砂質(zhì)潮土高效溶磷菌的篩選鑒定、條件優(yōu)化及應(yīng)用

魏暢 戚秀秀 吳越 劉曉丹 王祎 姜瑛 柳海濤

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450000；2. 山東省土壤肥料總站，濟(jì)南 250100）

磷素是作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一種重要的營(yíng)養(yǎng)元素，它能夠以多種方式參與植物體內(nèi)各種代謝過(guò)程，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育［1］。我國(guó)土壤中的大部分磷以固定態(tài)形式存在，導(dǎo)致土壤磷的有效利用率很低，影響作物生長(zhǎng)。近幾年磷肥的大量施用雖然在一定程度上滿足了作物需求，但同時(shí)也造成了極大的資源浪費(fèi)并引發(fā)了一系列環(huán)境污染問(wèn)題。在當(dāng)前我國(guó)“減肥增效”的背景下，在減少磷肥投入量的同時(shí)又要確保糧食穩(wěn)定高產(chǎn)，如何提高土壤中磷的利用率便成為土壤元素研究中亟待解決的問(wèn)題。

土壤中磷的分級(jí)可追溯到20世紀(jì)前期［2］，直至20世紀(jì)50年代才形成了較為完整的測(cè)定體系，經(jīng)學(xué)者的不斷研究，土壤磷的分級(jí)方法也在不斷完善。研究土壤中磷素的構(gòu)成可有效揭示土壤中的磷素形態(tài)以及其與環(huán)境因素的關(guān)系，對(duì)提高磷素利用率、“減肥增效”及緩解污染具有重要意義。

前人研究表明，土壤中存在著大量的溶磷菌，這些根際溶磷菌能夠?qū)⑼寥乐须y溶性磷轉(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的可溶性磷，從而提高磷素的利用率，促進(jìn)作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，提高作物產(chǎn)量；同時(shí)還能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力［3-5］。盛榮等［6］的研究亦表明土壤中溶磷微生物能夠使難溶性的鈣磷、鋁磷、鐵磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷。楊順等［7］研究發(fā)現(xiàn)，土壤中溶磷菌活化磷素的同時(shí)有酸性物質(zhì)的產(chǎn)生。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)土壤中施用溶磷菌可有效溶解土壤中的難溶性磷，促進(jìn)植物對(duì)磷素的吸收［8］，激發(fā)玉米的生長(zhǎng)活性［5］。可見(jiàn)，利用溶磷菌的生物降解作用增加土壤有效磷含量在提高土壤磷利用率方面有著很大的發(fā)展前景。

不同類型土壤受土壤母質(zhì)、氣候條件、植被類型及種植制度等因素影響，其微生物群落組成有著較大的區(qū)別［6，9］，土壤中的溶磷微生物在種類、數(shù)量和溶磷能力同樣有著很大差別。溶磷微生物主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌，有些微生物分解和轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)磷化合物的能力較強(qiáng)，有些分解和轉(zhuǎn)化有機(jī)磷化合物的能力較強(qiáng)，有些是既可以分解有機(jī)磷化合物也可以分解無(wú)機(jī)磷化合物［4，10］。如不同土壤類型中的溶磷微生物數(shù)量通常表現(xiàn)為黑鈣土＞黃棕壤＞白土＞紅壤＞ 磚紅壤＞瓦堿土，在黑鈣土中溶磷菌以芽孢桿菌和假單胞桿菌為主，而黃棕壤和紅壤中的溶磷菌種類多樣［11］。不同耕作類型土壤上，農(nóng)田土壤有機(jī)溶磷菌以芽孢桿菌屬為主，林地和菜地則主要是假單胞桿菌屬［12］。

河南省作為我國(guó)的產(chǎn)糧大省，主要土壤類型之一為砂質(zhì)潮土，磷素容易被固定形成難溶性化合物造成養(yǎng)分有效性降低，導(dǎo)致小麥很難直接吸收利用，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前石灰性土壤特別是砂質(zhì)潮土上關(guān)于溶磷微生物的研究和應(yīng)用較少。本研究從長(zhǎng)勢(shì)較好的小麥根際砂質(zhì)潮土中篩選出一株根際高效溶磷促生菌，加以鑒定，并研究不同培養(yǎng)條件下菌株的溶磷量，獲得最適溶磷培養(yǎng)條件，設(shè)置小麥盆栽實(shí)驗(yàn)探究其對(duì)土壤磷素形態(tài)的影響，并驗(yàn)證其在砂質(zhì)潮土上的促生效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤取自農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)小麥玉米輪作營(yíng)養(yǎng)與施肥科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站（鄭州市，新鄭航空港區(qū)），選取0-20 cm表層土壤。其土壤基本理化性狀為：有機(jī)質(zhì)8.89 g/kg、堿解氮30.02 mg/kg、全磷2.95 g/kg、速效磷31.2 mg/kg、全鉀19.60 g/kg、速效鉀50.39 mg/kg、pH 7.37。

