細(xì)菌素的研究與應(yīng)用進(jìn)展

田露 吳咪 緱敬軒 龔國(guó)利

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021）

食源性病原體是影響食品質(zhì)量的重要因素，威脅著人類的身體健康，甚至造成致命的影響［1］。例如，單核細(xì)胞增生李斯特菌、腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌、芽孢桿菌和大腸桿菌等病原體進(jìn)入人體組織后，會(huì)引起呼吸道感染、全身感染和腸道感染及癌癥等疾病。因此，在食品中添加化學(xué)防腐劑或天然防腐劑是必不可少的。

天然防腐劑，主要是由微生物分泌的次生代謝產(chǎn)物或體內(nèi)存在的具有抗菌作用的物質(zhì)。在微生物中，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）可產(chǎn)生一系列活性抗菌物質(zhì)（有機(jī)酸、過氧化氫或細(xì)菌素）［2］，其中細(xì)菌素因高抑菌、低毒性等特點(diǎn)而具有較強(qiáng)的生物保存潛力。

細(xì)菌素是由核糖體合成的具有20-60個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的分泌抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），具有疏水性，能抑制革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性食品致病菌，因此提供了新的策略與病原菌作戰(zhàn)［3］。其中，LAB產(chǎn)生的乳酸鏈球菌（Nisin）已被食品藥品管理局授予“一般認(rèn)為安全”（generally recognized as safe，GRAS）的安全性指標(biāo)［4］。Nisin被發(fā)現(xiàn)能抑制奶酪和其他食物中肉毒桿菌孢子的萌發(fā)。乳酸桿菌產(chǎn)生的Pediocin PA-1，具有延長(zhǎng)多種即食產(chǎn)品貨架期的潛力，特別是抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)［5］。

細(xì)菌素對(duì)其產(chǎn)生菌也有毒性，但通過一系列免疫蛋白，它們可以進(jìn)行自我保護(hù)［6］。編碼細(xì)菌素、免疫蛋白和其他輔助蛋白的基因排列成操縱子，這些操縱子存在于基因組、質(zhì)粒或其他可移動(dòng)的基因元件中。一般來說，這些操縱子是可誘導(dǎo)的，需要分泌和細(xì)胞外積累的肽誘導(dǎo)［7］。

微生物對(duì)細(xì)菌素的敏感性是由于細(xì)菌素與細(xì)菌細(xì)胞表面和細(xì)胞膜的相互作用所致。細(xì)胞膜通透性和孔隙形成是細(xì)菌素攻擊靶細(xì)菌的主要機(jī)制［8］。然而，一些食物致病菌對(duì)Nisin和Pediocin等細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道表明，耐藥性的增加可能會(huì)損害細(xì)菌素在生物保存中的潛在作用［9］。因此，為解決細(xì)菌素耐藥性問題，需進(jìn)一步了解細(xì)菌素的功能及其降解機(jī)理。

由于細(xì)菌細(xì)胞膜表面電荷和膜流動(dòng)性是細(xì)菌素在抑菌過程中所利用的兩個(gè)特性，對(duì)這些特性的操縱會(huì)使細(xì)菌素?zé)o效，從而導(dǎo)致細(xì)菌素耐藥性［8］。然而，許多研究表明，不同細(xì)菌素組合使用或與其他抗菌化合物組合使用可克服細(xì)菌素的耐藥性。由于細(xì)菌素是由核糖體合成的抗菌肽，因此通過生物工程技術(shù)改造特定的氨基酸殘基能夠使其更有效地抵抗食品腐敗菌［9］。本文綜述了細(xì)菌素的分類、合成和抑菌機(jī)理以及生產(chǎn)方法，介紹了細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生抗性的機(jī)制以及減輕細(xì)菌素耐藥性的方法，進(jìn)一步闡明了細(xì)菌素在食品保鮮中作為天然防腐劑的潛在應(yīng)用。

1 細(xì)菌素的分類

細(xì)菌素最初被分為I、II、III和IV四類。其中I類細(xì)菌素包含19-50個(gè)氨基酸，如羊毛硫氨酸、N-甲基羊毛硫氨酸、脫氫酪氨酸和脫氫丙氨酸等非編碼氨基酸［10］。I類細(xì)菌素可進(jìn)一步劃分為Ia類（Lantibiotics）、Ib類（Labyrinthopeptins）和Ic類（Sanctibiotics）。

