葉冬青，孫 悅，李 瑩，杜 青，劉延琳*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌712100 2 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南寧530007 3 寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院 銀川750021）

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，“微生物風(fēng)土”與葡萄酒風(fēng)土（terroir）的密切關(guān)系已得到研究者的認(rèn)可[1-2]。具有優(yōu)良釀酒特性的本土釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可促進(jìn)產(chǎn)區(qū)或地域特色葡萄酒的風(fēng)土表達(dá)[3-4]。使用純種商業(yè)釀酒酵母（S.cerevisiae）釀造葡萄酒可以縮短遲滯期，使酒精發(fā)酵過(guò)程得到控制，然而該過(guò)程會(huì)造成葡萄酒同質(zhì)化，削弱葡萄酒的整體風(fēng)味特性。相關(guān)研究表明，接種優(yōu)良本土酵母菌或進(jìn)行多個(gè)酵母菌株的混合發(fā)酵可增加葡萄酒的復(fù)雜性，有助于提高葡萄酒質(zhì)量[5-6]。不同釀酒酵母菌株混合發(fā)酵所得葡萄酒的香氣和感官質(zhì)量，與單菌株發(fā)酵結(jié)果明顯不同，這些差異不能通過(guò)調(diào)配單菌株發(fā)酵后的葡萄酒來(lái)獲得[7]。King 等[8]研究表明，不同釀酒酵母菌株混合發(fā)酵在促進(jìn)長(zhǎng)相思葡萄酒果香硫醇的釋放方面，具有協(xié)同作用，將篩選自法國(guó)勃艮第的多株釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵得到的霞多麗[9]、黑比諾[4]葡萄酒的風(fēng)味均表現(xiàn)得比商業(yè)酵母純種發(fā)酵酒更復(fù)雜?？梢?jiàn)，在發(fā)酵體系中引入優(yōu)良本土酵母是解決葡萄酒同質(zhì)化的有效方式。然而，我國(guó)本土酵母資源的利用尚處于初始階段，進(jìn)口商業(yè)酵母因極強(qiáng)的發(fā)酵性能而被國(guó)內(nèi)大多數(shù)葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)長(zhǎng)期使用。至今尚未見(jiàn)商業(yè)酵母對(duì)本土酵母資源影響的相關(guān)報(bào)道。明確本土酵母和商業(yè)酵母在混菌發(fā)酵中的相互關(guān)系是發(fā)掘利用我國(guó)本土酵母資源的重要研究?jī)?nèi)容。

一般情況下，難以通過(guò)常規(guī)的生理生化手段實(shí)現(xiàn)釀酒酵母菌株水平的區(qū)分，必須借助于DNA分子標(biāo)記方法來(lái)完成。目前廣泛使用的釀酒酵母菌株區(qū)分技術(shù)包括：微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記法、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記法、線粒體DNA 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、Interdelta 指紋圖譜法以及COX1 基因指紋圖譜法等[10-11]，然而這類分子方法需要先提取酵母DNA，進(jìn)行PCR 后獲得圖譜進(jìn)行菌株區(qū)分，操作復(fù)雜，效率低，更適合應(yīng)用于分析種群未知的發(fā)酵體系?？顾幓蚴前l(fā)展最早，應(yīng)用最廣的一類篩選標(biāo)記，具有應(yīng)用方便，選擇效率高，功能穩(wěn)定等優(yōu)良性能，被廣泛應(yīng)用于植物、動(dòng)物、微生物等遺傳系統(tǒng)[12]。自然篩選的釀酒酵母不具卡那霉素抗藥性，本研究擬將卡那霉素抗性基因引入混合發(fā)酵體系的一個(gè)釀酒酵母中，并通過(guò)卡那霉素選擇標(biāo)記菌株，從而快速監(jiān)控混菌系統(tǒng)中各菌株的數(shù)量變化。

