哺乳動物m6A與生長發(fā)育相關(guān)生物學(xué)功能研究進(jìn)展

薛翔瀾 丁洋洋 劉悅 李曉波 蔣琳 何曉紅 馬月輝 趙倩君

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650000）

RNA修飾方式眾多，普遍存在于真核生物中，目前已發(fā)現(xiàn)100多種修飾方式，這些修飾對RNA功能和遺傳信息多樣性等方面起到重要作用。mRNA的主要修飾方式包括N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）、N7-甲基鳥嘌呤（N7-methylguanosine，m7G）和假尿嘧啶（pseudouridine）等。其中m6A作為真核信使RNA（Messenger RNA，mRNAs）中最豐富的修飾，在許多生物過程中發(fā)揮重要作用。此外，m6A在轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosome RNA、rRNA）中也具有一定的作用，具有多種生物調(diào)節(jié)功能。多項(xiàng)研究表明，m6A參與RNA的剪接、轉(zhuǎn)錄、加工、出核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、降解，對胚胎發(fā)育、脂肪生成、肌肉發(fā)育和疾病等生物學(xué)過程具有重要作用［1-2］。

20世紀(jì)中期，在細(xì)菌DNA研究過程中首次發(fā)現(xiàn)m6A，20世紀(jì)60年代通過RNA大腸桿菌實(shí)驗(yàn)首次分離出m6A，并在細(xì)菌、小鼠、兔子、小麥、病毒等中相繼檢測出m6A［3-6］。20世紀(jì)70年代科研人員利用發(fā)現(xiàn)的真核生物Poly（A）結(jié)構(gòu)研究RNA甲基化在癌細(xì)胞中的情況顯示，堿基和核糖中均存在甲基化，且甲基化程度均較高［7］。20世紀(jì)90年代，研究發(fā)現(xiàn)m6A的堿基修飾參與調(diào)控細(xì)胞周期，后因缺乏對mRNA上單個m6A修飾位點(diǎn)的鑒定方法，m6A少有研究。近年，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使m6A修飾位點(diǎn)的鑒定得以實(shí)現(xiàn)［8］，m6A重新進(jìn)入科學(xué)家們的視野中，m6A甲基化修飾調(diào)控及生物學(xué)作用成為新的遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。多位研究人員通過高通量測序等技術(shù)鑒定人和小鼠等生物全基因組水平m6A甲基化調(diào)控位點(diǎn)，并聯(lián)合其他組學(xué)數(shù)據(jù)及通過功能驗(yàn)證揭示m6A修飾對基因表達(dá)及生物學(xué)過程的調(diào)控機(jī)制（圖 1）［9］。

1 m6A甲基化修飾酶及研究方法

1.1 m6A甲基化修飾酶

m6A 甲基化作為普遍存在于真核細(xì)胞生物的信使 RNA（messenger RNA，mRNA）轉(zhuǎn)錄后修飾［11］，在多數(shù)真核生物中具有高度保守性。通常m6A 修飾包含在共有序列5′-RRACU-3′（R=A或G）中，并且主要結(jié)合位點(diǎn)在翻譯終止密碼子附近蛋白質(zhì)編碼區(qū)（sequence coding for aminoacids in protein，CDS）及 3′UTR 端［12］。m6A 作為堿基 A 第六位 N 原子上以活性腺苷胺酸為甲基供體發(fā)生的RNA 甲基化修飾，其mRNA 修飾的過程復(fù)雜多樣，主要是通過甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（METTL14，METTL3 和WTAP組成）、去甲基酶（ALKBH5和FTO）和RNA結(jié)合蛋白（YTH家族）共同合作修飾［13-15］。

圖1 mRNA m6A甲基化修飾主要研究進(jìn)程［10］Fig.1 Main research process of m6A methylation modification across mRNA

