貪銅菌利用混合餐廚廢油合成聚羥基丁酸酯

潘蘭佳 李杰 林清懷 汪印

（1. 廈門產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，廈門 361000；2. 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所 中國科學(xué)院城市污染物轉(zhuǎn)化重點實驗室，廈門 361021）

石油基塑料以其低廉的價格和優(yōu)異的性能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域。然而，廢棄塑料難降解，富含有毒有害成分，其大量堆積不僅影響環(huán)境美觀，還易使土壤環(huán)境惡化，焚燒處理則會導(dǎo)致有毒氣體排放，造成二次污染。因此，尋找可降解塑料以取代傳統(tǒng)的石油基塑料已迫在眉睫。聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHAs）是由微生物在碳源過剩和某些必需營養(yǎng)元素限制的條件下合成的一系列生物聚酯［1］。PHAs具有與聚丙烯塑料相似的材料學(xué)性質(zhì)，如熱塑性、彈性等，同時其獨特的生物相容性和可降解性引起了廣泛關(guān)注。這些聚合物在好氧條件下可被微生物降解為H2O和CO2，從而避免了在環(huán)境中的長期積累［2］。目前，PHAs的擴(kuò)大生產(chǎn)主要瓶頸之一是成本較高，研究發(fā)現(xiàn)以有機(jī)廢棄物作為微生物碳源可有效降低其生產(chǎn)成本［3-4］。

油脂是食物烹飪的重要組成部分。據(jù)估計，到2020年，我國食用油消費將呈指數(shù)增長，餐廚廢油總量將超過10×107t。餐廚廢油中含有鉛、鎘、砷等重金屬及致癌物黃曲霉毒素等［5］，如果處理不當(dāng)，有害物質(zhì)流入生態(tài)系統(tǒng)，不僅造成環(huán)境污染，還會危及人類健康。油脂的主要成分有脂肪酸、甘油、維生素等，可作為微生物的碳源。利用廢油合成生物塑料不但可以解決廢油處理不當(dāng)造成的問題，而且有益于環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。

近年來，已有不少研究報道利用不同的單一油脂生物合成 PHAs，如菜籽油［6-8］、大豆油［9-11］、棕 櫚 油［12］等。 貪 銅 菌（Cupriavidus necator，C.necator）是利用脂質(zhì)類底物生產(chǎn)PHAs的常用菌株，Obruca等［7］以廢棄菜籽油為底物，利用C.necator H16生產(chǎn)聚羥基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate，PHB），通過連續(xù)培養(yǎng)，72 h 之后PHB產(chǎn)量可達(dá)105 g/L；Verlinden等［13］利用 C. necator以煎炸廢油為底物生產(chǎn)PHA，72 h產(chǎn)量為1.2 g/L。種宇軒等［14］以煎炸廢油作為發(fā)酵過程中的碳源，對C. necator合成PHA過程的進(jìn)行了條件優(yōu)化，結(jié)果在最佳條件下PHA的產(chǎn)量可達(dá)到6.63 g/L，占到細(xì)胞干重的約83%。以上利用油脂生物合成PHAs的研究多集中在單一組分油脂的利用上，主要是因為混合廢油作為合成底物因其成份復(fù)雜而受到限制，混合餐廚廢油中含有許多雜質(zhì)，會影響微生物的生長，可能導(dǎo)致PHA產(chǎn)率低。因此，利用混合餐廚廢油為原料制備PHAs的研究報道目前較少。

本研究以餐廚垃圾混合廢油為底物，利用C.necator為發(fā)酵菌株制備PHB，通過制備條件優(yōu)化，擴(kuò)大實驗規(guī)模，在混合餐廚廢油作為單一碳源的條件下，實現(xiàn)C. necator對此廢油的高效利用，以期為餐廚垃圾混合廢油提供新的利用途徑，同時為未來的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和餐廚廢油來源 可合成聚羥基丁酸酯（PHB）的菌株C. necator（CGMCC 1.7092）購于中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）。餐廚廢油取自廈門市東部固廢中心，為餐廚垃圾處理過程中分離得到的粗油脂。餐廚廢油的脂肪酸含量，如表1所示。