酵母菌株間的相互作用方式包括生長(zhǎng)互作和代謝產(chǎn)物互作2 個(gè)方面，其中，氮源和嗜殺毒素是混菌體系中最常見(jiàn)的限制酵母生長(zhǎng)和代謝的因素[13]。酵母對(duì)可同化氮（Yeast assimilable nitrogen，YAN）的消耗速率具有菌株特異性，其在混菌發(fā)酵中對(duì)不同氮源的競(jìng)爭(zhēng)利用可能影響各自的生長(zhǎng)及發(fā)酵速率[14]。酵母菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中分泌的嗜殺毒素可以殺死或抑制其它酵母[15]。在葡萄酒釀造過(guò)程中接種嗜殺酵母，可以凈化發(fā)酵體系，加速細(xì)胞自溶，提升酒的口感[16]。NX11424 是分離自我國(guó)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的本土優(yōu)良釀酒酵母，作為中性菌株，其在純種發(fā)酵中具有良好的定殖能力[17]，然而，在混菌發(fā)酵中，特別是存在商業(yè)優(yōu)勢(shì)菌及嗜殺酵母的發(fā)酵中，其定殖情況需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中選取商業(yè)優(yōu)勢(shì)菌株UCD522 和嗜殺菌株UCD2610，構(gòu)建帶有抗性標(biāo)記的重組菌株UCD522K 和UCD2610K，并在2 種YAN 質(zhì)量濃度（55 mg N/L 和433 mg N/L）下驗(yàn)證抗性標(biāo)記對(duì)其菌株發(fā)酵的影響，研究NX11424 分別與二者混合接種發(fā)酵，以期獲得本土釀酒酵母與商業(yè)酵母在混菌發(fā)酵中的特性及細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為研究混合發(fā)酵體系中不同酵母菌株的代謝互作機(jī)制以及釀造更高品質(zhì)的葡萄酒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母菌株NX11424，西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院微生物資源室；商業(yè)釀酒酵母UCD522（Montrachet）、嗜殺菌株UCD2610，美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校葡萄栽培與葡萄酒釀造系菌種保藏中心贈(zèng)予；UCD522K、UCD2610K，本試驗(yàn)構(gòu)建的攜帶卡那霉素抗性基因的菌株。

質(zhì)粒pUG6（攜帶KanMX 基因），武漢淼靈生物科技有限公司；大腸桿菌DH 5α，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

本試驗(yàn)使用的引物共4 條（表1）：用KanMX基因擴(kuò)增的上游引物JK_HO-KO-F 和下游引物JK_HO-KO-R，分別引入HO 基因交換位點(diǎn)（用下劃線標(biāo)出） 用于插入染色體；KanMX 基因檢測(cè)使用上游引物JK_HOKOchk-F（位于HO 基因上游）和下游引物JK_KanRE-R（位于KanMX 中）。

表1 引物序列及其長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences in this study

1.2 培養(yǎng)基

1）LB 培養(yǎng)基 5 g/L 酵母粉，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 氯化鈉，5 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.0。培養(yǎng)大腸桿菌（E.coli）轉(zhuǎn)化子時(shí)需加入氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

2）YPD 培養(yǎng)基 20 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨，10 g/L 酵母浸粉。

3）重組菌株篩選培養(yǎng)基 在YPD 固體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的G418，用于抗性標(biāo)記菌株的菌落計(jì)數(shù)。

4）Triple M 模擬葡萄汁[18]110 g/L D-葡萄糖，110 g/L D-果糖，6 g/L L（+）-酒石酸，3 g/L L（-）-蘋果酸，0.5 g/L 檸檬酸，0.25 ml/L Tween 80，2.5 mg/L 麥角固醇（90%），6 mg/L 肌醇，0.2 g/L 無(wú)水氯化鈣，1 g/L L-脯氨酸，0.1 g/L L-色氨酸，0.8 g/L L-精氨酸，1.7 g/L YNB，2.0 g/L 酸水解酪蛋白，1.0 g/L 磷酸銨，此時(shí)培養(yǎng)基的YAN 濃度為433 mg N/L，配制55 mg N/L 濃度的YAN 培養(yǎng)基則調(diào)整為0.107 g/L L-精氨酸，0.85 g/L YNB，1.0 g/L 酸水解酪蛋白，0.015 g/L 磷酸銨。氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 值至3.25，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌。

1.3 儀器與設(shè)備

基因擴(kuò)增儀PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美國(guó)伯樂(lè)公司；電泳儀FisherBiotech Electrophoresis Systems、凝膠成像系統(tǒng)UVP Multi-Doc-ItTM Imaging System，賽默飛世爾科技公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱Branstead Lab-Line Shaker，Marshall 科技公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 抗性基因的獲得 以從大腸桿菌中提取的pUG6 質(zhì)粒為模板，使用上游引物JK_HO-KO-F和下游引物JK_HO-KO-R 進(jìn)行KanMX 基因的PCR 擴(kuò)增，通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行切膠、回收，利用膠回收試劑盒（QIAquick gel extraction kit）進(jìn)行純化。

1.4.2 重組菌株構(gòu)建及篩選 釀酒酵母（S.cerevisiae）的轉(zhuǎn)化采用LiAc/SS carrier DNA/PEG 方法，具體步驟參照文獻(xiàn)[19]。轉(zhuǎn)化子篩選：挑取陽(yáng)性克隆單菌落進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，檢驗(yàn)KanMX 基因，引物為JK_HOKOchk-F 和JK_KanRE-R。