Writers（書寫器）作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，催化RNA中腺苷酸上m6A甲基化修飾，促使m6A甲基化基團(tuán)寫入RNA。甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣 14（methyltransferase like 14，METTL14）、Wilms腫瘤抑制因子-1-相關(guān)蛋白（wilms tumor 1-associating protein，WTAP）和 KIAA1492［16-17］。甲基化修飾蛋白間會形成復(fù)合物共同行使催化功能，METTL3 和METTL14之間形成復(fù)合物，其中METTL3具有催化活性的亞基，而METTL14在底物識別上具有重要作用，作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶多蛋白復(fù)合物的主要催化成分，兩者缺失可導(dǎo)致m6A幾乎完全缺失。也有學(xué)者對METTL14作為甲基化酶提出不同的觀點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)METTL14沒有結(jié)合S-腺苷甲硫氨酸（S adenosyl L methionine，SAM）的結(jié)構(gòu)域，不能單獨(dú)行使m6A甲基化酶的功能，其只能通過與METTL3結(jié)合影響m6A水平［18］。WTAP引導(dǎo)和定位METTL3-METTL14復(fù)合物進(jìn)入核斑點(diǎn)，從而有效甲基化目標(biāo)RNA［17］，敲除 WTAP 導(dǎo)致 METTL3和 METTL14的降解并顯著降低了m6A的水平［12］。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞檢測甲基化位點(diǎn)的結(jié)果顯示多數(shù)甲基化位點(diǎn)依賴于WTAP 修飾，證明WTAP是mRNA m6A甲基化必不可少的甲基轉(zhuǎn)移酶［19］。

Erasers（擦除器）又稱m6A去甲基酶，主要對RNA中的m6A甲基化基團(tuán)進(jìn)行去甲基化修飾，包含肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity associated，F(xiàn)TO）、Alk B同 源 蛋 白 5（alk B homolog5，ALKBH5）以及其他同源基因［20］。FTO和ALKBH5均屬于FeII/α-KG依賴性雙加氧酶ALKB家族，2007年3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室分別證實(shí)當(dāng)FTO基因產(chǎn)生突變時會增加肥胖風(fēng)險(xiǎn)［21-23］。FTO可在體外與單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）和單鏈 RNA（single-stranded RNA，ssRNA）中多個去甲基酶活生理底物結(jié)合氧化脫甲基［24］。

Readers（閱讀器）編碼基因被稱為識別蛋白，識別蛋白會與 RNA上的m6A甲基化位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而執(zhí)行各種生物學(xué)功能［25］。主要包括YTH家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和 YTHDC2）［26-27］、eIF3、hnRNPC 和 hnRNP A2/B1［28-29］以 及其 他 同源性基因。已有研究對YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白進(jìn)行定位發(fā)現(xiàn)，YTHDFs型蛋白主要存在于識細(xì)胞質(zhì)中，而YTHDCs型蛋白則主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用［27，30-31］。研究發(fā)現(xiàn) YTHDF1和 YTHDF3蛋白參與調(diào)控mRNA的翻譯效率，同時YTHDC1蛋白對編碼和非編碼基因的轉(zhuǎn)錄均有調(diào)控作用。

甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶主要作用于基因表達(dá)修飾，去甲基化酶的存在進(jìn)一步證實(shí)了m6A甲基化修飾RNA與DNA表觀遺傳修飾一樣也具有動態(tài)可逆的修飾過程。該機(jī)制可由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物MTTL3-METTL14-WTAP建立且對腺苷酸進(jìn)行修飾，同時又可被FTO、ALKBH5這類去除酶移除（圖2）。

1.2 m6A檢測方法

常見甲基化位點(diǎn)檢測方法包括：比色法［32］、高通量測序法MeRIP-Seq（methylated RNA immunoprecipitation sequencing） 又 稱 為 m6A-Seq（m6A-specific methylated RNA immunoprecipitation sequencing）［33-34］、三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-LC/MS/MS）［35］、紫外交聯(lián)免疫共沉淀技術(shù)，具體包括光交聯(lián)輔助m6A測序技術(shù)（photo-crosslinking-assisted m6A sequencing strategy，PA-m6A-Seq）、m6A堿基分辨率交聯(lián)共沉淀技術(shù)（m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation，m6A-miCLIP，或 稱 為 UV-CLIP） 和 m6A-LAIC-Seq［36］、m6A-REFSeq（表 1）。

圖2 m6A甲基化的調(diào)節(jié)過程Fig.2 The regulation process of the m6A

早期受實(shí)驗(yàn)規(guī)模的限制，針對N6-甲基腺苷的研究主要利用在mRNA中m6A出現(xiàn)在特定序列GAC（70%）或AAC（30%）［37-38］中這一特點(diǎn)，采用同位素標(biāo)記法［39-41］、薄層色譜［42］對 m6A 進(jìn)行定位檢測。隨著二代測序技術(shù)和質(zhì)譜等技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)高效液相色譜可提高定量m6A的精確性并監(jiān)測其動態(tài)狀態(tài)［13］，抗體免疫印跡方法（dot-blot）同樣可以精確檢測m6A的含量。此外，基于免疫沉淀法識別N6-甲基腺苷位點(diǎn)的MeRIP-Seq高通量測序技術(shù)陸續(xù)被應(yīng)用［43］。

