黃蘭英，胡紅元，池 騁，宋儒勝，陳 霞，張昌容，尚小麗*，吳建偉

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院貴州省免疫細(xì)胞與抗體工程研究中心，貴陽 550025；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；3. 三峽旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌 443000；4. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽 550006)

秸稈是地球上最豐富的可再生資源，其主要成分為木質(zhì)纖維素，包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素(Sarkaretal., 2012)。據(jù)報(bào)道，全球植物利用光合作用合成的木質(zhì)纖維素每年能夠達(dá)到2×1011噸/年，可固定極為豐富的太陽能(4×1021J/yr)(黃鑫，2015)，這使得秸稈成為了世界上儲量最大的可再生資源(Wilson, 2011)。

目前我國秸稈資源一直存在污染重、消耗大、利用率低等問題，現(xiàn)有的秸稈處理方法有化學(xué)法、物理法、物理化學(xué)法和生物法(楊玉楠等，2007；Kumaretal., 2009; Zhengetal., 2018)。前3種處理方法大多都需要昂貴的機(jī)器設(shè)備，以及消耗大量的能量來創(chuàng)造高溫高壓或適應(yīng)強(qiáng)酸強(qiáng)堿的極端環(huán)境(Liuetal., 2017; Vannesteetal., 2017; Veluchamyetal., 2018)，因而應(yīng)用方面受到限制。生物法方面利用微生物工程等生產(chǎn)復(fù)合纖維素酶用以降解纖維素現(xiàn)應(yīng)用較廣(Wongetal., 2014)，但由于該項(xiàng)生物技術(shù)設(shè)備成本高(Daasetal., 2018)、微生物酶工程預(yù)處理周期過長等問題，在工業(yè)界仍然無法被大規(guī)模應(yīng)用(Kumaretal., 2008; Fischeretal., 2013; Garveyetal., 2013)，這也是利用微生物降解木質(zhì)纖維素的瓶頸(Russelletal., 2009)。生物法另一方面在利用反芻動物消化研究中，也存在木質(zhì)纖維素利用率不佳，降解時(shí)間較長等不足(Watanabe and Tokuda, 2010; 謝蓉蓉等，2015)。因此，尋求高效降解木質(zhì)纖維素的方法，成為了當(dāng)前秸稈類生物質(zhì)能開發(fā)利用的關(guān)鍵。

昆蟲的消化系統(tǒng)異于反芻動物，目前已有大量研究表明，很多昆蟲的消化系統(tǒng)可作為一種高效的生物反應(yīng)器在降解木質(zhì)纖維素消化中發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)已報(bào)道的具有較好木質(zhì)纖維素降解潛力的昆蟲有：白蟻Termitidae(Petersonetal., 2016; Lietal., 2017; Gengetal., 2018)、黃粉蟲Tenebriomolitor(阮傳清等，2018)、黑水虻HermetiaillucensL.(Bavaetal., 2019)、竹鼻甲蟲Cyrtotrachelusbuqueti(Luoetal., 2018; Luoetal., 2019)等。

貴州為我國產(chǎn)酒大省，高粱秸稈和酒糟資源豐富。本課題組前期在與貴州茅臺集團(tuán)合作進(jìn)行酒糟資源化處理中發(fā)現(xiàn)，利用家蠅Muscadomestic可對酒糟進(jìn)行有效降解(吳建偉等，2014 a；2014 b)，并初步證實(shí)家蠅體內(nèi)含有可對酒糟和秸稈進(jìn)行降解的內(nèi)源木質(zhì)纖維素酶類(張姝等，2013；胡蓉等，2013)，但目前關(guān)于家蠅對高粱秸稈類的具體消化降解情況和高粱秸稈對家蠅生長發(fā)育的影響等尚缺乏詳細(xì)研究，且未見報(bào)道。此外，劉穎等(2017)雖已報(bào)道了小麥秸稈對家蠅的飼養(yǎng)效果，但其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的角度與本研究存在差異。因此，為探明家蠅對高粱秸稈和小麥秸稈的木質(zhì)纖維素利用情況，以及高含量秸稈對家蠅生長發(fā)育的影響，本文開展了相關(guān)研究，以期為今后規(guī)?；眉蚁壸鳛橘Y源昆蟲，生物降解秸稈類有機(jī)廢棄物提供理論依據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

以貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁育的家蠅為試驗(yàn)昆蟲。

1.2 供試飼料

幼蟲飼料：(1)高粱秸稈和小麥秸稈飼料：將秸稈曬干后，用粉碎機(jī)粉碎，并通過孔徑2 mm網(wǎng)篩篩選，40℃干燥機(jī)烘干后，裝袋密封，4℃保存?zhèn)溆茫?2)麥麩飼料：用干燥機(jī)40℃烘干，裝袋密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

