范榮莉，王 康，季文娜，陳孝梅，藺哲廣，吉 挺*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，不僅為人類提供蜂蜜、蜂花粉、蜂膠和蜂王漿等豐富的蜂產(chǎn)品，而且作為農(nóng)作物授粉的重要媒介昆蟲(Pottsetal., 2010)，對農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用(Free 1970; Gallaietal., 2009)。蜜蜂是一種變溫動物，體溫隨著外界環(huán)境溫度改變而變化。整個蜂群可以被看作特殊的“超個體”，當(dāng)蜂群內(nèi)存在子脾時，子脾附近的溫度能夠維持在34.5℃左右(陳恕仁和曹磊, 2012)。當(dāng)外界環(huán)境溫度較低時，蜜蜂通過胸部肌肉震動產(chǎn)熱、相互結(jié)團(tuán)等方式提高蜂群的溫度。而當(dāng)外界氣溫超過35℃，蜜蜂通過扇風(fēng)、采水降溫等方式調(diào)節(jié)蜂群的溫度(賴康等, 2012)。

溫度影響蜜蜂卵、幼蟲和蛹期的生長發(fā)育，甚至能夠干擾蜜蜂羽化后的行為表現(xiàn)。意蜂工蜂蛹期在29～37℃均可發(fā)育，最適宜溫度為35℃，隨著溫度降低工蜂封蓋發(fā)育期極顯著延長。封蓋時的發(fā)育期溫度低于29℃或者高于37℃會導(dǎo)致意蜂發(fā)育畸形，低于28℃或者高于39℃意蜂的封蓋子全部死亡(李月, 2008)。最近有研究發(fā)現(xiàn)對比35℃，32℃蛹期發(fā)育而來的蜜蜂擁有更重的體重和更長的壽命(Szentgy?rgyietal., 2018)。蛹期溫度能夠影響成年蜜蜂腦部蘑菇體內(nèi)突觸復(fù)合體的大小和結(jié)構(gòu)，這些變化可能會對蜜蜂神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，進(jìn)而改變蜜蜂行為(Grohetal., 2004)。Becher等(2009)發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)(32～36℃)，蛹期溫度越低的蜜蜂首次采集日齡越晚，且在社會分工中更傾向于采蜜任務(wù)。有研究發(fā)現(xiàn)蛹期發(fā)育溫度顯著影響蜜蜂的短期記憶能力，報道稱35～36℃溫度環(huán)境發(fā)育的蜜蜂表現(xiàn)突出的記憶行為，而經(jīng)歷32℃蛹期溫度的蜜蜂成年后回巢率降低(Tautzetal., 2003; Jonesetal., 2005)。此外，其他如發(fā)育溫度對巢內(nèi)溫度的調(diào)節(jié)行為、采集能力和抗螨梳理行為等研究亦有報道(Siegeetal., 2005; Currie and Tahmasbi 2008; 楊爽等, 2010)。