2019年兩個研究團(tuán)隊(duì)同年利用MazF酶對m6A修飾的特異性識別特點(diǎn)，分別開發(fā)新型m6A位點(diǎn)鑒定方法：m6A-REF-seq法和MAZTER-seq法。這兩種方法原理基本一致，不僅可以從頭檢測m6A位點(diǎn)，對甲基化進(jìn)行定量，還可以對亞細(xì)胞、不同類型細(xì)胞等的m6A進(jìn)行定量。駱觀正研究團(tuán)隊(duì)的m6A-REF-seq方法側(cè)重研究m6A修飾位點(diǎn)定性的準(zhǔn)確性，而Schwartz團(tuán)隊(duì)的MAZTER-seq推動m6A研究進(jìn)入定量領(lǐng)域［44-45］。

表1 m6A甲基化檢測手段Table 1 Detection method of m6A methylation

2 m6A與動物生長發(fā)育

2.1 胚胎發(fā)育

2014年Batista等［47］發(fā)現(xiàn)核心多能性轉(zhuǎn)錄因子的RNA在小鼠和人類胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）中具有m6A修飾，Xiao等［48］利用MeRIP-Seq測序方法首次繪制了人類胎兒組織的m6A圖譜，同時發(fā)現(xiàn)m6A位點(diǎn)存在大量已知人類表達(dá)定量性狀基因座（expression quantitative trait loci，eQTL）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），推測這些SNP參與調(diào)控m6A修飾。不同組織lincRNA的m6A修飾分析發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子RNA（enhancer RNAs，e-lincRNA）區(qū)域m6A顯著富集，結(jié)果表明m6A可能與增強(qiáng)子RNA功能有關(guān)；并發(fā)現(xiàn)METTL3在高CpG基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)富集，這暗示m6A可能通過共轉(zhuǎn)錄的方式，直接調(diào)控相應(yīng)基因的表觀狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄。該研究揭示m6A在人類組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的潛在功能。m6A對胚胎干細(xì)胞的多能性和分化具有重要影響，在ESCs中m6A可影響mRNA代謝、維持細(xì)胞自我更新并調(diào)控胚胎細(xì)胞分化［49］。為探究m6A對小鼠胚胎發(fā)育的影響，研究敲除成骨細(xì)胞和原始態(tài)胚胎干細(xì)胞中的METTL3，結(jié)果顯示胚胎整體m6A甲基化水平降低，缺乏METTL3的這些細(xì)胞能夠存活，但無法完全終結(jié)原始態(tài)多能性［50］。在小鼠ESC中敲低METTL3和METTL14抑制多能性基因SOX2，NANOG和DPPA3的表達(dá)，并促進(jìn)了小鼠ESC中發(fā)育調(diào)節(jié)因子FGF5，CDX2和 SOX17的表達(dá)［16］。多項(xiàng)研究表明小鼠ESCs中m6A 對干細(xì)胞分化節(jié)律具有調(diào)控作用，它保證了多能性因子下調(diào)的準(zhǔn)確性和及時性，為細(xì)胞分化和ESCs譜系成熟提供保障。

小鼠體內(nèi)識別蛋白YTHDF2的耗竭會導(dǎo)致胚胎發(fā)育后期死亡，結(jié)合體內(nèi)和體外比對YTHDF2缺失的小鼠胚胎和正常小鼠胚胎，在YTHDF2缺失的小鼠胚胎中神經(jīng)干細(xì)胞（NSPCs）的增殖和分化能力明顯下降，且神經(jīng)元不能產(chǎn)生正常功能的神經(jīng)突，研究證明YTHDF2參與mRNA降解最終調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育［51］。在小鼠睪丸中，使用Vasa -Cre系介導(dǎo)敲除小鼠早期生殖細(xì)胞中METTL3或METTL14基因，結(jié)果顯示敲除小鼠隨著年齡的增長，二倍體精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSC）逐漸減少［52］，Xu等［53］敲除雄性小鼠中METTL3，在生殖細(xì)胞中METTL3失活抑制精原細(xì)胞分化、阻礙減數(shù)分裂，m6A對哺乳動物精子發(fā)生與繁殖中具有調(diào)控作用。