1.4.3 Triple M 模擬汁發(fā)酵 將種子以106CFU/mL 的接種量接入裝有Triple M 培養(yǎng)基（75 mL）的三角瓶中，在25 ℃下，120 r/min 搖床培養(yǎng)，用CO2失重法監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程（每隔24 h 稱重1 次），含糖量低于2.0 g/L 視為發(fā)酵結(jié)束?；旌习l(fā)酵中不同菌株的接種數(shù)量比為1∶1，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。YAN 濃度為433 mg N/L 和55 mg N/L。

發(fā)酵過(guò)程每天取樣100 μL，稀釋至合適梯度分別涂布YPD 平板和添加了G418 的YPD 平板（每個(gè)梯度3 個(gè)重復(fù)），于28 ℃培養(yǎng)2～3 d，待菌落長(zhǎng)出后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。發(fā)酵結(jié)束以后的理化指標(biāo)參照國(guó)標(biāo)《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038-2006）測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)通過(guò)Office 2013 和SPSS Statistics V19.0（IBM Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行均值和方差分析，采用Duncan 檢驗(yàn)方法（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因的獲得

以質(zhì)粒pUG6 為模板，進(jìn)行退火溫度梯度PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，60 ℃退火45 s 為最佳條件（圖1a）。切膠回收條帶長(zhǎng)度約為1 800 bp，片段大小正確（圖1b）。因此獲得純化的并帶有HO 基因交換位點(diǎn)的KanMX 片段PCR 產(chǎn)物。

圖1 KanMX 基因擴(kuò)增（a）和純化后（b）電泳圖Fig.1 PCR（a） and purification（b） of KanMX

2.2 抗性標(biāo)記重組菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

為構(gòu)建含有KanMX 抗性標(biāo)記的重組釀酒酵母菌株，采用醋酸鋰方法，將PCR 后得到的DNA片段整合到釀酒酵母的基因組中，該DNA 片段含有抗性標(biāo)記和HO 基因的兩端同源序列。在含有100 μg/mL G418 的YPD 平板上進(jìn)行初步篩選后，挑取抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行純化，純化后采用菌落PCR 方法驗(yàn)證抗性基因是否已成功整合到UCD522 和UCD2610 的基因組內(nèi)部。用相應(yīng)引物同時(shí)進(jìn)行抗性基因KanMX 的檢測(cè)，分別以原始菌株和受體菌株的單菌落為模板進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增。根據(jù)電泳結(jié)果（圖2），原始菌株的KanMX 基因PCR 擴(kuò)增為陰性，結(jié)果正確（1、2 泳道），KanMX 基因?yàn)? 100 bp（3、4 泳道），與預(yù)期大小相符。因此，重組菌株UCD522 HO∶∶KanMX（UCD522K）和UCD2610 HO∶∶KanMX（UCD2610K）構(gòu)建成功。

圖2 卡那霉素標(biāo)記的重組菌株的PCR 驗(yàn)證電泳圖Fig.2 PCR detection of the KanMX marking recombinant strains

2.3 抗性標(biāo)記對(duì)菌株發(fā)酵性能的影響

通過(guò)比較原始菌株UCD522、UCD2610，重組菌株UCD522K 和UCD2610K 的CO2累計(jì)釋放量的發(fā)酵曲線，檢驗(yàn)抗性標(biāo)記是否影響菌株的發(fā)酵特征。如圖3所示，在2 種YAN 濃度下，重組菌株與相對(duì)應(yīng)的原始菌株的發(fā)酵特征基本一致，抗性標(biāo)記對(duì)酵母菌的發(fā)酵進(jìn)程不造成影響。發(fā)酵結(jié)束后，模擬酒樣中的殘?zhí)呛烤陀?.0 g/L，各菌株均能順利完成酒精發(fā)酵，并且重組菌株與相對(duì)應(yīng)的原始菌株發(fā)酵的殘?zhí)呛恐g無(wú)顯著差異。

2.4 本土釀酒酵母和商業(yè)酵母的混合發(fā)酵

2.4.1 發(fā)酵指標(biāo)評(píng)價(jià) 不同處理的發(fā)酵曲線（以CO2累積釋放量表示）如圖4所示，混菌發(fā)酵和純種發(fā)酵的速率在高YAN 濃度（433 mg N/L）下差別不大，各發(fā)酵均在第7 天時(shí)結(jié)束；在低YAN 濃度（55 mg N/L）時(shí)，各處理到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)的時(shí)間一致，均為10 d，然而各菌株的發(fā)酵曲線差異明顯。從圖4b 可知，純種發(fā)酵處理中，UCD522K 的發(fā)酵速度最快，其累積CO2釋放量也最大，NX11424 的發(fā)酵速度居中，UCD2610K 的速度最慢。與此相比，混菌發(fā)酵的速度位于二者純種發(fā)酵之間，且更接近發(fā)酵速率快的菌株，特別是發(fā)酵后期（6 d 之后），即在氮源相對(duì)不充足的條件下，與NX11424純種發(fā)酵相比，其與UCD522K 混合接種可以提高發(fā)酵速率，其與UCD2610K 混合接種則可以保持更為平緩的發(fā)酵，說(shuō)明在實(shí)際生產(chǎn)中可以根據(jù)發(fā)酵原料的情況及目標(biāo)酒款的特性進(jìn)行酵母的選擇和組合。