成蟲飼料：(1)成蟲批量保種時(shí)，使用1 ∶1的白糖和奶粉固體混合后放于培養(yǎng)皿飼養(yǎng)，飲用水為置于培養(yǎng)皿內(nèi)(放有海綿)的無菌蒸餾水。(2)成蟲實(shí)驗(yàn)單頭飼養(yǎng)時(shí)，飼料為10%奶粉水(溶質(zhì)為白糖和奶粉1 ∶1的混合物，溶劑為無菌蒸餾水)，用棉球蘸取適量奶粉水放于養(yǎng)蟲瓶內(nèi)(190 mL一次性塑料杯，紗布封口，下文中養(yǎng)蟲瓶均此類型)，并注意每日更新。

1.3 昆蟲保種飼養(yǎng)條件

保種和實(shí)驗(yàn)用家蠅均飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲室中，養(yǎng)蟲室溫度27℃，相對濕度(RH)60%～70%，光照周期12 N ∶12 D。保種用家蠅幼蟲按飼料種類不同分為純麥麩保種飼養(yǎng)、70%高粱秸稈粉(30%為麥麩)保種飼養(yǎng)和70%小麥秸稈粉保種(30%為麥麩)飼養(yǎng)。各飼養(yǎng)種類幼蟲分別飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲盒(體積為1 000 mL的一次性塑料碗，下文中養(yǎng)蟲盒均此類型)中，盒口有紗布封口，并將養(yǎng)蟲盒放于對應(yīng)的養(yǎng)蟲籠中(55 cm×55 cm)，每日對幼蟲生長情況和化蛹情況進(jìn)行觀察，對飼料濕潤情況適時(shí)調(diào)整；待有成蟲羽化后將養(yǎng)蟲盒紗布打開讓成蟲飛出，成蟲仍保種飼養(yǎng)于的該養(yǎng)蟲籠內(nèi)，待成蟲羽化3 d后即可根據(jù)保種和實(shí)驗(yàn)需要開始接卵。保種用卵隨需隨接，實(shí)驗(yàn)用卵于每天早上9 ∶00開始，接卵盒(盒內(nèi)含已提前一天發(fā)酵的飼料)敞口放入蠅籠進(jìn)行接卵，當(dāng)天中午12 ∶00結(jié)束，接卵后將卵塊用毛筆挑出放入少量含無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)，利用無菌水快速將卵分離并計(jì)數(shù)放入已盛有發(fā)酵飼料的養(yǎng)蟲盒中，并將此批卵孵化的幼蟲視為同齡幼蟲開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 3種飼料的制備和不同的處理方法

先配置3種飼料：(1)在100 g高粱秸稈粉中加入50 g的麥麩設(shè)為70%高粱秸稈組；(2)在100 g麥秸稈粉中加入50 g麥麩設(shè)為70%小麥秸稈組；(3)將含150 g純麥麩設(shè)為麥麩組。而后每種飼料均做3種處理方式：(1)對照組：不做任何處理，干燥飼料150 g于室溫條件下放置6 d后待測；(2)發(fā)酵組：取150 g干燥飼料，向內(nèi)加入150 mL無菌水，室溫發(fā)酵6 d后待測；(3)家蠅幼蟲取食組：取150 g干燥飼料，向內(nèi)加入150 mL無菌水，室溫發(fā)酵1 d后的向其中接入300頭卵喂養(yǎng)至家蠅幼蟲第5天，后分離去除家蠅待測。

1.5 化學(xué)成分測定

將上述3種飼料分別經(jīng)對照、發(fā)酵和幼蟲取食處理后，收集樣品并對其粗蛋白、粗脂肪、總糖、纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的含量進(jìn)行測定，以觀察發(fā)酵和幼蟲取食對不同秸稈飼料的降解情況。測定方法或依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分別如下，粗蛋白(GB/T 6432-1994)、粗脂肪(GB/T 5512-2008)、總糖(DNS法)(Miller, 1959)、纖維素、木質(zhì)素和半纖維素(Van Soest法)(劉文靜等，2013)。每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 不同配比飼料對家蠅生長發(fā)育影響的觀察

設(shè)置純麥麩為對照組，實(shí)驗(yàn)組則將純麥麩、高粱秸稈粉、麥秸稈粉和菜籽餅按不同比例進(jìn)行配置，并飼養(yǎng)家蠅幼蟲，詳細(xì)配比如下(表1)。