2.2 m6A與脂肪生成

m6A作為RNA主要修飾方式，不同m6A甲基化修飾在脂肪生成中具有不同調(diào)控作用。m6A甲基化基因糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白結(jié)合蛋白1（glycosylphosphatidylinositol anchored high density lipoprotein binding protein 1，GPIHBPI）基因作為脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL）的載體及重要調(diào)控因子，GPIHPI在脂肪組織中轉(zhuǎn)錄水平較高，能夠與LPL基因結(jié)合形成脂解平臺并參與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中LPL 基因轉(zhuǎn)運(yùn)。高脂飲食試驗(yàn)中對正常飲食和高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導(dǎo)的小鼠肝臟進(jìn)行MeRIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)HFD肝臟中上調(diào)甲基化的編碼基因主要富集于脂代謝相關(guān)的過程，從而調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝［54］。Zhao等［55］對脂肪含量差異顯著的長白豬和金華豬背部脂肪組織m6A 甲基化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，長白豬脂肪組織中m6A含量顯著高于金華豬，過表達(dá)YTHDF1增加PNPLA2表達(dá)并促進(jìn)脂肪生成，其中PNPLA2（Patatin-like phospholipase domain containing 2）是促進(jìn)脂肪生成特異性表達(dá)基因［56］。在脂肪細(xì)胞中進(jìn)行同義突變（synonymous mutations，MUT）以降低差異解偶聯(lián)蛋白 2（uncouplingprotein 2，UCP2）和PNPLA2 mRNA的m6A水平。成脂試驗(yàn)及m6A檢測表明m6A負(fù)調(diào)控UCP2蛋白表達(dá)，正調(diào)控PNPLA2蛋白表達(dá)。通過過表達(dá)YTHDF1和YTHDF2檢測相關(guān)基因變化，證實(shí)m6A修飾可通過YTHDF1影響PNPLA2的翻譯，而m6A修飾UCP2途徑尚未得知。研究顯示YTHDF2也參與脂肪生成調(diào)控；在前體脂肪細(xì)胞中，YTHDF2通過靶向識別、捕獲由m6A去甲基化酶沉默導(dǎo)致具有較高m6A修飾水平的Atg5和Atg7轉(zhuǎn)錄本并使其降解，進(jìn)而抑制脂肪生成。同時發(fā)現(xiàn)在小鼠的脂肪組織中特異性敲除FTO導(dǎo)致白色脂肪沉積顯著降低及靶向因子Atg5和Atg7表達(dá)下降，從而證實(shí)FTO抑制脂肪生成［57］。

m6A對骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞具有特異性調(diào)控功能，敲低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中METTL3會導(dǎo)致骨形成受損，成骨分化潛能不足以及骨髓脂肪增多［58］。高脂飲食孕鼠后代mRNA m6A水平顯著上調(diào)，脂肪含量下調(diào)，METTL3表達(dá)量顯著上調(diào)，這表明母體攝入高脂可以以組織特異性和發(fā)育依賴性的方式影響后代mRNA m6A修飾及其相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控脂肪生成，并為m6A系統(tǒng)從母體營養(yǎng)向后代食物的傳播提供可行性［59］。在敲低小鼠胰島B細(xì)胞METTL14（βKO）研究中發(fā)現(xiàn)，HFD的βKO孕鼠新生胎兒脂肪生成減少，肝臟脂肪分解增加，敲低METTL14減少HFD喂養(yǎng)導(dǎo)致代償性胰島素B細(xì)胞增加，糖尿病風(fēng)險(xiǎn)上升［60］。