II類細(xì)菌素是一類具有熱穩(wěn)定性、未經(jīng)修飾的小肽，可進(jìn)一步劃分為IIa類（類片球菌素）、IIb類（兩肽未修飾的細(xì)菌素）、IIc類（環(huán)狀細(xì)菌素）和IId類（未修飾的、線性的和非類片菌素）［11］。其中較為典型的Bactofencin A是一種具有某些特殊功能的新型IId細(xì)菌素，它與某些真核生物的陽(yáng)離子抗菌肽相似，具有高度陽(yáng)離子化的特征［12］。此外，Bactofencin A的另一個(gè)獨(dú)特之處在于，它與特異性免疫蛋白不同，它表現(xiàn)出dltB同源物介導(dǎo)的免疫功能，可降低細(xì)胞壁的負(fù)電荷，從而阻礙細(xì)菌素與細(xì)胞之間的相互作用［12］。

III類細(xì)菌素是一類分子量大且熱不穩(wěn)定的細(xì)菌素。如大腸桿菌產(chǎn)生的大腸桿菌素，彎曲乳桿菌、益生乳酸菌和糞腸球菌產(chǎn)生的Helveticin M、Helveticin J和 Enterolysin A［13］。其中 Helveticin M 可破壞革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁和革蘭氏陰性菌的外膜，因此對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有效。

IV類細(xì)菌素由碳水化合物或脂質(zhì)成分的大復(fù)合物組成，已被終止并被命名為由溶菌素S和Nisin 27組成的溶菌素［14］。因此，細(xì)菌素主要分為以上3類。具體分類及屬性，見表1。

2 細(xì)菌素的合成及其抑菌機(jī)理

產(chǎn)生活性細(xì)菌素的基因通常在操縱子簇中，存在于基因組，質(zhì)?；蚱渌梢苿?dòng)的遺傳元件中。這些操縱子的表達(dá)是可誘導(dǎo)的，需要自誘導(dǎo)肽的誘導(dǎo)［23］。細(xì)菌素的表達(dá)通常受兩組分系統(tǒng)調(diào)控，但在某些情況下受三組分系統(tǒng)調(diào)控。Nisin是通過激活兩組分調(diào)控系統(tǒng)而充當(dāng)其表達(dá)的自誘導(dǎo)劑。但是，某些細(xì)菌素例外，它們具有自己獨(dú)特的調(diào)節(jié)與表達(dá)方式。例如，LsbB細(xì)菌素，位于lsbB基因下游的轉(zhuǎn)錄終止子，通過將RNA穩(wěn)定性提高3倍來調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而使表達(dá)增加30倍［23］。有研究表明，細(xì)菌素Brevicin 174A的產(chǎn)生和自我抗性受兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的控制，它們?cè)谄渲谐洚?dāng)積極的自我調(diào)節(jié)作用［7］。

細(xì)菌素是作為前體肽合成的，但前體肽不具備生物活性，需經(jīng)過加工、翻譯修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)后才能形成成熟的細(xì)菌素［24］。用于修飾和輸出的基因位于細(xì)菌素生物合成基因附近。細(xì)菌素的類型不同，修飾可能會(huì)有所不同。像ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Sec依賴性蛋白這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白用于細(xì)菌素的分泌［25］。

表1 細(xì)菌素的分類及屬性Table 1 Classification and properties of bacteriocins

不同種類的細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有不同的作用機(jī)制。由于大多數(shù)細(xì)菌素是陽(yáng)離子型的，因此細(xì)菌素分子與細(xì)菌表面陰離子成分之間的相互作用在細(xì)菌素產(chǎn)生活性的初始階段起著至關(guān)重要的作用。細(xì)菌素采取構(gòu)型，以使帶正電的基團(tuán)與帶負(fù)電的細(xì)菌表面發(fā)生靜電相互作用，而疏水性表面朝向膜排列并穿過脂質(zhì)雙分子層，刺入脂質(zhì)雙分子層后，肽段自締合或聚合形成復(fù)合物［26］。細(xì)菌素誘導(dǎo)靶細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，可能是通過形成離子選擇性孔而引起的。這些孔會(huì)導(dǎo)致鉀、鎂、磷離子、氨基酸和ATP等小分子的流出，從而引起膜電位的擾動(dòng)，pH梯度和質(zhì)子泵的功能受到抑制。細(xì)胞中低水平的ATP和離子缺乏會(huì)導(dǎo)致DNA、RNA、蛋白質(zhì)和多糖合成受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡［27］。