1.2 方法

1.2.1 供試土壤基本理化性狀及小麥植株的測(cè)定方法 供試土壤基本理化性質(zhì)（有機(jī)質(zhì)、堿解氮、全磷、速效磷、全鉀、速效鉀、pH）和盆栽小麥植株各指標(biāo)（干重、株高、全氮、全磷和全鉀）的測(cè)定方法參考《土壤農(nóng)化分析》（第三版）［13］。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 實(shí)驗(yàn)所選用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基以及PKO培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基則向?qū)?yīng)液體培養(yǎng)基中添加15-20 g瓊脂。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2。121℃滅菌30 min。

PKO液體培養(yǎng)基（無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基）：氯化鈉0.3 g，葡萄糖10 g，氯化鉀0.3 g，磷酸三鈣5 g，硫酸銨0.5 g，七水合硫酸鎂0.3 g，硫酸錳0.03 g，七水合硫酸亞鐵0.03 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.0-7.2，121℃滅菌30 min。

1.2.3 溶磷菌株的篩選 將供試土壤過(guò)篩處理，稱取10 g處理后的供試土壤置于250 mL三角瓶中，加入90 mL無(wú)菌水，在搖床上振蕩20 min轉(zhuǎn)速為180 r/min、溫度為30℃，振蕩后取出靜置10 min，所得液體為土壤菌懸液。在無(wú)菌操作臺(tái)上用無(wú)菌水稀釋土壤菌懸液，取合適稀釋度的土壤菌懸液涂于PKO平板上，將此培養(yǎng)基置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待PKO固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)透明圈菌落即為溶磷菌，將溶磷菌純化后保存于4℃冰箱保存。

1.2.4 溶磷菌株溶磷能力的測(cè)定［14］將篩選得到的溶磷細(xì)菌進(jìn)行溶磷能力的定量測(cè)定，將純化后的溶磷菌接種于盛有50 mL的PKO液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫?fù)u床上振蕩，溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間為96 h，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，在溫度為4℃、轉(zhuǎn)速為10 000 r/min條件下離心15 min，離心后收集上清液，用鉬藍(lán)比色法測(cè)定上清液中有效磷的含量。

1.2.5 菌株W6的形態(tài)、生理生化及 16S rDNA 分子學(xué)鑒定

1.2.5.1 菌株W6的形態(tài)及生理生化指標(biāo)測(cè)定 觀察菌落形態(tài)特征，對(duì)菌株W6進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其個(gè)體形態(tài)，并且進(jìn)行生理生化指標(biāo)鑒定［15］。

1.2.5.2 菌株W6的分子學(xué)鑒定 用SDS-CTAB［16］提取總基因組DNA，采用16S rDNA通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 進(jìn) 行 16S rDNA引物 PCR 擴(kuò)增［17］。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 0.7% 瓊脂糖凝膠電泳后回收純化測(cè)序（北京美億美生物技術(shù)有限公司）。在GenBank中Blast搜索同源序列與獲得的16S rDNA序列比較，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6 培養(yǎng)條件對(duì)菌株W6溶磷量的影響

1.2.6.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株W6溶磷量的影響 將菌株W6按1%（V/V）的接種量接種在PKO培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)（180 r/min，30℃恒溫，下同），分別在10、15、20、24、36、44和56 h動(dòng)態(tài)取樣（用鉬藍(lán)比色法測(cè)定有效磷含量，每個(gè)處理重復(fù)3次，下同）。

1.2.6.2 不同碳源對(duì)菌株W6溶磷量的影響 設(shè)置培養(yǎng)基碳源分別為葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖和麥芽糖，保證各培養(yǎng)基含碳量相同，按1%（V/V）的接種量接種菌株W6后，置于搖床培養(yǎng)24 h后采樣。

