四種鰓金龜對不同植物揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)

白 茹，陳 立，王文凱

(1. 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；2. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院，河北保定 071002)

金龜甲屬鞘翅目Coleoptera金龜甲總科Scarabaeoidea，種類繁多，分布廣泛，許多種類是重要的農(nóng)林害蟲。鰓金龜科Melolonthidae是金龜甲總科的最大類群。已記錄的該總科昆蟲有3萬余種，我國分布有1 800多種(魏鴻均, 1985)。蠐螬是金龜甲幼蟲的通稱，在土壤內(nèi)隱蔽生活，食性雜，幾乎為害所有植物的根系或幼苗。成蟲喜食植物的葉、莖、花、果等，對農(nóng)作物和林木也可造成嚴(yán)重危害。在我國，為害成災(zāi)的金龜有110多種(張芝利, 1984)。

華北大黑鰓金龜HolotrichiaoblitaFalderman主要分布于東北、華北、西北等地區(qū)(仵均祥, 2002)。幼蟲主要為害農(nóng)作物，如小麥、谷子、高粱等(陸俊姣等, 2020)；成蟲取食林木、果樹嫩葉，如楊、柳、榆、桑、蘋果、槐、等(張國云等, 2006; 李婭婭等, 2018; 馬艷華等, 2018)，成蟲有趨光性，出土后尤喜在草地上群集取食交尾，5月中旬至6月中旬為成蟲危害盛期。暗黑鰓金龜HolotrichiaparallelaMotschulsky分布于河北、貴州、四川等20余個省市(仵均祥, 2002)。幼蟲嚴(yán)重危害花生、馬鈴薯、小麥秋苗等大田作物(馮曉潔, 2017; 劉艷濤等, 2020)；成蟲主要取食危害禾本科作物、豆類、薯類、花生等，成蟲有趨光性，6月下旬至7月上旬，以及8月中旬為成蟲危害高峰期，局部發(fā)生量大，危害重，常需要重點防治(徐建國等, 2002; 李為爭等, 2010;)。小黃鰓金龜MetabolusflavescensBrenske分布在華東、華北、東北等地區(qū)(仵均祥, 2002)。幼蟲取食果樹、玉米、大豆、花生的嫩根；成蟲主要為害蘋果、梨、丁香、花生、大豆、苗木雜草，成蟲無明顯趨光性，6月中旬至7月上旬為成蟲盛發(fā)期(楊福田, 1991;劉廣瑞等, 1997;楊映禮和劉霞, 2008)。福婆鰓金龜BrahminafaldermanniKraatz分布在遼寧、河北、山西(孫淑玲等, 2007b)。主要為害桃樹、梨樹、杏樹、山棗、蘋果和荊條等樹木，成蟲略有趨光性，6月至7月為活動盛期，發(fā)生量少，危害較輕(劉廣瑞等, 1997)。華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜作為優(yōu)勢種群，在河北、山東等省為害較嚴(yán)重(徐建國等, 2002; 李耀發(fā)等, 2008; 羅宗秀等, 2010; 王玉彬, 2013)。

化學(xué)信號是調(diào)控昆蟲聚集、求偶、覓食、產(chǎn)卵等行為的重要因素之一。植物揮發(fā)物是植食性昆蟲定位寄主植物的重要化學(xué)信號(Kühnle and Müller, 2010; D?tterletal., 2012)。觸角是昆蟲感知植物揮發(fā)物的主要嗅覺器官(Dengetal., 2012; 杜瀟等, 2015)。華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜、小黃鰓金龜和福婆鰓金龜都有晝伏夜出習(xí)性，主要通過嗅覺定位寄主植物(Juetal., 2018; Wangetal., 2020)。觸角電位(Electroantennography，EAG)技術(shù)能快速檢測觸角對化學(xué)物質(zhì)的電生理反應(yīng)(趙新成等, 2004)，已被廣泛應(yīng)用于測定金龜甲對植物揮發(fā)物的嗅覺感知能力(Reineckeetal., 2005; 張艷玲等, 2006; Wolde-Hawariatetal., 2007; Vutsetal., 2010; 鄧思思等, 2011; 李為爭等, 2013; 張國云等, 2015; 龔建等, 2017)，其結(jié)果有助于篩選出金龜甲選擇、定位寄主的關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì)，為植物源引誘劑的開發(fā)提供重要的參考(Wolde-Hawariatetal., 2007; Chen and Li, 2011; 李曉峰等, 2020)。