細(xì)菌素需磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)對(duì)接分子（如脂質(zhì)II或甘露糖滲透酶）與膜相互作用。也存在某些細(xì)菌素可能不需要靶受體進(jìn)行對(duì)接。Garvicin ML，來源于乳球菌DCC43的環(huán)狀細(xì)菌素，利用麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和滲透酶作為受體［28］。對(duì)接分子可增強(qiáng)羊毛硫細(xì)菌素孔的傳導(dǎo)性和穩(wěn)定性，但目標(biāo)膜中的受體可能決定II類細(xì)菌素的特異性［8］。I類細(xì)菌素是帶有羊毛硫氨酸殘基的羊毛硫細(xì)菌素，形成分子內(nèi)硫醚環(huán)［29］。II類細(xì)菌素很小，具有窄譜的抑菌活性。羊毛硫細(xì)菌素在“楔形”模型中形成孔，而II類細(xì)菌素通過“桶壁”孔或“地毯”機(jī)制增加膜通透性［8］。

3 細(xì)菌素的生產(chǎn)方法

研究表明，細(xì)菌素主要是通過菌株的發(fā)酵生產(chǎn)。由于微生物發(fā)酵法產(chǎn)生的細(xì)菌素產(chǎn)量低且純化繁瑣。因此開發(fā)了固相肽化學(xué)合成法（solid phase peptide chemical synthesis，SPPS）和異源表達(dá)法生產(chǎn)細(xì)菌素。

3.1 發(fā)酵法

在含有乳清粉（5% W/W）和酵母提取物（0.2%W/W）的培養(yǎng)基中，用乳酸乳球菌ATCC發(fā)酵生產(chǎn)Nisin。將種子培養(yǎng)物（2.5% W/W）接種到發(fā)酵液中，一旦乳酸濃度達(dá)到25 g/L，停止發(fā)酵并將溫度升高至50℃，以停止細(xì)菌的生物活性。所獲得的Nisin濃度為3 000 IU/mL，蒸發(fā)發(fā)酵液以得到濃縮的Nisin［30］。

細(xì)菌素的產(chǎn)量取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，發(fā)酵培養(yǎng)基約占生產(chǎn)成本的30%。多種低分子復(fù)雜介質(zhì)使蛋白質(zhì)純化變得更加繁瑣，從而增加了生產(chǎn)成本［31］。對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，發(fā)酵過程建模以及用便宜培養(yǎng)基代替昂貴培養(yǎng)基的研究將是促進(jìn)細(xì)菌素生產(chǎn)和應(yīng)用的重中之重。

3.2 化學(xué)合成法

由于微生物發(fā)酵法產(chǎn)生的細(xì)菌素產(chǎn)量低，純化繁瑣，因此開發(fā)了SPPS生產(chǎn)細(xì)菌素。用于合成肽的試劑和構(gòu)建基元的價(jià)格降低，以及催化天然蛋白翻譯和修飾的化學(xué)進(jìn)步，使化學(xué)合成法成為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的一種替代方法。

細(xì)菌素AS-48是由70個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀肽。首先合成線性肽，并通過Asn/Asp（Asx）特異性連接酶將其環(huán)化。合成后的環(huán)狀細(xì)菌素在0.24-1.27 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，糞腸球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌均有活性［32］。以HMPB-ChemMatrix樹脂為原料，采用Fmoc/tBu合成Pediocin PA-1。Pediocin PA-1的總產(chǎn)率為11%，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的MIC值為6.8 μmol/L。Pediocin PA-1也顯示出對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的顯著抗菌活性［33］?；瘜W(xué)合成是獲得純細(xì)菌素以避免微生物發(fā)酵后繁瑣純化細(xì)菌素的良好起點(diǎn)。但低產(chǎn)量仍是一個(gè)瓶頸，需要進(jìn)一步優(yōu)化工藝以提高產(chǎn)量。

3.3 異源表達(dá)法

隨著基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過異源分泌表達(dá)產(chǎn)生細(xì)菌素可克服發(fā)酵法與合成法的部分缺點(diǎn)。通常用于產(chǎn)生細(xì)菌素的表達(dá)宿主為細(xì)菌和酵母細(xì)胞。