表1 不同配比飼料處理

每實(shí)驗(yàn)組稱取已配比好的飼料40 g放入養(yǎng)蟲盒中，并向每個(gè)養(yǎng)蟲盒中加入等量的無菌蒸餾水，均勻攪拌，待室溫發(fā)酵1 d后，每盒接入30頭卵，養(yǎng)蟲盒用紗布封口并單獨(dú)放于養(yǎng)蟲籠中開始實(shí)驗(yàn)，每實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。在卵接種后第3天(3齡幼蟲)隨機(jī)挑選養(yǎng)蟲盒內(nèi)8 頭幼蟲，測量每頭幼蟲的體長、體重并放回養(yǎng)蟲盒；當(dāng)幼蟲進(jìn)入預(yù)蛹后(一般為接卵后第5天)，從養(yǎng)蟲盒內(nèi)挑取預(yù)蛹12頭分別放入養(yǎng)蟲瓶中單頭單瓶飼養(yǎng)并編號，期間養(yǎng)蟲瓶內(nèi)家蠅發(fā)育至成蟲后需于瓶內(nèi)放入沾有10%奶粉水的棉球作為成蟲營養(yǎng)供給，并根據(jù)單頭單瓶飼養(yǎng)的家蠅發(fā)育情況統(tǒng)計(jì)家蠅發(fā)育歷期。

另待養(yǎng)蟲盒內(nèi)飼養(yǎng)的家蠅幼蟲化蛹后，隨機(jī)挑取8頭蛹，測量記錄每頭蛹的體長、體重并放回；待養(yǎng)蟲盒內(nèi)有家蠅羽化后，將盒口紗布打開將家蠅釋放入養(yǎng)蟲籠，并隨機(jī)挑取8頭成蟲放入-20℃冰柜10 min進(jìn)行處死，測量每頭成蟲的體長、體重，剩余成蟲依舊在籠內(nèi)飼養(yǎng)至自然死亡。并根據(jù)養(yǎng)蟲盒和養(yǎng)蟲瓶內(nèi)所有家蠅的整體化蛹和羽化情況，統(tǒng)計(jì)化蛹率、羽化率和性比。

此外，本實(shí)驗(yàn)中由于家蠅初孵幼蟲過小且有鉆入潮濕飼料內(nèi)的習(xí)性，難以對家蠅卵孵化率進(jìn)行觀察，故本研究視各組飼料喂養(yǎng)下家蠅的卵孵化率均為1，則家蠅總存活率=1×化蛹率×羽化率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Excel 2016對實(shí)驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖，各處理相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS Statistics 18.0對數(shù)據(jù)采用Duncan氏新復(fù)極差法在顯著性水平0.05的條件下進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種飼料不同處理?xiàng)l件下粗蛋白、粗脂肪和總糖的含量變化

根據(jù)3種飼料在不同處理?xiàng)l件下粗蛋白、粗脂肪、總糖的測定結(jié)果顯示(圖1～圖3)，跟秸稈飼料相比，麥麩的粗蛋白、粗脂肪和總糖含量最高，而在高粱秸稈和小麥秸稈中，又以高粱秸稈的營養(yǎng)成分較高，其粗蛋白和總糖含量都要高于小麥秸稈。而3種飼料在不同處理?xiàng)l件下，對照組、發(fā)酵組和家蠅幼蟲取食組中飼料粗蛋白、粗脂肪、總糖的含量則均呈現(xiàn)對照組>發(fā)酵組>家蠅取食組的趨勢，此外僅高粱秸稈飼養(yǎng)條件下發(fā)酵組和幼蟲取食組相比粗蛋白的含量無顯著差異，余下各組均差異顯著(P<0.05)。由此說明，飼料環(huán)境中存在的微生物可使飼料當(dāng)中的營養(yǎng)成分初步降解，而家蠅幼蟲的取食則可以使飼料中營養(yǎng)成分的降解加劇。

圖1 3種飼料不同處理?xiàng)l件下粗蛋白的含量比較Fig.1 Comparison of crude protein content in 3 feeds under different treatments注：圖上標(biāo)有不同小寫字母表示處理間有顯著差異(P<0.05)。下圖同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference for date in the same column group at P<0.05 level. The same below.