1.2.6.3 不同氮源對(duì)菌株W6溶磷量的影響 設(shè)置培養(yǎng)基氮源分別為硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、谷氨酸、蛋白胨，保證各培養(yǎng)基含氮量相同，按1%（V/V）的接種量接種菌株W6后，置于搖床培養(yǎng)24 h后采樣。

1.2.6.4 不同初始 pH 對(duì)菌株W6溶磷量的影響 設(shè)置培養(yǎng)基初始pH分別為4、5、6、7、8、9及10，按1%（V/V）的接種量接種菌株W6在PKO培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)，置于搖床培養(yǎng)24 h后采樣。

1.2.6.5 不同通氣量對(duì)菌株W6溶磷量的影響 設(shè)置培養(yǎng)液裝液量分別為25 mL、50 mL、75 mL、100 mL和150 mL 裝于 250 mL 的三角瓶中，按1%（V/V）的接種量接種菌株W6在PKO培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)，置于搖床培養(yǎng)24 h后采樣。

1.2.7 小麥促生盆栽實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 種子催芽 小麥品種選用“鄭麥9023”，將小麥種子浸入20%雙氧水中消毒20 min，消毒后取出小麥種子用無(wú)菌水沖洗多次，在25℃條件下置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中催芽2 d，選取發(fā)芽較好，長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥種芽備用。

1.2.7.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 接菌處理：將菌株W6接種于LB培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床中于30℃在180 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將菌液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中于10 000 r/min離心10 min，用無(wú)菌水重懸底部菌體3次，此時(shí)細(xì)菌懸液濃度約為108CFU/mL，備用。

選取自然條件下0-20 cm土層的新鮮砂質(zhì)潮土，將土壤過(guò)2 mm篩處理，用塑料盆每盆盛新鮮土壤700 g，按田間持水量的60%調(diào)節(jié)土壤含水量，供試菌株接種量為106CFU/g干土，設(shè)置W6接種處理和對(duì)照處理（CK，接種等量滅活的W6菌株）。然后種植小麥種芽，30 d后采樣。

1.2.7.3 土壤磷素分級(jí) 根據(jù)改進(jìn)后的Hedley磷素分級(jí)方法［18］，將土壤磷素分為9個(gè)形態(tài)，分別表現(xiàn)為：水溶態(tài)磷（H2O-P）、碳酸氫鈉提取態(tài)磷（NaHCO3-Pi；NaHCO3-Po）、氫氧化鈉提取態(tài)磷（NaOH-Pi；NaOH-Po）、稀鹽酸提取態(tài)磷（HCl-P）；濃鹽酸提取態(tài)磷（濃HCl-Pi；濃HCl-Po）和濃硫酸提取態(tài)磷（濃H2SO4-P）。

該方法將土壤中的磷素主要分為五大類，包括有機(jī)和無(wú)機(jī)部分，其中Po代表有機(jī)態(tài)磷，Pi代表無(wú)機(jī)態(tài)磷。H2O-P的特點(diǎn)是充分有效性，而這部分磷占據(jù)了土壤活性磷的大量比重；NaHCO3-P包括有機(jī)與無(wú)機(jī)部分，無(wú)機(jī)部分主要是指吸附在土壤表面的磷素而有機(jī)部分則為易于礦化的有機(jī)磷；NaOH-P是指通過(guò)化學(xué)吸附作用而吸附于鐵、鋁等金屬表面的磷素；HCl-P（石灰性磷）主要存在于石灰性土壤中，難溶磷酸鹽的比例甚至高達(dá)60%-80%。

1.2.7.4 植株樣品測(cè)定 用根系掃描儀（LA1600+scanner，Canada）掃描所采集的小麥根系，然后用根系分析軟件（Winrhizo2003b，Canada）對(duì)根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)、根直徑進(jìn)行分析，并測(cè)定植株全氮磷鉀含量。

2 結(jié)果

2.1 高效溶磷菌株的篩選

通過(guò)定性測(cè)定，共分離出5株具有溶磷能力的菌株，分別命名為W2、W4、W6、W7和W11。各菌株的溶磷量測(cè)定結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過(guò)4 d培養(yǎng)，W6菌株溶磷量最大，達(dá)到447 mg/L，溶溶磷酸三鈣達(dá)到8.9%，顯著高于篩選出的其他菌株（P＜0.05），因此選取菌株W6為最佳溶磷菌株。