從中國(guó)大港油田中分離出熱反硝化地芽孢桿菌NG80-2。該分離物可表達(dá)廣譜地桿菌素I和II。在大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中擴(kuò)增并異源表達(dá)地桿菌素I和II的編碼序列。與地桿菌素II相比，地桿菌素I對(duì)許多耐藥病原微生物具有活性。地桿菌素I與Nisin相似，它通過與脂質(zhì)II分子結(jié)合以劑量依賴的方式抑制肽聚糖的合成［34］。因此開發(fā)異源表達(dá)系統(tǒng)以提高細(xì)菌素產(chǎn)量，且有助于擴(kuò)大其在食品和制藥行業(yè)中的應(yīng)用［35］。

4 細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制

所有生物都有適應(yīng)環(huán)境變化的內(nèi)在趨勢(shì)。目標(biāo)細(xì)菌持續(xù)暴露在細(xì)菌素當(dāng)中會(huì)產(chǎn)生抵抗細(xì)菌素的成分，從而導(dǎo)致細(xì)菌素耐藥性。由于反復(fù)使用細(xì)菌素，致使某些細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素的耐藥性日趨嚴(yán)重。目標(biāo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制不同，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁由相對(duì)較厚的多層肽聚糖組成，溶葡萄球菌素可裂解葡萄球菌類細(xì)胞壁肽擴(kuò)張層中的聚甘氨酸交聯(lián)鍵［36］。目標(biāo)細(xì)菌也可通過中和細(xì)胞壁的凈負(fù)電荷來逃逸細(xì)菌素。細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制各不相同，以下總結(jié)了細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的常見機(jī)制。

4.1 細(xì)菌素對(duì)接分子膜受體的變化

細(xì)菌素系于脂質(zhì)II、甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、十一異戊二烯焦磷酸磷酸酶、麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和鋅離子依賴性金屬內(nèi)肽酶上。甘露糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（Man PTS）基因在耐細(xì)菌素的單核細(xì)胞增生李斯特菌中表達(dá)較低，表明受體密度低影響細(xì)菌素的結(jié)合［36］。Garvicin ML需要麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合物作為受體，缺乏這種復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致腸球菌科的耐藥性。

4.2 細(xì)胞壁磷壁酸的D-丙氨酸化

由于磷壁酸組成的變化，獲得耐藥性的細(xì)菌細(xì)胞壁負(fù)電荷降低。磷壁酸是一種富含磷酸根的陰離子聚合物，它由聚甘油磷酸酯組成，該磷酸甘油酯通過糖脂錨定蛋白與膜相連［37］，或聚核糖醇磷酸可形成磷壁酸核心，也可存在于其他多元醇中，如甘露醇、赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇中。磷壁酸的核糖醇磷酸骨架可被D-丙氨酸取代以形成D-丙氨酸酯鍵。通常，磷壁酸給細(xì)胞壁帶來負(fù)電荷，但當(dāng)它D-丙氨酸化后，給細(xì)胞壁帶來正電荷，從而導(dǎo)致陰離子聚合物的中和。金黃色葡萄球菌對(duì)達(dá)托霉素的耐藥性是由磷壁酸的D-丙氨酸化引起的。在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，由dlt操縱子編碼的4種蛋白質(zhì)是合成磷壁酸D-丙氨酸酯所必需的。鼠李糖乳桿菌的研究表明了這4種蛋白質(zhì)（DltA-D）的作用［38］。DltA充當(dāng)D-丙氨酰-D-丙氨酸載體蛋白連接酶（Dcl），該酶通過ATP水解激活D-丙氨酸，并將其轉(zhuǎn)移至由dltC編碼的D-丙氨酸載體蛋白（Dcp）的磷酸泛素輔助因子上。疏水性DltB是一種膜蛋白，它是D-丙氨酸與磷壁酸結(jié)合和活化D-丙氨酸跨細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移所必需的。DltD負(fù)責(zé)將D-丙氨酸從膜載體DltB轉(zhuǎn)移到磷壁酸［38］。已發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌中dlt操縱子的失活賦予了病原菌對(duì)細(xì)菌素的敏感性。此外，糞便大腸桿菌和肺炎鏈球菌中dltA的缺失導(dǎo)致磷壁酸中缺乏D-丙氨酸，使該菌株對(duì)細(xì)菌素更加敏感［39］。與野生型相比，在糞便大腸桿菌的耐片球菌素的突變體中觀察到D-丙氨酸的變化：磷的比率增加，中和細(xì)胞壁表面電荷，從而增加了片球菌素?cái)U(kuò)散至增生間隙的通透性屏障［40］。