本研究通過溶劑浸提法，提取6種寄主植物和1種非寄主植物銀杏的粗提物，將粗提物經(jīng)硅膠柱層析純化。采用觸角電位技術(shù)分別測試了華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜、小黃鰓金龜和福婆鰓金龜對不同植物粗提物的EAG反應(yīng)。本文關(guān)于金龜甲對不同植物提取物的電生理反應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果，將有助于鑒定金龜行為反應(yīng)的植物揮發(fā)性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試?yán)ハx

供試?yán)ハx包括華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜成蟲、小黃鰓金龜成蟲和福婆鰓金龜成蟲。均采自北京市朝陽區(qū)中國科學(xué)院園區(qū)內(nèi)，采集時間為每晚19 ∶00-21 ∶00。

1.1.2供試植物

因4種金龜甲對寄主的偏好略有不同，每種金龜甲的電生理實驗測試的植物也略有差異。根據(jù)各金龜甲的寄主種類，華北大黑鰓金龜實驗測試的植物包括銀杏GinkgobilobaL.、玉蘭MagnoliadenudataDesr.、柿樹DiospyroskakiL.f.、金銀木Loniceramaackii(Rupr.) Maxim.和榆樹UlmuspumilaL.；暗黑鰓金龜實驗測試的植物包括銀杏、柿樹、金銀木、榆樹和芙蓉葵HibiscusmoscheutosL.；小黃鰓金龜和福婆鰓金龜實驗測試的植物均為銀杏、金銀木、榆樹、芙蓉葵和丁香Syzygiumraromaticum(L.) Merrill & Perry。供試植株均采自中科院奧運村園區(qū)。

1.1.3試驗材料與儀器

材料：22 mL樣品瓶；萬分之一電子天平(AR224CN)；硅膠(200～300目)；HPLC正己烷購于CNW Technologies GmbH(Düsseldorf，德國)，無水硫酸鈉。

儀器：觸角電位儀(Syntech，Kirchzarten，德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1溶劑提取法采集植物揮發(fā)物

挑選健康植株，取5 g新鮮葉片，剪成碎片，裝進(jìn)22 mL樣品瓶中，加入HPLC級正己烷10 mL置于室內(nèi)浸提24 h，將浸提液轉(zhuǎn)移到干凈的樣品瓶中，并用正己烷清洗植物碎片兩次，合并提取液，濃縮后得到5 mL浸提液，用2 g無水硫酸鈉干燥24 h后過濾，將濾液置于冰箱中備用。

1.2.2硅膠柱層析法純化植物提取物

為了除去植物粗提物中的非揮發(fā)性的、極性大的物質(zhì)，利用硅膠柱層析方法對粗提物進(jìn)行純化。稱取200 mg的200～300目硅膠為固定相裝載到玻璃滴管里，然后將1 mL植物粗提物滴加到硅膠柱里，并以1 mL正己烷和4.2 mL正己烷/丙酮(5 ∶1)混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行分離。每2 mL收集一次，收集3個流分(F1、F2、F3)，預(yù)實驗結(jié)果表明，第一、三流分(F1，F(xiàn)3)EAG反應(yīng)較小，第二個流分(F2)的EAG活性強，所以選擇F2進(jìn)行觸角電位活性測試。

1.2.3觸角電位測定

測定所用的設(shè)備和技術(shù)參考李婭婭等(2018)和Chen等(2019)。充滿導(dǎo)電液(內(nèi)含750 mg/mL NaCl，35 mg/mL KCl，29 mg/mL CaCl2·2H2O，0.05%吐溫80的水溶液)的毛細(xì)管作為電極。將金龜甲的觸角切下，切口端與參比電極相連，觸角頂端套入記錄電極。利用鉑金絲連接電極和信號放大器，信號通過探針(EAG COMBI，Syntech，Kirchzarten，Germany)監(jiān)測，使用EAG 2000軟件(Syntech，Kirchzarten，Germany)記錄和分析數(shù)據(jù)。取10 μL待測樣品，均勻地滴在60 mm×5 mm濾紙條上，待溶劑揮發(fā)15 s后放入玻璃巴斯德管中，密閉平衡40 s后用于刺激。