表1 餐廚廢油的脂肪酸含量Table 1 Fatty acid content of the waste cooking oil

1.1.2 藥品與培養(yǎng)基 PHB合成所用培養(yǎng)基主要 成 分 為 ：（NH4）2SO4：1 g/L，KH2PO4：1 g/L，Na2HPO4·12H2O ：11.1 g/L，MgSO4：0.2 g/L，1 mL微 量 元 素 液（FeCl3：9.7 g/L，CaCl2：7.8 g/L，CuSO4·5H2O：0.156 g/L，CoCl2：0.119 g/L，NiCl2：0.118 g/L，CrCl2：0.062 g/L 溶解于 0.1 mol/L HCl 中）；LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨：10 g/L；NaCl：5 g/L；酵母提取物：5 g/L）用于細(xì)菌培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌株C. necator合成 PHAs的種類分析 稱取0.3 g凍干菌體于消解管中，加入2 mL氯仿和2 mL苯甲酸-甲醇溶液（含10% 濃硫酸），置于 100℃烘箱反應(yīng) 4 h，苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)。反應(yīng)結(jié)束冷卻后，加入1 mL 去離子水，振蕩均勻，靜置一夜離心分層。取下層氯仿相進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析［14］。羥基脂肪酸與甲醇在濃硫酸的催化下生成羥基脂肪酸甲酯，因此通過氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測出的為羥基脂肪酸甲酯，以此來得出PHAs的種類。

1.2.2 PHB合成條件優(yōu)化 培養(yǎng)溫度：50 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH7.5）中含油量4%，并接種4%的菌懸液，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床培養(yǎng)，搖床溫度分別設(shè)定為20、25、30和35℃，72 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。

培養(yǎng)基初始pH值：50 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中含油量4%，并用酸堿調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始的pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，并接種4%的菌懸液，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床培養(yǎng)，搖床溫度設(shè)定為之前測定的最適溫度，72 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。

搖床轉(zhuǎn)速：50 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中含油量4%，培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)至上一步測定的最適pH值，搖床溫度設(shè)定為最適溫度。分別設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為100、150、200和250 r/min。培養(yǎng)基中接種4%的菌懸液，72 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。

餐廚廢油添加量：50 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始pH值、搖床溫度和轉(zhuǎn)速都設(shè)定為之前測定的最佳值。分別在培養(yǎng)基中添加不同比例的餐廚廢油，包括1%、2%、3%、4%和5%。培養(yǎng)基中接種4%的菌懸液，72 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。

菌株接種量：50 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始pH值、搖床溫度、轉(zhuǎn)速以及餐廚廢油添加量都設(shè)定為之前測定的最佳值。在培養(yǎng)基中接種不同量的菌株（OD600=2.0），包括1%、2%、3%、4%、5%和6%。72 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。

培養(yǎng)時間：50 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始pH值、搖床溫度、轉(zhuǎn)速、餐廚廢油添加量和接種量都設(shè)定為之前測定的最佳值。共設(shè)置6組實驗，每一組分別在不同時間點（12、24、48、72、96和120 h）取出搖床。測定菌體干重和PHB含量。

1.2.3 菌株C. necator 發(fā)酵培養(yǎng) 微生物發(fā)酵是利用微生物的特殊代謝途徑，把原料轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物的生物學(xué)過程。不同的發(fā)酵方法會導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量的不同，甚至是產(chǎn)物種類的變化。以下通過3種不同的發(fā)酵模式，探究提高PHB產(chǎn)量的方法。

模式一（分批發(fā)酵）：利用5 L的發(fā)酵裝置，培養(yǎng)基裝液量為3.5 L。自動控制發(fā)酵溫度在25℃，攪拌速率為150 r/min，自動調(diào)節(jié)酸堿值在pH 7.0。接種量和餐廚廢油添加量為3%。發(fā)酵期間利用空氣壓縮機(jī)向發(fā)酵罐中通入無菌空氣，氣體通入量為2 L/min。96 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。

模式二：基本方法同模式一，但在發(fā)酵2 d后加入無菌餐廚廢油（22.3 g/L）。96 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。此模式的主要目的是補充前期已轉(zhuǎn)化的餐廚廢油，探明中途添加廢油是否能夠提高PHB產(chǎn)量。