4.3 細(xì)胞膜磷脂的L-賴氨?；?/h3>

由于磷壁酸通過D-丙氨酸化成為一種毒力劑，一些細(xì)菌用L-賴氨酸修飾陰離子磷脂，產(chǎn)生堿性賴氨酰磷脂酰甘油，它賦予細(xì)胞質(zhì)膜正電荷，可以保護(hù)細(xì)菌免受細(xì)菌素的侵害，包括達(dá)托霉素［41］。在高抗性單核細(xì)胞增生李斯特菌，金黃色葡萄球菌，糞腸球菌等菌株中，已觀察到膜磷脂的賴氨酸含量增加。由mprF基因編碼的MprF蛋白是磷脂賴氨?；匦璧?。事實(shí)上，MprF可用賴氨酸或丙氨酸修飾細(xì)菌磷脂酰甘油，以改變膜電荷［42］。

磷脂酰甘油的極性頭被Ala-tRNA（Ala）依賴性的丙氨酰-磷脂酰甘油合酶或Lys-tRNA（Lys）依賴性的賴氨酰-磷脂酰甘油合酶氨?；欣谝赘屑?xì)菌暴露在細(xì)菌素當(dāng)中時(shí)得以生存［43］。這種含氨基酸的膜脂是應(yīng)激狀態(tài)的標(biāo)志，并適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件［44］。

4.4 細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化

耐細(xì)菌素病原體中飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸的比例增加，可表現(xiàn)為更高的膜剛性，更少的流動(dòng)性，防止細(xì)菌素滲透進(jìn)入病原體細(xì)胞［45］。有趣的是，病原體采取相同的策略來逃避氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素等抗生素。畢竟細(xì)菌素是抗生素的一個(gè)子集。芽孢桿菌和假單胞菌產(chǎn)生的AMPs被用作抗生素［46］，而LAB產(chǎn)生的AMPs被用作食品防腐劑。多黏菌素、達(dá)托霉素和表面活性物質(zhì)等是具有抗生素用途的環(huán)脂肽［47］。

4.5 細(xì)菌素之間的交叉耐藥性

由于細(xì)菌素的聯(lián)合使用，尤其是具有不同作用機(jī)理的細(xì)菌素組合使用，可能會(huì)減少或阻止細(xì)菌素耐藥性的發(fā)展，因此對(duì)于確定“對(duì)兩種細(xì)菌素中的一種產(chǎn)生耐藥性之后是否會(huì)發(fā)生交叉耐藥性”至關(guān)重要［48］。Crandall等［49］報(bào)道單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)Nisin的耐藥性賦予了對(duì)pediocin PA-1的交叉耐藥性。在另一項(xiàng)研究中，單核細(xì)胞增生李斯特菌顯示出對(duì)Nisin、pediocin PA-1和leuconocin S的耐藥性。Gravesen等［48］發(fā)現(xiàn)，Nisin和IIa類細(xì)菌素（pediocin PA-1和leucocin A）之間有一定程度的交叉耐藥性。他們還觀察到IIa類細(xì)菌素（pediocin PA-1、leucocin A和carnobacteriocin B2）之間完全交叉耐藥。

5 克服細(xì)菌素耐藥性的方法

細(xì)菌素可通過不同的機(jī)制產(chǎn)生耐藥性，即使是在同一菌種的不同菌株之間也是如此。此外，屬于不同類別的細(xì)菌素可能有相似的耐藥機(jī)制。但細(xì)菌素耐藥性的發(fā)展不會(huì)妨礙細(xì)菌素的預(yù)期用途，因?yàn)橛幸恍┎呗钥捎糜陬A(yù)防或克服這種耐藥性。

單憑細(xì)菌素可能不足以破壞食物中的病原微生物。過量的細(xì)菌素可能導(dǎo)致非特異性殺菌作用，并且可能對(duì)消費(fèi)者造成危害。因此，考慮將細(xì)菌素與其他抗菌劑結(jié)合以增加其抑菌作用。在這方面，植物精油已顯示出希望［50］。百里香、小茴香、香菜、薄荷、鼠尾草、熏衣草、牛至和肉桂精油已被用作食品防腐劑。牛至精油（0.6%）和Nisin（500 IU/g）組合可抑制肉末腸炎沙門氏菌［51］。百里香精油（0.6%）與Nisin（500-1 000 IU/g）組合可抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)［52］。用Nisin（0.3 ppm）修飾的百里香素可抑制香腸中的傷寒沙門氏菌［53］。除精油外，輻照也可以提高細(xì)菌素的功效。封裝的Nisin與牛至和肉桂精油組合可增強(qiáng)單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)γ射線的敏感性［54］。