使用植物粗提物和硅膠柱層析流分F2測試金龜?shù)挠|角電位反應(yīng)，HPLC正己烷作空白對照，校正樣品的EAG值。按隨機方式測試樣品，每次刺激時間為0.2 s，刺激間隔為2 min，濕潤空氣的流速為1 000 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分析所用數(shù)據(jù)均為樣品EAG反應(yīng)絕對值(absolute EAG response)，即將樣品EAG測量值減去空白對照測量值的平均值。利用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，金龜甲的EAG反應(yīng)絕對值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=7)，同一性別對不同測試樣品的EAG反應(yīng)采用Tukey-HSD檢驗比較差異顯著性(P<0.05)，不同性別對同種測試樣品的EAG反應(yīng)采用t-檢驗比較差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種金龜對植物粗提物的EAG反應(yīng)

2.1.1華北大黑鰓金龜對植物粗提物的EAG反應(yīng)

華北大黑鰓金龜雄、雌蟲對5種植物粗提物均有明顯EAG反應(yīng)如圖1所示。華北大黑鰓金龜雄蟲對不同植物粗提物的EAG反應(yīng)無差異；雌蟲對玉蘭粗提物的EAG反應(yīng)最大，其次是金銀木和榆樹，而對銀杏粗提物的EAG反應(yīng)最小，顯著低于玉蘭和金銀木。

圖1 華北大黑鰓金龜對不同植物粗提物的EAG反應(yīng)Fig.1 EAG responses of Holotrichia oblita to the different plant extracts注：不同小寫字母表示雌蟲對不同植物粗提物EAG反應(yīng)的差異顯著(P<0.05)。雄、雌蟲對同一種植物粗提物EAG反應(yīng)差異：“*”表示有顯著差異(P<0.05)；“**”表示有極顯著差異(P<0.01)，下同。Note: Different lower case letters indicated significant difference in EAG response of female beetles to different plant extracts (P<0.05). Differences in the EAG response of female and male to the same plant extract: “*” indicated significant difference (P<0.05); “**” indicated a very significant difference (P<0.01), the same below.

華北大黑鰓金龜雄蟲對5種植物粗提物的EAG反應(yīng)均比雌蟲小，除了對非寄主植物銀杏外，雄、雌蟲對4種寄主植物粗提物的EAG反應(yīng)均存在極顯著差異。

2.1.2暗黑鰓金龜對植物粗提物的EAG反應(yīng)

在對5種植物粗提物的EAG測試中(圖2)，暗黑鰓金龜雄、雌蟲對金銀木粗提物EAG反應(yīng)最大，對芙蓉葵粗提物EAG反應(yīng)最小。雌蟲對5種植物的EAG反應(yīng)無顯著性差異(P>0.05)。雄蟲對金銀木和榆樹粗提物的EAG反應(yīng)值顯著高于芙蓉葵粗提物。銀杏、柿樹和芙蓉葵粗提物所引起的EAG反應(yīng)無顯著性差異。雄、雌蟲對同種植物粗提物的EAG反應(yīng)均無顯著性差異。

圖2 暗黑鰓金龜對不同植物粗提物的EAG反應(yīng)Fig. 2 EAG responses of Holotrichia parallela to the different plant extracts注：不同大寫字母表示雄蟲對不同植物粗提物EAG反應(yīng)的差異顯著(P<0.05)，下同。Note: Different capital case letters indicated significant difference in EAG response of male beetles to different plant extracts (P<0.05), the same below.

2.1.3小黃鰓金龜對植物粗提物的EAG反應(yīng)

小黃鰓金龜雄、雌蟲對5種植物粗提物均有明顯的EAG反應(yīng)(圖3)。雄蟲對銀杏、金銀木、榆樹和丁香4種植物粗提物的EAG反應(yīng)均比芙蓉葵大，與芙蓉葵粗提物具有顯著性差異(P<0.05)，但4種粗提物間差異均不顯著(P>0.05)；雌蟲對金銀木和榆樹粗提物的EAG反應(yīng)較大，其次是銀杏和丁香，而對芙蓉葵的EAG反應(yīng)最小，金銀木、榆樹和芙蓉葵粗提物間有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 小黃鰓金龜對不同植物粗提物的EAG反應(yīng)Fig.3 EAG responses of Metabolus flavescens to the different plant extracts

雌蟲對5種植物粗提物的EAG反應(yīng)均比雄蟲大，但雄、雌蟲除了對芙蓉葵粗提物的EAG反應(yīng)達(dá)極顯著差異外，對其他4種植物粗提物EAG反應(yīng)差異均不顯著(P>0.05)。

