(píng)分[8]。SLEDAI共21項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)SLE患者過(guò)去10 d內(nèi)癲癇發(fā)作、精神癥狀、視覺(jué)受損等疾病活動(dòng)狀況進(jìn)行評(píng)估，總分99分，<4分為基本無(wú)活動(dòng)，5～9分為輕度活動(dòng)，10～14為中度活動(dòng)，≥15分為重度活動(dòng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析血清miRNA-146a、miRNA-155水平對(duì)LN患者疾病活動(dòng)程度的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較 3組血清肌酐、ESR、C3、C4及eGFR水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中對(duì)照組、LN穩(wěn)定組、LN活動(dòng)組血清肌酐、ESR水平依次升高，C3、C4水平依次降低；其他兩組eGFR水平均低于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組一般資料及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

2.2 3組血清miRNA-146a、miRNA-155相對(duì)表達(dá)水平的比較 對(duì)照組、LN穩(wěn)定組、LN活動(dòng)組血清miRNA-146a、miRNA-155相對(duì)表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 3組血清miRNA-146a和miRNA-155相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.3 LN活動(dòng)組與穩(wěn)定組患者疾病活動(dòng)性指標(biāo)的比較 LN活動(dòng)組患者抗ds-DNA抗體、抗C1q抗體水平及SLEDAI、慢性指數(shù)、活動(dòng)性指數(shù)、腎小管間質(zhì)病變?cè)u(píng)分均高于LN穩(wěn)定組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 LN活動(dòng)組與穩(wěn)定組患者疾病活動(dòng)性指標(biāo)的比較(x±s)

2.4 LN患者血清miRNA-146a和miRNA-155表達(dá)水平與疾病活動(dòng)性指標(biāo)的相關(guān)性 LN患者血清miRNA-146a、miRNA-155相對(duì)表達(dá)水平均與ESR、抗ds-DNA抗體、抗C1q抗體水平、SLEDAI呈負(fù)相關(guān)，而均與C3水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 LN患者血清miRNA-146a和miRNA-155表達(dá)水平與疾病活動(dòng)性指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 血清miRNA-146a和miRNA-155表達(dá)水平對(duì)LN病情活動(dòng)的預(yù)測(cè)價(jià)值 miRNA-146a截?cái)嘀禐?.57時(shí)，預(yù)測(cè)LN患者病情活動(dòng)的敏感度為83.08%、特異度為91.23%；miRNA-155截?cái)嘀禐?.42時(shí)，預(yù)測(cè)LN病情活動(dòng)的敏感度為84.62%、特異度為89.47%。見(jiàn)圖1、表6。

圖1 血清miRNA-146a和miRNA-155預(yù)測(cè)LN患者病情活動(dòng)的ROC曲線

表6 血清miRNA-146a、miRNA-155表達(dá)水平預(yù)測(cè)LN患者病情活動(dòng)的效能

3 討 論

LN具有易復(fù)發(fā)、病情遷延、并發(fā)癥多、患者預(yù)后差等特點(diǎn)，隨著病情進(jìn)展最終可發(fā)展為終末期腎病，而病情活動(dòng)程度是影響疾病進(jìn)展及預(yù)后的主要因素之一[9]。目前臨床上主要依靠腎活檢評(píng)估LN病理?yè)p傷程度，但有創(chuàng)性和不可重復(fù)性等特點(diǎn)使腎活檢的應(yīng)用受限；而抗ds-DNA抗體、補(bǔ)體C3等臨床指標(biāo)判斷LN病情程度均存在一定局限性[10]。有研究表明，LN的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程涉及T淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞介素18等多種炎性細(xì)胞或細(xì)胞因子[11]。尋找既可反映LN臨床活動(dòng)性又可反映LN病理活動(dòng)性的血清學(xué)指標(biāo)，對(duì)于評(píng)估LN病情活動(dòng)程度具有重要意義。

研究表明，miRNA-146a在心肌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞中呈高表達(dá)，miRNA-146a過(guò)表達(dá)后又可抑制核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信號(hào)通路及相關(guān)炎性因子的產(chǎn)生[12]。Mann等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脂多糖刺激后單核細(xì)胞中miRNA-146a表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)而抑制炎癥介質(zhì)的釋放；而炎癥因子又可通過(guò)Toll樣受體信號(hào)通路促使miRNA-146a表達(dá)水平上調(diào)，以抑制下游基因表達(dá)，從而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。還有研究顯示，SLE患者血清miRNA-146a表達(dá)水平低于正常健康受試者，而強(qiáng)直性脊柱炎患者血清miRNA-146a表達(dá)水平也顯著升高[14-15]。miRNA-155在多種免疫細(xì)胞中均呈高表達(dá)，研究顯示變應(yīng)性鼻炎患者血清miRNA-155表達(dá)水平升高，其可能參與疾病發(fā)生過(guò)程[16]。miRNA-155還可抑制Toll樣受體信號(hào)通路中NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)向調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)表達(dá)[17]。也有研究顯示，SLE患者血清miRNA-155表達(dá)水平顯著降低，并可作為臨床診斷SLE的重要標(biāo)志物[18]。以上研究均表明miRNA-146a和miRNA-155與炎癥反應(yīng)性疾病均有關(guān)，而Huang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a與miRNA-155表達(dá)水平異常可反映腎臟疾病嚴(yán)重程度，并可通過(guò)NF-κB等通路影響疾病的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示對(duì)照組、LN穩(wěn)定組、LN活動(dòng)組血清miRNA-146a、miRNA-155相對(duì)表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，提示miRNA-146a、miRNA-155可能參與LN發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程。

抗ds-DNA抗體水平升高、補(bǔ)體C3水平含量下降可反映LN患者腎臟受損程度及疾病活動(dòng)程度[20]。有臨床研究顯示，SLE患者抗C1q抗體與SLEDAI、C3和C4水平具有良好相關(guān)性，是一種較為敏感且特異的自身抗體，對(duì)評(píng)估疾病活動(dòng)程度具有重要意義[21-22]。本研究結(jié)果顯示，LN患者血清miRNA-146a、miRNA-155表達(dá)水平與ESR、抗ds-DNA抗體、抗C1q抗體水平及SLEDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與補(bǔ)體C3水平呈正相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步提示血清miRNA-146a、miRNA-155表達(dá)水平與LN活動(dòng)情況有關(guān)。而ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-146a與miRNA-155預(yù)測(cè)LN病情活動(dòng)的敏感度及特異度均較高，提示血清兩者對(duì)LN患者的疾病進(jìn)展情況具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，或可作為臨床評(píng)估LN病情活動(dòng)性的輔助標(biāo)志物。

綜上所述，LN患者血清miRNA-146a與miRNA-155表達(dá)水平降低，兩者預(yù)測(cè)LN病情活動(dòng)的效能均較高，或可成為評(píng)估LN疾病活動(dòng)性的重要標(biāo)志物。