2.2 菌株W6的鑒定

2.2.1 菌株W6的形態(tài)及生理生化指標(biāo)鑒定 對(duì)菌株W6進(jìn)行形態(tài)及生理生化鑒定，可見(jiàn)W6菌落呈同心圓狀，不透明，表面粗糙，不濕潤(rùn)，產(chǎn)芽孢，桿狀（圖2-A、2-B）。革蘭氏陽(yáng)性（圖2-C），兼性厭氧，化能異養(yǎng)，接觸酶陽(yáng)性，M.R實(shí)驗(yàn)陰性，VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，淀粉水解陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陰性（表1）。

圖2 菌株 W6 的形態(tài)觀察及革蘭氏染色Fig.2 Morphological observation and Gram staining of strain W6

表1 W6菌株的生理生化特性Table 1 Physiological characteristics of strain W6

2.2.2 菌株W6的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)GenBank 中已登錄的核苷酸序列與獲得的16S rDNA 的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菌株W6與Bacillus flexus IFO15715（AB021185）同源性為100%，用鄰接法（N-J）構(gòu)建菌株W6的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。結(jié)合菌株W6的形態(tài)及生理生化特征，鑒定菌株W6為彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus），將其序列上傳至NCBI，獲得登錄號(hào)KX267760。

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)W6菌株溶磷量的影響

圖3 基于菌株W6和相關(guān)菌株的16S rDNA 序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree that based on 16S rDNA sequences of strain W6 and related strains

2.3.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株溶磷量的影響 W6菌株在培養(yǎng)10 h時(shí)間段內(nèi)磷濃度幾乎為零（圖4），可能是因?yàn)榫暝谂囵B(yǎng)10 h時(shí)間段內(nèi)生長(zhǎng)較緩慢。培養(yǎng)10 h以后開(kāi)始出現(xiàn)溶磷作用，在15 h后磷濃度迅速升高，在24 h達(dá)到最大溶磷率，磷濃度達(dá)到140 mg/L，說(shuō)明菌株在培養(yǎng)10 h后菌株生長(zhǎng)較快且活性高。菌株在培養(yǎng)24 h以后隨著時(shí)間的增加磷濃度上升變緩。

2.3.2 不同碳源對(duì)菌株溶磷量的影響 不同碳源條件下，W6菌株的溶磷量具有顯著性差異（圖5）。在本實(shí)驗(yàn)所做的7種不同碳源中，W6菌株所表現(xiàn)出來(lái)的溶磷量從大到小依次為：木糖＞甘露醇＞麥芽糖＞蔗糖＞葡萄糖＞乳糖＞果糖。其中以木糖為碳源時(shí)磷濃度最高達(dá)到為368 mg/L，溶磷量顯著高于另外6種碳源（P＜0.05），其次為甘露醇，碳源為果糖時(shí)磷濃度最低為1 mg/L。PKO培養(yǎng)基以木糖為碳源時(shí)W6菌株生長(zhǎng)較旺盛，推薦木糖為W6菌株最佳碳源。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)W6菌株溶磷量的影響Fig.4 Effect of different incubation time on the phosphate-solublizing efficiency of strain W6

圖5 不同碳源對(duì)W6菌株溶磷量的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on the phosphatesolublizing efficiency of strain W6

2.3.3 不同氮源對(duì)菌株溶磷量的影響 PKO培養(yǎng)基在不同的氮源條件下，W6溶磷菌的溶磷量也有顯著性差異（圖6）。當(dāng)以硝酸鉀、蛋白胨為氮源時(shí)，磷濃度達(dá)到360 mg/L、352 mg/L，兩者間差異不顯著，但均顯著高于其他氮源間產(chǎn)物中磷含量；當(dāng)以谷氨酸為氮源時(shí)磷濃度最低80 mg/L。本實(shí)驗(yàn)所做的7種不同氮源中，W6菌株所表現(xiàn)出來(lái)的溶磷量從小到大依次為 ：谷氨酸 ＜ 硝酸銨 ＜ 硫酸銨 ＜ 酵母粉 ＜ 蛋白胨 ＜ 硝酸鉀。由此推薦硝酸鉀為W6的最佳氮源。

圖6 不同氮源對(duì)W6菌株溶磷量的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on the phosphate-solublizing efficiency of strain W6