模式三（補料分批發(fā)酵）：初始無機(jī)鹽培養(yǎng)基1.5 L，接種量和餐廚廢油量為3%，運行24 h后，向發(fā)酵罐中補充1 L新鮮培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中的（NH4）2SO4和Na2HPO4·2H2O的濃度減半，以達(dá)到氮磷限制的目的），繼續(xù)運行24 h，再次補料。96 h后取樣測定菌體干重和PHB含量。此模式的主要目的是通過新鮮營養(yǎng)液的加入，補充前期發(fā)酵造成的營養(yǎng)流失，并通過氮磷限制的方法探究其對PHB合成效率的影響。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 菌體干重分析 5 mL培養(yǎng)液與等體積的正己烷混合，離心15 min（8 000 r/min），收集菌體，并用正己烷和去離子水各洗滌一次后，冷凍干燥后稱重，計算得出菌體干重［15］。

1.2.4.2 PHB的提取 取一定量的干菌體于100 mL三角瓶中，加入次氯酸鈉溶液和氯仿（1∶3），置于30℃，200 r/min搖床。90 min后離心20 min（9 000 r/min），取下層氯仿相，加入2 mL去離子水震蕩，再次離心20 min（9 000 r/min）后，取下層氯仿相，倒于已知重量的9 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于通風(fēng)櫥，待氯仿蒸干后稱重獲得PHB［16］。

1.2.4.3 PHB分子量分布和熱力學(xué)性質(zhì)分析 熱重分析：稱取10 mg PHB放置在熱重天平小坩堝中。熱重實驗使用氮氣作為吹掃氣，流速設(shè)定為 60 mL/min；氮氣作為反應(yīng)氣，流速設(shè)定為20 mL/min。升溫程序為：以 20℃/min的升溫速率從40℃升至600℃，結(jié)束。

差示掃描量熱分析（Differential scanning calorimetry，DSC）利用差熱掃描量熱儀（TA，美國）在-90℃-200℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行測量，加熱和冷卻速率為10℃/min。高純氮以50 mL /min的速度通入，基線以空鋁鍋為基準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)［17］。

分子量分布：采用凝膠滲透色譜（Waters，美國）測試。將聚合物樣品溶解于氯仿樣品中，然后使用孔徑為0.2 μm的聚四氟乙烯過濾器對溶液進(jìn)行過濾，上機(jī)檢測。洗脫條件為30℃，流速為1mL/min，以氯仿為流動相［18］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用IBM SPSS統(tǒng)計軟件（20.0）對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（LSD多重比較檢驗），P＜ 0.05時視為差異顯著。利用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株C. necator合成 PHAs的種類分析

菌株C. necator 利用混合餐廚廢油合成PHA后的菌體，在酸性、高溫條件下進(jìn)行甲酯化，以獲得羥基脂肪酸甲酯。通過氣相色譜-質(zhì)譜檢測，并與物質(zhì)庫中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對，可以發(fā)現(xiàn)其檢測到的物質(zhì)主要為3-羥基丁酸甲酯（圖1），說明菌株C.necator合成的產(chǎn)物主要是短鏈脂肪酸酯—聚羥基丁酸酯（PHB）。將該物質(zhì)與PHB標(biāo)準(zhǔn)品消解后樣品利用氣相色譜-質(zhì)譜檢測后得到了相同的圖譜，進(jìn)一步證實了菌株C. necator 利用混合餐廚廢油合成的PHA的主要主要組成是PHB。

圖1 PHA甲酯化產(chǎn)物氣相色譜質(zhì)譜鑒定圖Fig. 1 Identification of methylated products of PHA by gas chromatography-mass spectrometry

2.2 菌株C. necator合成PHB的最適條件

2.2.1 溫度對菌株生長和PHB合成的影響 培養(yǎng)溫度對菌株C. necator的生長及PHB合成的影響如圖2所示。在20和25℃時，菌體的生長量隨著溫度變化有略微的增加，但是無明顯差異（P ＞ 0.05）。隨著溫度升高，所得到的菌體細(xì)胞干重急劇減少（P ＜0.05），35℃時得到的細(xì)胞干重僅不到2 g/L，PHB的占比逐漸下降到20%左右（P ＜ 0.05）。PHB在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的占比表現(xiàn)出與菌體生長量相似的趨勢，在25℃時達(dá)到最大值，為78%。因此，結(jié)合菌體的生長量和PHB在菌體內(nèi)所占比重，最終確定25℃作為菌株C. necator合成 PHB的最適溫度。

圖2 溫度對菌株C. necator細(xì)胞干重和PHB合成的影響Fig. 2 Effect of temperature on the cell dry weight of strain C. necator and PHB synthesis