農(nóng)藥除直接殺死蜜蜂外，會影響蜜蜂的行為、神經(jīng)、發(fā)育、繁殖力、免疫力、學(xué)習(xí)能力等其他特征(Wuetal., 2017)。新煙堿類農(nóng)藥由于其特殊的結(jié)構(gòu)以及對高等動物低毒等特點(diǎn)使其廣泛被使用，吡蟲啉就是其中之一(Castleetal., 2010; Jeschkeetal., 2011)。吡蟲啉在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上被廣泛用于種子、葉面和土壤中多種害蟲的防治，對環(huán)境的負(fù)面影響也逐漸顯露(張敏恒等, 2012)。目前關(guān)于吡蟲啉對蜜蜂的影響研究報道有很多：周婷等(2013)發(fā)現(xiàn)吡蟲啉除了文獻(xiàn)報道的抑制n ACh R的表達(dá)外，還能抑制n ACh R-α7的表達(dá)量；Daniel等(2014)研究了吡蟲啉對非洲蜜蜂頭部和胸部線粒體生物能功能的影響，發(fā)現(xiàn)吡蟲啉可阻斷線粒體產(chǎn)能，導(dǎo)致ATP的消耗；代平禮等(2013)、Axel等(2004)用吡蟲啉以經(jīng)口方式對蜜蜂進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)吡蟲啉可損害蜜蜂嗅覺學(xué)習(xí)能力；吳艷艷等(2014)從細(xì)胞水平證實(shí)了亞致死劑量吡蟲啉對成年意蜂工蜂腦神經(jīng)細(xì)胞具有致凋亡作用。隨著農(nóng)藥安全使用指導(dǎo)及風(fēng)險監(jiān)控的逐漸加強(qiáng)，由高毒農(nóng)藥引起的蜜蜂急性中毒的現(xiàn)象得以緩解，但農(nóng)藥的亞致死效應(yīng)帶來的一系列潛在的影響也逐漸地引起重視。如亞致死劑量農(nóng)藥處理后導(dǎo)致蜜蜂幼蟲孵化率降低，成年工蜂分工行為不明顯，采集釀蜜混亂，巢房清理行為也明顯減少，導(dǎo)航定位和辨別同群蜜蜂的能力下降，學(xué)習(xí)記憶能力受到影響等相繼被報道(Kreissl and Bicker, 1989; Vandame and Belzunces, 1998; Alixetal., 2001; Yangetal., 2012)。

意蜂工蜂蛹期在29～37℃均可發(fā)育，成年工蜂在10～38℃能夠正常出箱活動。因此，外界環(huán)境溫度和農(nóng)藥很可能是蜜蜂物種同時遭遇的兩種脅迫。Piotr等(2010)通過實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工飼喂的方式比較不同發(fā)育溫度蜜蜂對樂果農(nóng)藥的耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)33℃孵化的蜜蜂幼蟲對農(nóng)藥更加敏感，半數(shù)致死濃度遠(yuǎn)高于(28倍)其在35℃環(huán)境中的濃度。關(guān)于溫度對蜜蜂生長發(fā)育的影響和農(nóng)藥對蜜蜂的影響研究較多，然而，國內(nèi)外關(guān)于羽化后成年蜜蜂暴露的環(huán)境溫度與農(nóng)藥的協(xié)調(diào)作用的研究較少。本文以研究較為透徹的吡蟲啉農(nóng)藥為例，分析羽化后蜜蜂在不同溫度環(huán)境受到吡蟲啉脅迫后的影響，以期為農(nóng)藥在不同季節(jié)使用的安全性評價以及蜜蜂保護(hù)提供新的研究角度。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

試驗(yàn)蜜蜂來自揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)蜂場，為本地意大利蜜蜂Apismelliferaligustica。

1.2 供試試劑及主要儀器

吡蟲啉原藥(97%)來自揚(yáng)州大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒來自諾唯贊生物科技有限公司；蛋白濃度定量試劑盒，AchE試劑盒，CarE試劑盒和GST試劑盒均來自索萊寶生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。恒溫培育箱來自江南寧波儀器制造廠(HWS-328)；全自動酶標(biāo)儀型號為Biotek synergy2。

1.3 試蟲處理

準(zhǔn)備3箱群勢一致的健康姐妹蜂王群，用稀糖獎勵飼喂和蜂王限制器控制蜂王在給定空巢脾上產(chǎn)卵8 h。觀察到巢脾上觀察到大量卵后將蜂王隔離在限制器外，工蜂可以自由進(jìn)出哺育幼蟲。19 d后，分別從3箱中取出相應(yīng)巢脾，放到實(shí)驗(yàn)室恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度35℃，濕度75%)。待新蜂出房后，立即捉取240頭，隨機(jī)分為2組，每組6籠，每籠20頭，分別放入25和35℃培養(yǎng)箱環(huán)境中。將分組蜜蜂饑餓5 h后，人工飼喂2 μL下述不同糖飼料。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 不同溫度下吡蟲啉脅迫對蜜蜂毒力測定