圖2 3種飼料不同處理?xiàng)l件下粗脂肪的含量比較Fig.2 Comparison of crude fat content in 3 feeds under different treatments

2.2 3種飼料不同處理?xiàng)l件下纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量變化

通過測定3種飼料在不同處理?xiàng)l件下纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量結(jié)果進(jìn)行分析(圖4～圖6)，3種飼料未做任何處理下(對照組)的木質(zhì)纖維素總含量呈現(xiàn)小麥秸稈>高梁秸稈>麥麩的趨勢，其中纖維素含量比較豐富的為麥秸稈和高粱秸稈，半纖維素含量最豐富的為麥麩，而木質(zhì)素含量在3種飼料中基本相當(dāng)。將3種飼料均采用未處理(空白對照)、單純發(fā)酵和發(fā)酵后飼喂家蠅，結(jié)果表明各種飼料經(jīng)處理后其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量在對照組、發(fā)酵組和幼蟲取食組中具有明顯差異(P<0.05)，且均呈現(xiàn)對照組>發(fā)酵組>家蠅取食組的趨勢，由此說明，家蠅幼蟲對木質(zhì)纖維素各成分的降解程度要優(yōu)于單純的微生物發(fā)酵。

圖3 3種飼料不同處理?xiàng)l件下總糖的含量比較Fig.3 Comparison of total sugar content in 3 feeds under different treatments

圖4 3種飼料不同處理?xiàng)l件下纖維素的含量比較Fig. 4 Comparison of cellulose content in 3 feeds under different treatments

圖5 3種飼料不同處理?xiàng)l件下半纖維素的含量比較Fig.5 Comparison of hemicellulose content in 3 feeds under different treatments

圖6 3種飼料不同處理?xiàng)l件下木質(zhì)素的含量比較Fig.6 Comparison of lignin content in 3 feeds under different treatments

2.3 不同配比飼料對家蠅生長發(fā)育的影響

使用高粱秸稈和麥秸稈按照不同配比飼養(yǎng)家蠅，高粱秸稈的飼養(yǎng)效果要優(yōu)于麥秸稈的飼養(yǎng)效果。其中，當(dāng)飼料中不添加菜籽餅時(shí)：秸稈喂養(yǎng)的家蠅其各蟲態(tài)體長、幼蟲和成蟲體重都要顯著(P<0.05)低于麥麩飼養(yǎng)的家蠅；在相同秸稈配比條件下，高粱秸稈飼喂的家蠅其各蟲態(tài)體長、體重、總存活率和發(fā)育歷期均要優(yōu)于麥秸稈喂養(yǎng)的家蠅，且在幼蟲和蛹的體長、蛹重方面差異顯著(P<0.05)；70%高粱秸稈喂養(yǎng)時(shí)家蠅存活率和發(fā)育歷期較麥麩飼養(yǎng)無顯著差異(P>0.05)，而70%小麥秸稈喂養(yǎng)時(shí)家蠅存活率和發(fā)育歷期較麥麩飼養(yǎng)存在顯著差異(P<0.05)，當(dāng)麥秸稈添加至90%時(shí)，家蠅則無法存活(表2、表3)。在秸稈含量相同的飼料中，適當(dāng)添加菜籽餅，可提高家蠅各發(fā)育階段的體長、體重、存活率，縮短其發(fā)育歷期。

表2 不同配比飼料處理對家蠅各蟲態(tài)體長、體重的影響

表3 不同配比飼料處理對家蠅化蛹率、羽化率、存活率、發(fā)育歷期和雌雄比的影響

3 結(jié)論與討論

我國是世界上秸稈產(chǎn)量最多的國家，秸稈作為豐富的生物質(zhì)能源，一直以來都存在轉(zhuǎn)化難、利用率低等問題，這也成為了限制其資源化循環(huán)利用的主要瓶頸(張曉旭等，2018)。家蠅為腐食性昆蟲，生活周期短、繁殖力旺盛、易于規(guī)模化飼養(yǎng)。利用家蠅幼蟲作為生物轉(zhuǎn)化器降解秸稈，一方面可以提高秸稈降解效率，改善農(nóng)業(yè)環(huán)境，另一方面還可獲得更多動物蛋白，從而提高秸稈的資源化利用價(jià)值(Moonetal., 2001; Zhangetal., 2012)。

小麥秸稈和高粱秸稈均為我國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物，資源豐富但不易轉(zhuǎn)化利用。本研究以小麥秸稈和高粱秸稈為飼料，通過分別對其進(jìn)行不同處理后喂養(yǎng)家蠅，一方面對代謝后的營養(yǎng)和秸稈化學(xué)成分進(jìn)行檢測，另一方面探究了不同配比的秸稈飼料對家蠅生長發(fā)育的影響，旨在探明家蠅對不同秸稈的降解情況，并明確更適于利用家蠅來降解的秸稈種類和秸稈飼料最大配比濃度，從而為今后規(guī)模化利用家蠅來降解秸稈類有機(jī)廢棄物提供重要的數(shù)據(jù)參考和理論支撐。