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株生長和PHB合成的影響 在最適的培養(yǎng)溫度（35℃）基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)探索pH值對C. necator合成PHB的影響。如圖3所示，不同的初始pH值對菌體的生長和PHB的合成有一定的影響。過高或過低的pH值對菌株生長和PHB在細(xì)胞內(nèi)的占比表現(xiàn)出明顯的抑制作用。培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，菌株C. necator的生長最佳，可達(dá)8.0 g/L。另外，PHB在菌株細(xì)胞內(nèi)的占比與生長的趨勢一致，隨著pH值的升高，先增加后降低，同樣在pH值為7.0時，達(dá)到最大值79%。綜上所述，得到優(yōu)化的pH值為7.0。

圖3 pH對菌株C. necator細(xì)胞干重和PHB合成的影響Fig.3 Effect of pH on the cell dry weight of strain C.necator and PHB synthesis

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株生長和PHB合成的影響 基于優(yōu)化的溫度（35℃）和pH值（7.0），進(jìn)一步研究搖床轉(zhuǎn)速（100 r/min-250 r/min）對菌株生長和PHB合成的影響。如圖4所示，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時得到的菌體細(xì)胞干重最低，轉(zhuǎn)速從100升高至150 r/min時，菌體產(chǎn)量和PHB占比均顯著升高（P ＜0.05）。轉(zhuǎn)速在150 r/min-250 r/min的范圍內(nèi)菌體細(xì)胞干重?zé)o顯著差異（P ＞0.05）。在PHB合成方面，搖床轉(zhuǎn)速為150和200 r/min時，PHB的合成量無顯著差異（P ＞0.05），并且隨著轉(zhuǎn)速的增加，無明顯變化。因此，選擇轉(zhuǎn)速150 r/min為最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速，可在一定程度上減少能耗，節(jié)約生產(chǎn)成本。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對菌株C. necator 細(xì)胞干重和PHB合成的影響Fig.4 Effect of rotation speed on the cell dry weight of strain C. necator and PHB synthesis

2.2.4 餐廚廢油添加量對菌株生長和PHB合成的影響 本研究中，培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)至中性，溫度和搖床轉(zhuǎn)速分別控制在30℃和150 r/min，繼續(xù)探究了餐廚廢油添加量分別為1%、2%、3%、4%和5%時菌株的生長和PHB合成情況。結(jié)果如圖5所示，不同餐廚廢油添加量對菌體合成PHB的影響不大，胞內(nèi)PHB含量均在細(xì)胞干重的75%左右。但對菌體細(xì)胞干重有一定的影響，當(dāng)廢油添加量在3%時，菌體細(xì)胞干重達(dá)到最大值（8.7 g/L），隨著廢油添加量的增加，菌體細(xì)胞干重與廢油添加量在3%時無顯著差異（P＞0.05）。因此，從節(jié)約底物和利用效率方面考慮，培養(yǎng)時選取廢油添加量3%為佳。

圖5 餐廚廢油添加量對菌株C. necator 細(xì)胞干重和PHB合成的影響Fig.5 Effect of waste cooking oil amount on the cell dry weight of strain C. necator and PHB synthesis

2.2.5 接種量對菌株生長和PHB合成的影響 在之前所獲得的最佳條件下（30℃，150 r/min，pH 7.0，3%餐廚廢油添加量），繼續(xù)探究了接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%和6%對菌株生長和PHB合成的影響。結(jié)果顯示（圖6），不同的接種量對菌株生長與PHB的合成的影響不顯著（P＞0.05）。接種量為6%時，雖然PHB的合成量占細(xì)胞干重的比例最大，但菌株的生長相對較低，最后將導(dǎo)致總PHB的合成量相對略有減少。因此，從合成PHB的總量的角度分析，接種量為3%時，獲得的PHB總量最大。

圖6 接種量對菌株C. necator細(xì)胞干重和PHB合成的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on the cell dry weight of strain C. necator and PHB synthesis

2.2.6 菌株C. necator生長和PHB合成隨時間的變化 在上述所有優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，研究了菌株C.necator以餐廚廢油為單一碳源時，隨著培養(yǎng)時間（0-120 h）的變化，菌體生長和PHB合成情況。從圖7可以看出，菌株在前48 h 迅速生長（P＜0.05），之后逐漸呈現(xiàn)緩慢生長的趨勢。菌體干重在96 h達(dá)到比較高的數(shù)值（9.5 g/L），與120 h的菌體干重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。PHB在菌體細(xì)胞內(nèi)的占比也是隨時間逐漸增加，12 h時PHB占菌體細(xì)胞干重的百分比僅為40%，48 h后增加至75%以上，隨后增幅減弱并在96 h之后保持穩(wěn)定，菌體占比維持在80%左右。