用丙酮將97%吡蟲啉原粉配制成10 000 mg/L的原液，用50%糖水稀釋成0、4、7、10、15和20 mg/L濃度梯度。記錄24 h急性死亡率，進(jìn)行不同溫度下24 h吡蟲啉脅迫對蜜蜂毒力測定。

1.5 免疫基因表達(dá)測定

根據(jù)毒力曲線計(jì)算出25℃環(huán)境下吡蟲啉脅迫對蜜蜂的LC10為4.032 mg/L。采用1.3中方法，飼喂LC10和4.032 mg/L丙酮對照。24 h后將蜜蜂處死，從不同溫度處理的對照和農(nóng)藥脅迫組中各取3頭蜜蜂，截取頭部組織用于免疫基因表達(dá)測定，試驗(yàn)重復(fù)3次。使用Trizol法提取總RNA，按照試劑盒(FastQuant RT Kit，天根)說明書操作反轉(zhuǎn)錄出cDNA。構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ酶10 μL，上、下游引物(表1)各0.4 μL，cDNA 0.4 μL，ROX 0.4 μL，無RNA酶水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)(30個)：95℃ 10 s，60℃ 30 s；溶解曲線階段：60℃升溫至95℃。采用2-△△Ct法進(jìn)行相對表達(dá)定量。

表1 基因引物

1.6 解毒酶活性測定

根據(jù)毒力曲線計(jì)算出25℃環(huán)境下吡蟲啉脅迫對蜜蜂的LC10為4.032mg/L。采用1.3中方法，飼喂LC10和4 mg/L丙酮對照。24 h后將蜜蜂處死，從不同溫度處理的對照和農(nóng)藥脅迫組中各取5頭蜜蜂，截取頭部組織測定Ache活性，腹部用于測定羧酸酯酶CarE和GST活性，試驗(yàn)重復(fù)3次。按照蛋白濃度定量試劑盒，AchE試劑盒，CarE試劑盒和GST試劑盒說明書要求測定蛋白濃度和解毒酶活性。酶活性易受高溫影響，采用低溫勻漿破碎儀破碎組織。使用Biotek synergy2全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行自動加樣和溫度控制，以滿足酶活試劑盒需要的溫度和精確反應(yīng)時間的要求。

1.7 數(shù)據(jù)處理

毒力曲線數(shù)據(jù)使用軟件SPSS中probit分析程序完成，其余采用Duncan氏多重和LSD互作比較進(jìn)行分析，文中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，以P<0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下吡蟲啉農(nóng)藥對蜜蜂死亡率的影響

1日齡新出房蜜蜂在25℃和35℃溫度環(huán)境暴露于吡蟲啉農(nóng)藥脅迫的急性毒性回歸方程見表2。蜜蜂的死亡率與吡蟲啉農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)，25℃和35℃環(huán)境中吡蟲啉對1日齡蜜蜂的急性毒性LC50分別為11.074 mg/L和8.948 mg/L，差異顯著(P<0.05)。說明處于相同濃度的吡蟲啉毒素脅迫，暴露于35℃的蜜蜂死亡率顯著增加(P<0.05)。結(jié)果表明，溫度可以與吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)生協(xié)調(diào)作用，對比25℃，35℃環(huán)境溫度可以加劇農(nóng)藥對蜜蜂的急性死亡脅迫。

表2 吡蟲啉對意大利蜜蜂的毒力曲線(24 h)

2.2 不同溫度下LC10吡蟲啉農(nóng)藥對蜜蜂免疫基因的影響

在本實(shí)驗(yàn)選擇的溫度條件下，對照組的免疫基因沒有出現(xiàn)顯著的表達(dá)差異，表明溫度因子不會影響蜜蜂免疫基因的表達(dá)。而LC10吡蟲啉脅迫能抑制機(jī)體內(nèi)免疫基因Abaecin，Hymenoptaecin，Apidaecin，Defensin1,Defensin 2基因的表達(dá)，其中Abaecin和Apidaecin抑制效果顯著(P<0.05)。這種趨勢在25℃和35℃環(huán)境中表現(xiàn)一致，而且35℃環(huán)境中下調(diào)更為明顯，但是不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明，溫度因子可以與吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)生協(xié)調(diào)作用，對比25℃，35℃環(huán)境可能會更大程度的降低蜜蜂免疫能力。