2.3.4 不同pH對(duì)菌株溶磷量的影響 PKO培養(yǎng)基在不同的pH條件下，W6溶磷菌的溶磷量有顯著性差異（圖7）。當(dāng)培養(yǎng)基pH在4.0-6.0之間時(shí)隨著酸度的減小磷濃度逐漸增大，當(dāng)pH在6.0時(shí)磷濃度達(dá)到最大值為252 mg/L，當(dāng)pH值大于6.0時(shí)隨著pH值的增加磷濃度逐漸減小，當(dāng)pH達(dá)到10時(shí)磷濃度下降到幾乎為0。因此，推薦6.0為W6溶磷菌的最佳pH值。

圖7 不同pH對(duì)W6菌株溶磷量的影響Fig.7 Effect of different pH on the phosphate-solublizing efficiency of strain W6

2.3.5 不同裝液量對(duì)菌株溶磷量的影響 不同裝液量條件下，W6溶磷菌的溶磷量有顯著性差異（圖8）。裝液量在25 mL-75 mL條件下隨著裝液量的增加磷濃度逐漸增加，當(dāng)裝液量為75 mL時(shí)磷濃度達(dá)到最大為268 mg/L，當(dāng)裝液量超過(guò)75 mL時(shí)隨著裝液量的增加磷濃度逐漸降低。由此說(shuō)明：隨著裝液量的增加W6溶磷菌的通氣量逐漸減小，當(dāng)裝液量為75 mL/250 mL時(shí)所對(duì)應(yīng)的通氣量為W6溶磷菌的最佳通氣量。

2.4 接種菌株W6對(duì)小麥的盆栽促生實(shí)驗(yàn)

2.4.1 土壤不同形態(tài)磷素分布變化 將兩種不同處理對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)（表2），接種菌株W6的土壤中的H2O-P、NaHCO3-Po、NaHCO3-Pi含量分別增加了127.3%、80.0%、54.5%，其中H2O-Pi、NaHCO3-Po呈現(xiàn)極顯著性差異。而W6處理下的土壤HCl-P、濃HCl-Po、濃HCl-Pi、濃H2SO4-P含量則分別降低了10.9%、23.0%、42.1%和33.3%，其中濃HCl-Pi和HCl-Po含量均呈現(xiàn)顯著性差異。NaOH-Po和NaOHPi含量分別增加了11.8%和20.0%，差異不顯著。接種菌株W6能夠增加土壤有效形態(tài)磷素的含量并降低難溶性磷含量，從而促進(jìn)了難溶性磷向有效態(tài)磷素的轉(zhuǎn)化，提高對(duì)植物有效態(tài)磷素含量，促進(jìn)植物的吸收。

圖8 不同裝液量對(duì)W6菌株溶磷量的影響Fig. 8 Effect of different liquid volume on the phospho-rus efficiency of strain W6

表2 接種菌株W6對(duì)土壤磷素形態(tài)的影響Table 2 Effects of innoculated strain W6 on the forms of phosphorus

2.4.2 接種菌株W6對(duì)小麥根系的影響 與CK處理相比較（表3），接種 W6菌株的根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)、根直徑分別顯著增加了66.8%、57.0%、50.0%、13.6%和9.1%，說(shuō)明施加菌株W6對(duì)小麥根系的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。

2.4.3 接種菌株W6對(duì)小麥植株的影響 與CK處理相比較，接種菌株W6后，小麥的干重，株高、全氮、全磷及全鉀含量分別顯著增加了70.5%、32.1%、24.7%、94.2%和34.4%，其中干重、全磷和全鉀分別達(dá)到了極顯著水平（表4），表明接種菌株W6能夠增加小麥干物質(zhì)積累量及養(yǎng)分含量，提高小麥對(duì)養(yǎng)分的吸收以及利用效率，從而促進(jìn)小麥植株生長(zhǎng)。