通過上述研究結(jié)果表明，一般營養(yǎng)成分(粗蛋白和總糖)方面，常規(guī)家蠅飼料麥麩(對照組)的營養(yǎng)成分>高粱秸稈>小麥秸稈；木質(zhì)纖維素總體含量方面，小麥秸稈>高粱秸稈 >麥麩；另外，各飼料處理組中粗蛋白、粗脂肪、總糖、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量，均呈現(xiàn)為未發(fā)酵組>發(fā)酵組>家蠅取食組的趨勢，且除高粱秸稈組粗蛋白外其余成份各組間均差異顯著。由此說明微生物發(fā)酵過程可消耗秸稈飼料的營養(yǎng)物質(zhì)，并可促進(jìn)秸稈木質(zhì)纖維素的降解，而家蠅取食除可通過自身對秸稈營養(yǎng)物質(zhì)的消耗生產(chǎn)附加值較高的動物蛋白產(chǎn)品，還可更大程度的顯著降解木質(zhì)纖維素。本結(jié)論與劉穎等(2017)研究結(jié)果存在差異，劉穎等研究發(fā)現(xiàn)，小麥秸稈粗蛋白和可溶性糖的含量發(fā)酵組>未發(fā)酵組，而纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量則家蠅取食組>發(fā)酵組。此外，彭宇等(1996)曾報(bào)道家蠅幼蟲生長發(fā)育階段所需的能量營養(yǎng)物質(zhì)主要由糖類供應(yīng)，由此說明從營養(yǎng)成分上看，本研究中高粱秸稈較小麥秸稈更適于家蠅幼蟲的生長發(fā)育。

在不同配比秸稈飼料對家蠅生長發(fā)育的影響方面，本研究發(fā)現(xiàn)秸稈配比相同的條件下，高粱秸稈喂養(yǎng)的家蠅各蟲態(tài)體長、體重、總存活率和發(fā)育歷期均要優(yōu)于麥秸稈喂養(yǎng)，再次說明高粱秸稈更適于家蠅的飼養(yǎng)；此外，在秸稈含量相同的飼料中，適當(dāng)添加菜籽餅，可提高家蠅各發(fā)育階段的體長、體重、存活率，延長其發(fā)育歷期，說明菜籽餅?zāi)軌蚪o家蠅提供更多營養(yǎng)物質(zhì)需求，對其生長發(fā)育有著顯著影響；而當(dāng)飼料中小麥秸稈添加至90%時(shí)，家蠅幼蟲無法進(jìn)行正常的生長發(fā)育繁殖，這可能與麥秸稈粗蛋白、總糖等營養(yǎng)成分的含量不高有關(guān)，從而影響了家蠅幼蟲正常生長繁殖；總體來說，秸稈營養(yǎng)條件雖較麥麩匱乏，導(dǎo)致幼蟲期、蛹期延長，成蟲期縮短，羽化率及體重下降，但高粱秸稈飼養(yǎng)條件下家蠅生長均要優(yōu)于麥秸稈，甚至在純高粱秸稈喂養(yǎng)條件下，其化蛹率、羽化率和存活率等重要指標(biāo)均與麥麩飼養(yǎng)無顯著差異，說明純高粱秸稈喂養(yǎng)下家蠅仍能保持正常的生長發(fā)育，故適于將家蠅作為生物轉(zhuǎn)化器用于秸稈尤其是高粱秸稈的產(chǎn)業(yè)化降解。

綜上所述，本文研究結(jié)果表明，一方面家蠅不僅可以通過對秸稈營養(yǎng)物質(zhì)的取食生產(chǎn)附加值更高的動物蛋白，還可以顯著降解秸稈中的木質(zhì)纖維素，明確了家蠅對秸稈的降解效果；另一方面較麥秸稈，家蠅在純高粱秸稈飼養(yǎng)下能保持更好的生長發(fā)育，更適用于高粱秸稈的規(guī)?；锝到?，以上結(jié)論為今后規(guī)?；眉蚁墎斫到饨斩掝愑袡C(jī)廢棄物提供了重要的數(shù)據(jù)參考和理論支撐。目前，關(guān)于家蠅幼蟲降解秸稈的分子機(jī)制尚不清楚，如何更好的提高家蠅對秸稈木質(zhì)纖維素的降解率也有待研究，解決這些問題是日后規(guī)?；眉蚁壐咝锝到饨斩掝惿镔|(zhì)能源的關(guān)鍵，也是我國進(jìn)行農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的趨勢。