2.1.4福婆鰓金龜對植物粗提物的EAG反應(yīng)

5種植物粗提物均能引起雄、雌蟲的EAG反應(yīng)(圖4)。雄、雌蟲對5種植物的EAG反應(yīng)無顯著差異(P>0.05)。雄、雌蟲對同種植物粗提物的EAG反應(yīng)也均無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 福婆鰓金龜對不同植物粗提物的EAG反應(yīng)Fig.4 EAG responses of Brahmina faldermanni to the different plant extracts

2.2 兩種金龜雌蟲對純化的F2流分的EAG反應(yīng)

2.2.1華北大黑鰓金龜雌蟲對純化的F2流分的EAG反應(yīng)

華北大黑鰓金龜雌蟲對5種植物粗提物的F2流分均有明顯的EAG反應(yīng)(圖5)。其中對金銀木F2流分的EAG反應(yīng)最大，其次是榆樹、柿樹和玉蘭，而對銀杏的EAG反應(yīng)最小，顯著低于金銀木的EAG反應(yīng)。

圖5 華北大黑鰓金龜雌蟲對純化的F2流分的EAG反應(yīng)Fig. 5 EAG responses of female Holotrichia oblita to Fraction 2 of the plant extracts

2.2.2暗黑鰓金龜雌蟲對純化的F2流分的EAG反應(yīng)

暗黑鰓金龜雌蟲對5種植物的F2流分的EAG反應(yīng)略有差異(圖6)，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖6 暗黑鰓金龜雌性對純化的F2流分的EAG反應(yīng)Fig.6 EAG responses of female Holotrichia parallela to Fraction 2 of the plant extracts

3 結(jié)論與討論

本研究測定了華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜、小黃鰓金龜和福婆鰓金龜對7種植物綠葉粗提物的EAG反應(yīng)。華北大黑鰓金龜雌蟲對玉蘭、柿樹、金銀木和榆樹粗提物產(chǎn)生的EAG反應(yīng)均極顯著大于雄蟲，小黃鰓金龜雌蟲對芙蓉葵粗提物的EAG反應(yīng)極顯著大于雄蟲，而其它兩種鰓金龜?shù)腅AG反應(yīng)均不存在性別間的差異。華北大黑鰓金龜雌蟲對所有植物粗提物的EAG反應(yīng)均大于雄蟲，可能是由于雄、雌觸角感器的數(shù)量、類型和分布的差異，導(dǎo)致觸角對植物揮發(fā)物的敏感性存在性別差異，也可能是與雄、雌金龜觸角感器的氣味結(jié)合蛋白的功能差異有關(guān)(孫凡等, 2007a; 杜瀟等, 2015; 劉玲等, 2015; 張國云等, 2016; 衣建坤, 2019)。

華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜、小黃鰓金龜和福婆鰓金龜在不同寄主植物上的分布和為害情況，說明金龜甲對不同的寄主植物存在偏好性，這種偏好性可能與植物揮發(fā)物的種類和含量有關(guān)；也有可能與金龜?shù)臓I養(yǎng)代謝有關(guān)(李婭婭等, 2018)。4種鰓金龜對共同寄主植物榆樹和金銀木粗提物的EAG反應(yīng)都比較大；華北大黑鰓金龜對玉蘭粗提物的EAG反應(yīng)偏大，但對玉蘭提取物的F2流分的EAG反應(yīng)偏小，這可能是因為玉蘭中的某些植物源揮發(fā)物因極性過大未被洗脫下來。暗黑鰓金龜偏好榆樹，且對其粗提物的EAG反應(yīng)也較大，對芙蓉葵粗提物的EAG反應(yīng)最小，可能是因為芙蓉葵產(chǎn)生的植物源揮發(fā)物的含量比其他寄主植物小。小黃鰓金龜偏好金銀木、榆樹和丁香，對這些植物粗提物的EAG反應(yīng)也較大。福婆鰓金龜?shù)奶镩g發(fā)生量較少，對植物粗提物的EAG反應(yīng)也小于其他金龜甲，可能是其嗅覺敏感性較低。