表3 接種菌株W6對(duì)小麥根系的影響Table 3 Effects of strain W6 on the root system of wheat

表4 接種菌株W6對(duì)小麥植株的影響Table 4 Effects of strain W6 on wheat

3 討論

土壤中能夠分解和轉(zhuǎn)化難溶性磷化合物的溶磷菌的種類和數(shù)量很多也很復(fù)雜，并且受到根際微域環(huán)境的影響而呈現(xiàn)明顯的根際效應(yīng)［4，19］。一般認(rèn)為，溶磷真菌在數(shù)量上明顯少于溶磷細(xì)菌，真菌溶磷能力通常比細(xì)菌強(qiáng)［20-21］。Oliveira 等［22］從玉米根際土壤中分離出了45 株高效溶磷菌，通過(guò)研究其溶磷效率發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌（主要為芽孢桿菌屬和伯克氏菌屬）對(duì)磷酸鈣的溶解能力較真菌強(qiáng)，而真菌則對(duì)磷酸鋁、植酸和卵磷脂具有較強(qiáng)的溶解能力。Yadav等［23］從印度干旱和半干旱地區(qū)土壤中分離出七株真 菌（Aspergillus、Emmericella 和 Penicillium 屬 ），其24 h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)水解甘油磷酸鈉和植酸鈣鎂的能力分別達(dá) 到 2.12 μg/min·g-4.85 μg/min·g和 0.92 μg/min·g-2.10 μg/min·g。Pérez 等［24］分 離 得 到了幾株具有不同磷酸鈣溶解活性的異養(yǎng)菌，其中最高效的菌株在液體培養(yǎng)下對(duì)磷酸鈣溶解能力達(dá)到近0.05 mg/min·mL。Acevedo在哥倫比亞油棕櫚樹(shù)分離的真菌PSF-25通過(guò)3 d培養(yǎng)對(duì)磷酸三鈣溶解率達(dá)到82%，細(xì)菌PSB-08培養(yǎng)1 d后對(duì)磷酸三鈣溶解率達(dá)到54%［25］。伯克氏菌屬菌株B5在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d 后，溶解了58.5%的磷酸三鈣［22］。且由于土壤環(huán)境的差異，不同種植作物下的溶磷菌類型亦存在差異［26］。

芽孢桿菌作為土壤微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)群種之一，具有抗逆性強(qiáng)且耐存儲(chǔ)等特點(diǎn)，有益于其在土壤環(huán)境中的生存與定殖［27-28］，土壤中具有溶磷功能的芽孢桿菌被廣泛研究。Tao 等［29］從土壤中分離出10 株具有溶磷活性的蠟狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其在培養(yǎng)條件下對(duì)有機(jī)磷礦化活性達(dá)13.8 μg/mL-62.8 μg/mL。錢婷等［30］分離出的巨大芽抱桿菌ZS-3無(wú)機(jī)磷分解能力較強(qiáng)，其溶磷能力達(dá)188 μg/mL。

華北黃泛平原的主要土壤類型是潮土，土壤母質(zhì)為近代河流沖積物［31］，其砂質(zhì)潮土結(jié)構(gòu)疏松，保肥保水性能差［32］，是河南省主要中低產(chǎn)土壤之一。磷肥施入到土壤后，磷素易被固定，利用率低［1，33］。潮土母質(zhì)起源于西北黃土高原，多系富含碳酸鈣的黃土性沉積物，導(dǎo)致土壤有效磷虧缺，土壤缺磷已成為作物產(chǎn)量的限制因素。本實(shí)驗(yàn)從砂質(zhì)潮土小麥玉米輪作區(qū)土壤中分離得到的芽孢桿菌（Bacillus flexus）W6顯示了高效的溶磷效果，培養(yǎng)4 d后溶溶磷酸三鈣達(dá)到8.9%，在石灰含量較高的潮土中有助于土壤固定態(tài)磷的解吸，為作物提供有效磷。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下，W6最大溶磷量達(dá)到447 mg/L，與同樣以磷酸三鈣為磷源培養(yǎng)下枯草芽孢桿菌溶磷量（449.1 mg/L）相似［34］。萬(wàn)璐等［35］在以磷酸鈣為唯一磷源的液體培養(yǎng)基接種溶磷細(xì)菌ZB0211，培養(yǎng)3 d后菌株對(duì)磷的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)8.0%，其溶磷效率與本研究相似。