除了將細(xì)菌素與其他抗菌化合物組合之外，將兩種具有不同作用機(jī)理的細(xì)菌素組合也可提高對(duì)細(xì)菌靶標(biāo)的效力。細(xì)菌素的組合使最小抑菌濃度顯著降低，從而降低抑菌劑量。許多研究表明，將兩種細(xì)菌素一起使用具有很多優(yōu)勢(shì)，如Nisin和Pediocin AcH或Leucocin F10的組合。當(dāng)同時(shí)或按順序添加Nisin和Nisin 13時(shí)，可更有效地對(duì)抗單核細(xì)胞增生李斯特菌［55］。研究表明，細(xì)菌素AS-48和Nisin已被共同用于對(duì)抗金黃色葡萄球菌，并發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用一種細(xì)菌素相比，該組合在抑菌方面更加有效。由于對(duì)特定細(xì)菌素的抗性可能會(huì)擴(kuò)展到其他細(xì)菌素，尤其是同一亞類的細(xì)菌素［56］。因此，在組合使用不同的細(xì)菌素之前，應(yīng)研究交叉耐藥性發(fā)展的初步測(cè)試，使耐藥性的出現(xiàn)最小化。

另一種方法是合理設(shè)計(jì)細(xì)菌素以提高抑菌活性。與抗生素不同，細(xì)菌素可以在某些氨基酸處突變，以使其更有效地對(duì)抗靶標(biāo)。像Nisin A已通過單個(gè)Met21-Val取代被修飾為Nisin V，與Nisin A相比，其抗單核細(xì)胞增生李斯特菌的功效增強(qiáng)［57］。已經(jīng)對(duì)Nisin進(jìn)行了一些誘變研究，以提高其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的功效。用乳鏈菌肽Durancin GL進(jìn)行定點(diǎn)誘變的丙氨酸掃描突變分析表明，幾個(gè)氨基酸殘基對(duì)其抗菌活性具有重要意義，而突變后的殘基會(huì)提高抗菌活性［58］。Lacticin 3147還可以在選定的氨基酸殘基處突變，以增強(qiáng)其抗菌活性。研究表明，Bactofencin A已在幾個(gè)氨基酸殘基處突變，以了解哪些氨基酸殘基對(duì)其抗金黃色葡萄球菌活性是必不可少的，哪些氨基酸殘基突變以進(jìn)一步增強(qiáng)其抑菌活性［59］。考慮到所有方法，生物工程技術(shù)將始終是增強(qiáng)細(xì)菌素抗菌活性最有希望的方法。

6 細(xì)菌素在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

如今，消費(fèi)者要求提供安全、健康、美味、保質(zhì)期長(zhǎng)且加工少的食品。LAB是食品級(jí)微生物，已被廣泛用于食品保存中，其中許多具有GRAS安全性指標(biāo)。因此，LAB產(chǎn)生的細(xì)菌素和其他代謝物通常也被認(rèn)為是具有一定特性的安全化合物（如穩(wěn)定性、抗菌活性、毒性低、無(wú)風(fēng)味變化）［60］。到目前為止，只有Nisin和Pediocin PA-1被商業(yè)化為食品添加劑。但其他細(xì)菌素也為其在食品領(lǐng)域用作生物防腐劑提供了廣闊的前景，如腸球蛋白AS-48［61］。

細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用方式一般有兩種，一種是以純化或半純化細(xì)菌素制劑形式添加，如Nisin是50多個(gè)國(guó)家唯一獲許可用作生物防腐劑的細(xì)菌素。然而，由于多種因素，如吸附到食物成分，酶降解，不良的溶解性或食物基質(zhì)中分布不均，細(xì)菌素在食物系統(tǒng)中的有效性通常很低。通過將產(chǎn)生活細(xì)菌素的細(xì)菌應(yīng)用于食品中可克服使用純化細(xì)菌素的局限性［62］。將乳酸菌添加到乳制品（酸奶和奶酪）中將確保在整個(gè)成熟和儲(chǔ)存過程中連續(xù)產(chǎn)生細(xì)菌素，并可作為發(fā)酵中的輔助培養(yǎng)物使用。