圖7 培養(yǎng)時間對菌株C. necator細(xì)胞干重和PHB合成的影響Fig.7 Effect of culture time on the cell dry weight of strain C. necator and PHB synthesis

2.3 菌株C. necator發(fā)酵合成PHB

為了進(jìn)一步放大實驗規(guī)模，為今后的產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)，本研究繼續(xù)開展了發(fā)酵罐容量為5 L的發(fā)酵實驗，以提高PHB的總體產(chǎn)量。發(fā)酵培養(yǎng)的條件基本按照搖瓶培養(yǎng)所優(yōu)化的條件進(jìn)行。溫度為25℃，攪拌速率為150 r/min，利用硫酸和氫氧化鈉溶液作為酸堿調(diào)節(jié)劑自動調(diào)節(jié)酸堿值在pH 7.0。接種量和餐廚廢油添加量為3%。各培養(yǎng)模式的實驗結(jié)果如表2所示。模式一進(jìn)行96 h后菌體干重達(dá)到10.75 g/L左右，所獲的PHB占菌體干重的比例為76.75%左右，PHB產(chǎn)量為8.25 g/L。模式二在48 h時加入了一定量的餐廚廢油，最終導(dǎo)致餐廚廢油殘留量較大，菌體干重相比于模式一有所降低（7.62 g/L），PHB占菌體干重的比例較高，到達(dá)86.88%，但總的PHB產(chǎn)量低于模式一。模式三初始的發(fā)酵體積為1 L，通過兩次的補料最終體積為3 L。兩次補料都限制了氮磷的添加，96 h后PHB占菌體干重的比例達(dá)到82.06 %，但菌體干重較前兩種模式低，僅有6.79 g/L。另外，對于產(chǎn)量較高的模式一進(jìn)行了連續(xù)4次的出料補料實驗，結(jié)果如表3所示。實驗中菌體干重在10 g/L-12 g/L左右，所獲的PHB占菌體干重的比例均在76%左右，實驗過程產(chǎn)出穩(wěn)定，實驗連續(xù)性較好。

表2 不同發(fā)酵模式下菌體和PHB產(chǎn)量Table 2 Bacterial cell and PHB production under different fermentation modes

表3 模式一發(fā)酵培養(yǎng)實驗結(jié)果Table 3 Experiment results of fermentation model 1

2.4 PHB性質(zhì)分析

2.4.1 PHB分子量分布 菌株C. necator利用餐廚廢油合成的聚合物是3-羥基丁酸酯均聚物，該聚合物的分子量分布采用凝膠滲透色譜檢測，結(jié)果如表4所示。菌株C. necator利用餐廚廢油合成的PHB的數(shù)均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）分別為20和30 kD，分散性指數(shù)（PDI）為1.44。說明該聚合物分子量不大，但是均一性較好。

2.4.2 PHB熱性能分析 PHB的DSC測量的溫度范圍為-90℃-200℃，檢測結(jié)果見表4和圖8-A。樣品熔化的峰值在175.7℃。DSC圖譜中，在0-10℃有出現(xiàn)極弱的小峰，猜測是該過程的玻璃轉(zhuǎn)化點，但由于現(xiàn)象不明顯，故不可完全判斷出該聚合物的玻璃轉(zhuǎn)化溫度。其融化溫度為175.7℃，結(jié)晶溫度為71.9℃。PHB的熱重分析（TG）是將樣品以20℃/min的升溫速率從40℃升至600℃，觀察其質(zhì)量隨溫度的變化情況。如圖8-B所示，該聚合物熱分解發(fā)生在285.5℃，310℃左右被完全分解。

表4 細(xì)菌合成PHB的分子量分布和熱力學(xué)性質(zhì)Table 4 Molecular weight distribution and thermodynamic properties of PHB synthesized by bacteria

圖8 差示掃描量熱分析（A）和熱重分析（B）結(jié)果圖Fig.8 Differential scanning calorimetry analysis (A) and thermogravimetric analysis (B)