2.3 m6A參與肌肉發(fā)育

肌肉是動物機(jī)體重要的組成部分，其生長發(fā)育過程受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控等。近期多項(xiàng)研究表明m6A參與骨骼肌成肌分化、心肌重塑、再生等。METTL3在骨骼肌肌肉分化中具有正向調(diào)控作用，同時METTL3 能維持成肌細(xì)胞中MyoD mRNA穩(wěn)定。在肌源干細(xì)胞中MyoD表達(dá)量受到m6A 修飾調(diào)節(jié)，敲低METTL3導(dǎo)致MyoD 特異性下調(diào)［61］。通過m6A 測序分析顯示：在成肌細(xì)胞增殖過程中METTL3 通過位于MyoD的5′UTR的m6A修飾來調(diào)節(jié)MyoD的表達(dá)。過表達(dá)METTL3可提高m6A甲基化水平以促進(jìn)成肌細(xì)胞成肌分化，通過外源甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸（cycloleucine，Cyc）和甲基供體甜菜堿（betaine，Bet）研究m6A甲基化對小鼠成肌分化的調(diào)節(jié)作用發(fā)現(xiàn)，METTL3和Bet正向調(diào)控m6A甲基化水平，而Cyc負(fù)調(diào)控m6A甲基化水平，推測m6A甲基化正調(diào)控成肌分化［62］。受孕小鼠高脂攝入影響其雄性后代小鼠骨骼肌m6A修飾，進(jìn)而調(diào)控肌肉生長，對不同周齡小鼠后代脛骨前肌中m6A表達(dá)水平檢測，結(jié)果顯示m6A表達(dá)量先升高后降低，同時檢測不同時期肌肉中FTO表達(dá)量，進(jìn)一步說明肌肉中m6A表達(dá)量干擾受孕小鼠肌肉生長［59］。Wang等［63］通過研究FTO對小鼠骨骼肌肌肉分化的影響，首次證明FTO參與調(diào)控肌源性干細(xì)胞分化。

Mathiyalagan等［64］研究了常氧和低氧狀態(tài)下體外心肌細(xì)胞中FTO表達(dá)量與心肌收縮功能的關(guān)系，表明FTO在體外減緩缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞功能障礙，且證實(shí)在小鼠體內(nèi)過表達(dá)FTO導(dǎo)致RNA m6A下調(diào)可改善心衰誘導(dǎo)的心功能障礙，F(xiàn)TO在未來的心衰竭治療中具有潛在的作用。多個研究通過構(gòu)建不同小鼠心臟模型（功能完好和功能缺失）評估m(xù)6A METTL3途徑在心臟穩(wěn)態(tài)和功能方面的作用，結(jié)果顯示過表達(dá)METTL3會誘發(fā)心肌肥大，同時METTL3介導(dǎo)的m6A 甲基化對心力衰竭等具有拮抗作用［65-66］。m6A修飾RNA同樣存在于血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖分化過程中，m6A修飾蛋白通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而影響VSMC 的增殖。對三七總皂苷（total panax notoginseng saponin，TPNS）抑制內(nèi)膜增生并抑制肌肉損傷后VSMC的增殖研究發(fā)現(xiàn)，TPNS通過促進(jìn)WTAP的表達(dá)，可負(fù)調(diào)控VSMC的活力從而影響其增殖能力［3，67］。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cell，ADSC）可分化為平滑肌細(xì)胞，在誘導(dǎo)ADSC誘導(dǎo)分化成血管平滑肌的過程中METTL3表達(dá)量上調(diào)，低氧應(yīng)激介導(dǎo)METTL3的表達(dá)可促進(jìn)ADSC分化為 VMSC［67］。

3 展望

目前，對m6A的研究在人和模式動物相關(guān)RNA表觀遺傳學(xué)調(diào)控功能探究水平上已取得了一定的進(jìn)展，但對m6A修飾與哺乳動物生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究剛剛起步，未來仍然有許多科學(xué)問題亟待探究。除了目前已鑒定的哺乳動物m6A相關(guān)修飾酶外，是否還有其它m6A的甲基化酶、去甲基化酶和識別蛋白參與m6A修飾，其對于mRNA表達(dá)及蛋白翻譯又有何調(diào)控作用。關(guān)于m6A功能的研究大多通過對甲基化酶和去甲基化酶修飾完成，但是參與m6A下游區(qū)域功能調(diào)控酶有哪些，且這些酶是僅僅作用于RNA上的m6A修飾，還是存在其它修飾底物，我們不得而知。此外，對m6A受何種調(diào)控知之甚少，非編碼RNA、DNA甲基化等如何影響m6A修飾有待進(jìn)一步研究。未來，隨著研究的不斷深入及m6A甲基化檢測技術(shù)的不斷完善，綜合應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)、基因編輯等多層次技術(shù)手段，相信對m6A在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、生長發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展等方面的功能及調(diào)控機(jī)制會有更為系統(tǒng)深入的了解。