圖1 不同溫度下LC10吡蟲啉對蜜蜂6種免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響 Fig.1 Effects of LC10 imidacloprid on the expression of six immune-related genes in honeybees at different temperatures注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)；圖2同。Note：Different small letters above bars represent significant difference (P<0.05)；The same for Fig. 2.

2.3 不同溫度下LC10吡蟲啉農(nóng)藥對蜜蜂解毒酶和AchE活性的影響

不同處理蜜蜂的解毒酶活性見圖2。由圖可知，CYP450和CarE經(jīng)過吡蟲啉處理活性均顯著提高(P<0.05)，AchE活性出現(xiàn)顯著抑制。值得注意的是，蜜蜂在25℃環(huán)境受到吡蟲啉脅迫后CYP450激活程度最高，顯著高于兩種空白對照，甚至顯著高于其在35℃環(huán)境中(P<0.05)。GST活性出現(xiàn)不同程度變化，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同溫度下LC10吡蟲啉對蜜蜂解毒酶和AchE活性的影響Fig. 2 Effects of LC10 imidacloprid on bee detoxifying enzyme and AchE activities at different temperatures注：A，CYP450，細(xì)胞色素P450；B，CarE，羧酸酯酶；C，GST，谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶；D，AchE，乙酰膽堿酯酶.Note：A，CYP450，Cytochrome P450；B，CarE，Carboxylesterase；C，GST，Glutathione-S-transferase；D，AchE，Acetylcholinesterase.

3 結(jié)論與討論

胃毒法是實(shí)驗(yàn)室常用的農(nóng)藥安全性評價方法。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采取讓蜜蜂自由采食含吡蟲啉農(nóng)藥糖水的方式進(jìn)行農(nóng)藥因子脅迫,結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露于相同濃度吡蟲啉農(nóng)藥的蜜蜂死亡率在各個重復(fù)組中差異較大，多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)24 h死亡毒力回歸曲線相關(guān)系數(shù)0.8～0.9之間。因此，采取人工單只口頭飼喂的方法進(jìn)行農(nóng)藥脅迫，使得毒力曲線相關(guān)系數(shù)提高到0.9以上，增加了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并根據(jù)25℃毒力曲線確定LC10(4.032 mg/L)劑量濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。

抗菌肽在昆蟲先天免疫系統(tǒng)中起到非常重要的作用，是昆蟲體液免疫的重要功能物質(zhì)(Ferrandonetal., 2007)。目前，蜜蜂上已經(jīng)鑒定到6種免疫效應(yīng)抗菌肽：常見的Defensin家族基因(Defensin 1和Defensin 2)，富含亮氨酸的Abaecin和Apidaecin蛋白以及蜜蜂物種特有的Hymenoptaecin和Apisimin抗菌肽(Evansetal., 2006)。2006年蜜蜂全基因組測序完成后，發(fā)現(xiàn)蜜蜂種群具有的已知免疫基因家族數(shù)量較少(Weinstock, 2006)。因此，除了群體社會性防御可以有效地降低病原體的壓力外，現(xiàn)存免疫基因強(qiáng)大的多態(tài)性可能也是維持蜜蜂健康生長的重要因素，如Apidaecin每個外顯子的可變剪切都能編碼出一種功能獨(dú)特的抗菌肽(Casteels-Jossonetal., 1993; Evansetal., 2006)。這些抗菌肽在蜜蜂抵抗外源毒素侵害如病原菌和農(nóng)藥脅迫方面發(fā)揮著重要的作用(Danihlíketal., 2015; 施騰飛等, 2017)。本研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉處理可以顯著降低Abaecin和Apidaecin基因的表達(dá)。Defensin 1、Defensin 2、Hymenoptaecin和Apisimin基因表達(dá)有所降低，但結(jié)果差異不顯著，在更高的溫度(35℃)環(huán)境中暴露于吡蟲啉農(nóng)藥的蜜蜂體內(nèi)抗菌肽基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)受到抑制更為強(qiáng)烈。這些免疫效應(yīng)抗菌肽的下調(diào)表明蜜蜂先天免疫系統(tǒng)可能受到吡蟲啉農(nóng)藥的脅迫，對比蜂群正常溫度，孵化溫度(35℃)環(huán)境下的蜜蜂免疫系統(tǒng)受到吡蟲啉脅迫后影響更為嚴(yán)重。