3 討論

由上述結(jié)果分析的得出，溫度和培養(yǎng)基pH值是影響微生物生長繁殖的重要環(huán)境因素。溫度和pH值的變化不僅改變微生物細(xì)胞膜的通透性，還對胞內(nèi)酶的活性產(chǎn)生影響，從而影響微生物細(xì)胞內(nèi)一系列的生化反應(yīng)［21］。在適宜的環(huán)境條件下培養(yǎng)，才能實現(xiàn)微生物的生長和功能的最大化。目前，除了嗜熱菌種的PHAs合成實驗以外，菌株發(fā)酵合成PHAs的實驗普遍將溫度控制在30℃左右。任連海等［22］選用 C. necator（DSM428）作為實驗菌株，利用地溝油作為細(xì)菌生長的碳源，發(fā)現(xiàn)其在30℃下細(xì)菌生長和PHAs含量都達(dá)到最大值。種宇軒等［14］研究了C. necator利用煎炸廢油合成PHAs的最佳條件，其在28℃時PHAs產(chǎn)量達(dá)到最大。由此可以分析，貪銅菌C. necator合成PHAs的最佳溫度范圍在25-30℃，與本研究的實驗結(jié)果基本一致。另外，大多數(shù)細(xì)菌的最適pH值在6.5-7.5之間，在利用油脂合成PHA的實驗中，多將pH值控制在中性條件下［23］。然而，種宇軒等［14］研究的C. necator利用煎炸廢油合成PHB的最適pH值是7.5；任連海等［22］發(fā)現(xiàn)C.necator（DSM428）利用地溝油合成PHA的最佳pH條件為8.0。以上兩研究與本研究的差別可能是因為不同的廢油脂本身的性質(zhì)以及廢油添加量導(dǎo)致的菌株在細(xì)胞生理活性上有略微的差異。

除了溫度和pH值兩個極其重要的因素以外，搖床轉(zhuǎn)數(shù)、廢油添加量、發(fā)酵時間對菌體的生長和PHB的合成也有一定的影響。搖床轉(zhuǎn)速的變化主要是改變培養(yǎng)基的溶氧量。一般來說，溶氧量和搖床的轉(zhuǎn)速成正比［21］。轉(zhuǎn)速較慢，溶氧較低，菌體與營養(yǎng)物接觸不充分，會出現(xiàn)生長滯后，使得菌體的生長和PHB的合成受到限制；搖床轉(zhuǎn)速過高，溶氧過剩，對菌株生長影響不大，但對其發(fā)酵代謝過程可能有一定的抑制作用。廢油添加量和接種量的變化可能對發(fā)酵的過程影響不大。廢油添加量過低，會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致菌株生長較弱；過多的油脂會促使菌體產(chǎn)生大量的酸性中間產(chǎn)物，從而改變過程中的pH值，抑制菌株的進(jìn)一步生長［14］。但是，發(fā)酵培養(yǎng)過程中是實時調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿性，廢油添加量增加會導(dǎo)致發(fā)酵液的碳氮比（C/N）增加，可能有利于PHB的積累。在培養(yǎng)初期，菌株先利用底物進(jìn)行繁殖生長，后期在合適的條件下累積PHB。因此，實驗初期，菌體增長快，PHB含量少。隨著時間增加，細(xì)菌生長減緩，PHB 逐漸合成，并積累在菌體細(xì)胞內(nèi)。到后期菌株衰退，培養(yǎng)液中有害物質(zhì)增加，PHB有可能被消耗而導(dǎo)致略微有所減少。