華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜、小黃鰓金龜和福婆鰓金龜對銀杏、玉蘭、柿樹、金銀木、榆樹、芙蓉葵、丁香的頂空揮發(fā)物有明顯的EAG反應(yīng)(李婭婭等, 2018)。華北大黑鰓金龜雄、雌蟲對植物粗提物的EAG反應(yīng)數(shù)值范圍分別為(0.40～0.66 mV)、(0.71～1.72 mV)，要明顯高于植物頂空揮發(fā)物(雄蟲：0.2～0.34 mV, 雌蟲：0.3～0.72 mV)，說明溶劑提取法比動態(tài)頂空吸附法提取更多的活性揮發(fā)物；相反，福婆鰓金龜雄、雌蟲對植物頂空揮發(fā)物的EAG反應(yīng)數(shù)值范圍分別為(0.76～2.53 mV)、(0.76～2.99 mV)，要低于植物粗提物(0.73～0.94 mV, 0.76～0.88 mV)，說明這些寄主植物能釋放易揮發(fā)的活性揮發(fā)物。而暗黑鰓金龜和小黃鰓金龜雄、雌蟲對不同植物的粗提物的EAG反應(yīng)數(shù)值范圍(暗黑鰓金龜雄蟲：1.22～2.92 mV, 雌蟲：1.47～2.82 mV; 小黃鰓金龜雄蟲：0.84～2.18 mV, 雌蟲：1.34～2.31 mV)與頂空揮發(fā)物(暗黑鰓金龜雄蟲：0.99～2.62 mV, 雌蟲：1.04～2.67 mV; 小黃鰓金龜雄蟲：0.59～1.19 mV, 雌蟲：0.69～1.66 mV)基本一致，說明溶劑提取法和動態(tài)頂空吸附法都可以提取到活性揮發(fā)物。華北大黑鰓金龜雌蟲對植物粗提物F2流分(0.72～1.64 mV)的EAG反應(yīng)數(shù)值范圍明顯大于植物頂空揮發(fā)物。雖然暗黑鰓金龜雌蟲對植物粗提物F2流分的EAG反應(yīng)數(shù)值范圍(1.34～2.04 mV)小于F2流分植物頂空揮發(fā)物，但是都在1.0 mV以上，完全可以進(jìn)行氣相色譜-觸角電位(Gas chromatography-Electroantennography，GC-EAD)分析。因此，可以采用溶劑提取法提取植物揮發(fā)物，經(jīng)硅膠柱層析純化得到活性流分，直接進(jìn)行氣相色譜-觸角電位測試。和動態(tài)頂空吸附法相比，溶劑提取法需要的樣品量少，操作簡單，用時短。本研究探索了一種新的植物揮發(fā)物提取方法，為后續(xù)植物揮發(fā)物引誘活性成分鑒定，開發(fā)金龜甲引誘劑打下了良好的基礎(chǔ)。

昆蟲對某些植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng)大小與行為反應(yīng)相一致。如大豆揮發(fā)物1-辛烯-3-醇能引起中華弧麗金龜Popilliaquadriguttata雌成蟲較強的EAG反應(yīng)，且對雌成蟲有顯著的引誘作用(徐偉等, 2018)。桃樹揮發(fā)物中的反-3-己烯醇和順-3-己烯醇能引起東方絹金龜Maladeraorientalis雌成蟲的觸角電位反應(yīng)，且有顯著的吸引作用(張萌萌等, 2020)。東北大黑鰓金龜雌、雄成蟲對綠葉氣味中的反-2-己烯醛均有較強的的EAG反應(yīng)，也有定向作用(孫凡等, 2007a)。銅綠麗金龜Anomalacorpulenta對水楊酸甲酯、順-3-己烯乙酸酯和石竹烯均有較強的EAG反應(yīng)，且行為選擇反應(yīng)明顯(鞠倩等, 2016)。當(dāng)然，也有一些植物揮發(fā)物引起的兩種反應(yīng)則可能表現(xiàn)為不相關(guān)甚至負(fù)相關(guān)(郭線茹等, 2003)。如非寄主植物揮發(fā)物2-苯乙醇能引起中華弧麗金龜?shù)男鄢上x較強的EAG反應(yīng)；但行為生測結(jié)果表明，2-苯乙醇對中華弧麗金龜雄成蟲既無引誘作用，也無驅(qū)避作用(徐偉等, 2018)。因此不能僅依據(jù)EAG反應(yīng)推測行為反應(yīng)，研究金龜對活性物質(zhì)的反應(yīng)，還需進(jìn)行田間試驗進(jìn)一步驗證和篩選。