土壤接種高效溶磷微生物可以顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)或提高作物產(chǎn)量與養(yǎng)分吸收。施用溶磷菌劑可以提高土壤氮磷含量，充足的氮磷營(yíng)養(yǎng)使小麥根系碳同化作用更旺盛，碳水化合物積累更多，提高小麥的抗逆性，改善產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)增加產(chǎn)量［36］。萬(wàn)兵兵等［37］的研究表明，在盆栽條件下種植玉米并接種短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus），與對(duì)照相比，玉米植株干重增加120.08%，植株磷含量增加66.33%。花生盆栽實(shí)驗(yàn)中貪噬菌屬（Variovorax sp.）的接種使花生根系伸長(zhǎng)變粗，土壤中有效磷含量提升了18.14%，花生全磷含量提高了171.43%，地上部鮮重增加了44.78%［38］，彎曲芽胞桿菌（Bacillus flexus）的接種同樣能顯著提高土壤中速效磷的含量，提高花生的生物量［39］。小麥接種草酸青霉菌屬（Penicillium oxalicum）C2，幼苗在生長(zhǎng)28 d后，相比未接菌的植株，小麥根長(zhǎng)增加了31.25%，根重增加了28.33%，生物量增加了16.67%，小麥根中磷濃度增加了46%，莖中磷濃度增加了28.02%，土壤中的可溶磷含量占土壤全磷比例增加了1.77%［40］。姜瑛等［38］報(bào)道，接種固氮解磷菌JX14的花生，根系總長(zhǎng)提高了1.61倍，鮮重、株高分別增加44.78%、14.10%。本研究表明，接種 W6菌株的小麥生長(zhǎng)30 d后，根長(zhǎng)、根尖數(shù)、根直徑分別增加了66.8%、13.6%、9.1%，小麥的干重，株高、全磷含量分別顯著增加了70.5%、32.1%和94.2%，促生效果顯著，可能是因?yàn)樯百|(zhì)潮土養(yǎng)分含量低，CK處理生長(zhǎng)緩慢，W6菌的加入使得土壤氮磷含量增加導(dǎo)致小麥幼苗增長(zhǎng)迅速。

本研究運(yùn)用Hedley法對(duì)接W6菌以及不接菌的土壤進(jìn)行磷素分級(jí)后發(fā)現(xiàn)，在接種菌株后的土壤HCl-P和濃H2SO4-P的含量降低而H2O-P、NaHCO3-P、NaOH-P等形態(tài)的磷素含量升高，表明菌株W6能夠?qū)⑸百|(zhì)潮土中的難溶性磷素轉(zhuǎn)化為有效性較高的磷素。微生物降解難溶性無(wú)機(jī)磷主要是由于：（1）土壤微生物在其代謝過(guò)程中可分泌多種有機(jī)酸，如草酸、琥珀酸、延胡索酸、羥基乙酸、乳酸和檸檬酸等，一方面降低了培養(yǎng)介質(zhì)的pH ；另一方面，有機(jī)酸與Ca2+、Fe3+、Fe2+和Al3+等離子螯合而使難溶性磷酸鹽溶解。（2）微生物在其代謝過(guò)程中產(chǎn)生CO2或分泌質(zhì)子，使培養(yǎng)介質(zhì)的酸度提高，從而促進(jìn)磷礦物溶解［10］。研究者認(rèn)為，微生物產(chǎn)生了低分子量有機(jī)酸，如草酸、檸檬酸等，較為明顯的特征是培養(yǎng)基pH明顯下降，這些有機(jī)酸能增強(qiáng)可變電荷礦物的溶解，從而釋放吸附的磷。溶磷微生物溶解難溶性磷酸鹽是一個(gè)長(zhǎng)期的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，微生物不斷地生長(zhǎng)、繁殖，并分泌有機(jī)酸和磷酸酶，使難溶磷不斷地釋放出來(lái)。當(dāng)微生物死亡后，微生物機(jī)體中的有機(jī)磷又重新以有效磷形式被釋放出來(lái)，不斷提供可被吸收利用的磷［10］。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從砂質(zhì)潮土小麥根際土壤中篩選到一株優(yōu)質(zhì)高效溶磷菌株W6，培養(yǎng)4 d后該菌株的溶磷量為 447 mg/L（磷源 5 000 mg/L Ca3（PO4）2）。通過(guò)傳統(tǒng)的細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，鑒定W6為彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）。該彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）菌體的最佳培養(yǎng)時(shí)間20 h，最佳pH為6.0，最佳裝液量為75 mL/250 mL，最佳碳源為木糖，最佳氮源為硝酸鉀。該菌株能夠增加土壤中水溶態(tài)磷、碳酸氫鈉態(tài)磷等有效態(tài)磷素的含量，降低難溶性態(tài)磷素含量，從而促進(jìn)磷素形態(tài)由難溶性向有效性進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高小麥對(duì)磷素的吸收及利用效率，促進(jìn)了小麥根系的生長(zhǎng)發(fā)育，使小麥植株長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照。