發(fā)酵是借助微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制備微生物菌體本身、直接代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物的過程。模式一為分批發(fā)酵實驗，在發(fā)酵的96 h內(nèi)僅控制發(fā)酵罐的溫度和pH值，并未進(jìn)行其它物質(zhì)的添加，菌株在發(fā)酵罐內(nèi)有較好的生長環(huán)境和狀態(tài)。但由于攪拌速率僅為150 r/min，后期發(fā)酵液變濃稠后氧氣難以進(jìn)入可能導(dǎo)致后期溶解氧不足，在一定程度上抑制了菌體的生長，且不利于PHB的合成。模式二改變了分批發(fā)酵的固有模式，中途添加了一定量的餐廚廢油，由于發(fā)酵液碳氮比的極速增大，促進(jìn)了PHB的合成［1］，因此在模式二中PHB的含量最高。但過多的混合餐廚廢油向培養(yǎng)基中引入更多的有毒物質(zhì)，在一定程度上會限制菌體的生長，導(dǎo)致PHB的整體產(chǎn)量較低。模式三為補料分批發(fā)酵，在發(fā)酵過程中間歇補加了新鮮的培養(yǎng)液。由于氮磷限制，PHB的合成效率相對于模式一有一定的提升，但營養(yǎng)不足導(dǎo)致菌體的生長量較低，同樣導(dǎo)致最終PHB的產(chǎn)量較低。綜上分析，利用C.necator發(fā)酵培養(yǎng)可通過改進(jìn)的分批培養(yǎng)法，一次性加入過多的廢油不利于發(fā)酵的進(jìn)行。因此，中途可間歇性添加廢油，提高培養(yǎng)液碳氮比，促進(jìn)PHB積累的同時可減少對菌體生長的抑制。Ng等［24］利用C.necator H16以麻瘋果油為碳源合成PHB。普通搖瓶培養(yǎng)下，48 h菌體的細(xì)胞干為3.3 g/L-8.2 g/L，PHB在細(xì)胞內(nèi)的含量為74%-87%。當(dāng)進(jìn)行補料流加培養(yǎng)時，48 h菌體的細(xì)胞干重可達(dá)65.2 g/L，PHB在細(xì)胞內(nèi)的含量仍然較高，為76%。Cruz等［25］通過溶氧反饋補料發(fā)酵法，利用C. necator DSM 428以食堂烹飪廢油為碳源合成PHB，96 h菌體干重可達(dá)27.2 g/L，PHB產(chǎn)量為19.8 g/L。這些高產(chǎn)的補料策略將來也可用于C. necator以餐廚廢油為碳源合成PHB實驗。另外，適當(dāng)提高攪拌速率，有利于溶解氧的增加，促進(jìn)PHB合成，但同時需要注意氣泡的產(chǎn)生和逃液的現(xiàn)象。

菌株C. necator利用餐廚廢油合成的聚合物為PHB，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的使用同種菌株的利用葵花籽油［2］、咖啡渣廢油［26］、菜籽油［7］和煎炸廢油［27］等含油底物的合成的均聚物類型一致。PHAs的分子量具有多樣性，可從幾萬到上千萬道爾頓不等［28-29］。不同的PHAs分子量是由微生物類型、生長條件和提取方法等多個因素造成的［18］。本研究中合成的PHB分子量較低，一方面可能與所用的餐廚廢油有關(guān)；另一方面主要是由于提取方法中所用的次氯酸鈉對該聚合物具有降解作用所導(dǎo)致［30］。另外，PHAs的PDI在1.2-3.0的范圍［17］，PDI越大，分子量分布越寬，PDI越小，分子量分布越均勻，既體現(xiàn)了聚合物的均勻性。利用餐廚廢油合成的PHB的PDI為1.44，較低于已有報道的結(jié)果，說明該聚合物具有較好的均一性。關(guān)于PHB的熱分解性能，根據(jù)DSC和TG分析，該PHB熔融溫度為175.7℃，與文獻(xiàn)報道一致［20］。其熱分解發(fā)生在285.5℃，310℃左右被完全分解。據(jù)報道，PHAs在200℃以上開始不穩(wěn)定，并斷鏈分解［21］。然而本研究制備的PHB的分解溫度相對較高的，體現(xiàn)出更好的抗熱特性。較高的分解溫度是有利的特征，為之后塑料制品的成型、加工提供了一個更廣泛的溫度范圍，并且能夠在熱塑的過程中減少分解，保持較好的機(jī)械性能［31］。

4 結(jié)論

通過單因素實驗獲得菌株利用混合餐廚廢油合成PHB的最佳條件為30℃，150 r/min，pH 7.0，3%餐廚廢油添加量和接種量。在該條件下，C. necator的生長量與 PHB 合成量均達(dá)到最大值，分別為9.5 g/L和7.6 g/L?？紤]到發(fā)酵效率和能耗問題，最佳培養(yǎng)時間為96 h。

在最適條件下進(jìn)行的發(fā)酵合成PHB的放大實驗，以模式一的培養(yǎng)方式生產(chǎn)的PHB最多，96 h產(chǎn)量可達(dá)8.25 g/L。

菌株C. necator利用餐廚廢油合成的聚合物是3-羥基丁酸酯均聚物，平均分子量為30 kD，分散性指數(shù)（PDI）為1.44。PHB的熔融溫度為175.7℃，分解溫度為285.5℃，與文獻(xiàn)中報道的PHB熱力學(xué)性質(zhì)相似，基本可以滿足熱塑性材料的需求。