CYP450、GST和CarE是昆蟲體內(nèi)存在的3種重要的解毒酶，在蜜蜂內(nèi)源化合物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和農(nóng)藥代謝等方面起著非常重要的作用。CYP450和CarE是第一解毒階段主要解毒酶，GST主要作用在第二階段(Claudianosetal., 2006; Berenbaum and Johnson, 2015)。本研究對以上3種酶的比活力進(jìn)行測定和比較，結(jié)果顯示LC10劑量吡蟲啉農(nóng)藥處理可以顯著誘導(dǎo)CYP450和CarE激活，這與前人的研究結(jié)果一致(孟麗峰, 2013)。孟麗峰(2013)發(fā)現(xiàn)飼喂不同濃度的吡蟲啉農(nóng)藥，蜜蜂體內(nèi)的GST的可激活濃度范圍偏高(LC50～LC90)。在本研究中也發(fā)現(xiàn)GST活性沒出現(xiàn)顯著變化，極有可能是由于試驗(yàn)選取的LC10未達(dá)到激活閾濃度。此外，本研究比較了暴露于兩種不同溫度環(huán)境下蜜蜂吡蟲啉脅迫體內(nèi)解毒酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)在25℃環(huán)境中蜜蜂體內(nèi)CYP450的激活程度更為明顯,表明在不同溫度環(huán)境蜜蜂代謝外源毒素吡蟲啉存在差異，且可能在蜂群最適溫度環(huán)境中代謝效果更理想，這也可能是蜜蜂在孵化溫度中死亡率增加的原因。乙酰膽堿酯酶是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，能降解突觸之間的乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞(Soreq and Seidman, 2001)。新煙堿類農(nóng)藥抑制細(xì)胞色素P450解毒酶活性(Iwasaetal., 2004)，同時與病原體聯(lián)合脅迫削弱蜜蜂的免疫，使蜜蜂易感病(Vidauetal., 2011; Pettisetal., 2012)。吡蟲啉是典型的新煙堿類神經(jīng)性毒素，能夠與乙酰膽堿競爭受體的結(jié)合部位，阻斷昆蟲的正常神經(jīng)信號傳遞，使得神經(jīng)系統(tǒng)奔潰，甚至導(dǎo)致昆蟲死亡(Matsudaetal., 2001; Cresswell, 2011)。已有大量研究報道發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉農(nóng)藥會降低昆蟲體內(nèi)AchE的活性，也會使蜜蜂腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡(吳艷艷等, 2003)。本研究結(jié)果也證實(shí)吡蟲啉脅迫后蜜蜂腦部AchE的活性顯著受到抑制，而且在35℃環(huán)境中抑制更為顯著，這可能會蜜蜂的學(xué)習(xí)記憶、導(dǎo)航定位等生理功能產(chǎn)生影響。

綜上所述，環(huán)境因子會與農(nóng)藥產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)進(jìn)而加重農(nóng)藥的急性致死毒性，這為蜜蜂安全性保護(hù)和農(nóng)藥安全使用評價提供新的方向。然而，研究結(jié)果說明成年蜜蜂似乎更加適應(yīng)25℃環(huán)境，而不是發(fā)育溫度35℃，這是一個值得繼續(xù)研究的課題。