另一種是以細(xì)菌產(chǎn)生的濃縮發(fā)酵液的形式添加。例如，ALTA 2431TM（Quest）是一種來自Pediocin PA的發(fā)酵產(chǎn)物［63］。產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株也可直接接種到食品中作為發(fā)酵劑、輔料或保護(hù)性培養(yǎng)物。實(shí)際上，LAB及其細(xì)菌素已在傳統(tǒng)食品生產(chǎn)中用作發(fā)酵劑。但是在數(shù)千種細(xì)菌素中，只有少數(shù)用于食品保存，因?yàn)槠渌氖怯卸镜?。中草藥中的?xì)菌素和真菌毒素與肝毒性有關(guān)。同時(shí)細(xì)菌素是一組抗菌劑，能夠引起與抗生素相同的危害［64］。因此，應(yīng)避免在食品等重要物品中濫用細(xì)菌素。在積極發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌素的同時(shí)，應(yīng)積極探索其工程化、與其他殺菌劑相結(jié)合，同時(shí)也應(yīng)探索其他食品保鮮方式，并降低細(xì)菌素的毒性，為其作為生物防腐劑奠定基礎(chǔ)。

近來，細(xì)菌素也被摻入包裝膜中以控制食源性致病菌，從而確保細(xì)菌素逐漸釋放到食品中并避免與食物成分相互作用而使細(xì)菌素失活［65］。此外，一些研究表明，與高壓、有機(jī)酸、酚類化合物和脈沖電場(chǎng)等物理化學(xué)方法結(jié)合使用時(shí)，細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性顯著增強(qiáng)。

7 展望

細(xì)菌素在食品加工、保存和食品安全中具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)步，基因工程技術(shù)的成熟，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程以生產(chǎn)新型細(xì)菌素，從而提高細(xì)菌素的應(yīng)用潛力。但是選擇新型細(xì)菌素作為生物防腐劑之前需深入了解細(xì)菌素產(chǎn)生的分子機(jī)制、免疫機(jī)制和作用方式，并進(jìn)行綜合研究從而評(píng)估其安全性。雖然一些細(xì)菌素如Nisin在特定的食品體系中得到了商業(yè)化的應(yīng)用，但由于細(xì)菌素的局限性以及各種食品基質(zhì)的其他影響因素，限制了細(xì)菌素的廣泛應(yīng)用。細(xì)菌素的這些局限性可通過設(shè)計(jì)細(xì)菌素，使其熱穩(wěn)定和pH穩(wěn)定、改善擴(kuò)散率來克服。此外，生產(chǎn)和純化成本也阻礙了細(xì)菌素的廣泛應(yīng)用。這些問題可通過細(xì)菌素在營(yíng)養(yǎng)需求量最小的細(xì)菌宿主中異源表達(dá)來克服。這將在很大程度上直接降低生產(chǎn)成本。然而，像抗生素耐藥性一樣，細(xì)菌素耐藥性也可能是災(zāi)難性的，因此在日常生活中探索使用細(xì)菌素時(shí)應(yīng)格外小心。此外，還需要毒理學(xué)數(shù)據(jù)以確定GRAS的安全性指標(biāo)和細(xì)菌素應(yīng)用于食品中的法律批準(zhǔn)。

細(xì)菌素可與其他保鮮方法結(jié)合使用，以減少微生物引起的食品腐敗。已經(jīng)證明，使用化學(xué)防腐劑、物理處理（熱）或新型溫和的非熱物理方法（脈沖電場(chǎng)、高靜水壓、真空或改良的大氣包裝）可有效地提高許多細(xì)菌素的活性。使用合適的組合不僅在經(jīng)濟(jì)上具有吸引力，而且可以提高食品的安全性、感官和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。隨著將細(xì)菌素和產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株摻入食品基質(zhì)和包裝材料中的新技術(shù)出現(xiàn)，預(yù)計(jì)未來在食品保鮮行業(yè)中對(duì)細(xì)菌素的需求將會(huì)增加。因此，細(xì)菌素作為天然食品防腐劑顯然可以替代常規(guī)的苛刻的物理和化學(xué)防腐劑。