圖4 NX11424 與UCD522K 或與UCD2610K 在不同YAN 濃度下的純種及二者混合接種的發(fā)酵曲線Fig.4 Fermentation curves of pure and mixed inoculated with NX11424 and UCD522K or with UCD2610K in different YAN concentrations

發(fā)酵結(jié)束后所得酒樣的基本理化指標(biāo)如表2所示，可見(jiàn)所有處理均能使模擬汁發(fā)酵完全，相應(yīng)酒樣中的殘?zhí)呛烤陀?.0 g/L?；旌习l(fā)酵酒樣中的酒精度、總酸、pH 值及揮發(fā)酸含量均沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明混合發(fā)酵不影響各菌株的發(fā)酵特性。

表2 發(fā)酵結(jié)束模擬酒的理化指標(biāo)Table 2 Regular physicochemical indexes of synthetic wines

2.4.2 菌株數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化 本土釀酒酵母NX11424 與商業(yè)酵母UCD522K 及UCD2610K 混合發(fā)酵及各自純種發(fā)酵過(guò)程中各菌株細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化如圖5所示。從發(fā)酵整體進(jìn)程看，混菌發(fā)酵和純種發(fā)酵的趨勢(shì)一致，都在接種第2 天達(dá)到最大增殖量，此時(shí)各處理組的總菌數(shù)量均到達(dá)1×108CFU/mL 之上。在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，混菌發(fā)酵的總菌量大體上位于各自純種發(fā)酵之間。

從圖5可知，混菌發(fā)酵中各菌的數(shù)量變化受菌株及氮源條件的影響。在NX11424 與UCD522K 的混合發(fā)酵中，NX11424 在高YAN 濃度的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中占主導(dǎo)地位，尤其在發(fā)酵第2 天，數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯，其數(shù)量是UCD522K 的10 倍左右（圖6），之后二者比例下降至2∶1，而在發(fā)酵第7 天（發(fā)酵末期）的比例有所提高（3∶1）。在YAN濃度為55 mg N/L 時(shí)，二者在混合發(fā)酵過(guò)程中比例維持在約1∶1 的范圍，而到發(fā)酵第10 天（發(fā)酵末期），二者的比例差別明顯（8∶1）。由圖5b 可見(jiàn)，在低氮條件下，發(fā)酵末期UCD522K 的數(shù)量快速下降，與純種發(fā)酵相比，其在混合發(fā)酵中下降的幅度更緩慢，而NX11424 數(shù)量的略有上升。

圖5 NX11424 與UCD522K（a，b）及UCD2610K（c，d）在不同處理發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Yeast population dynamics of NX11424 and UCD522H （a，b） or with UCD2610K （c，d）during the different fermentations

在NX11424 與UCD2610K 的混合發(fā)酵中，二者的數(shù)量比受氮源水平的影響不明顯，在2 種YAN 濃度的發(fā)酵過(guò)程中二者的比例基本上維持在1∶1 附近，到發(fā)酵末期，NX11424 數(shù)量均占優(yōu)勢(shì)（圖6b）。

圖6 NX11424 與UCD522K（a）及UCD2610K（b）在混合發(fā)酵過(guò)程中的數(shù)量比例關(guān)系Fig.6 Ratio of NX11424 to UCD522K （a） and to UCD2610K （b） during the mixed fermentations

3 討論

葡萄酒的發(fā)酵過(guò)程涉及不同酵母屬、種之間此消彼長(zhǎng)的變化，監(jiān)控酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化以及不同酵母間的相互作用，是有效調(diào)控葡萄酒風(fēng)味的必要手段。要達(dá)到釀酒酵母種內(nèi)區(qū)分，同時(shí)兼顧菌種數(shù)量動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)，基于形態(tài)學(xué)的傳統(tǒng)鑒定方法難以實(shí)現(xiàn)，并且基于DNA 分子標(biāo)記的鑒定方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。因此，本研究引入了抗性標(biāo)記，將其成功運(yùn)用到葡萄酒生境的混菌發(fā)酵體系中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)發(fā)酵過(guò)程中不同釀酒酵母菌株數(shù)量的快速靈敏監(jiān)控，是深入研究葡萄酒多菌混合發(fā)酵的有效方法。

氮源對(duì)酵母的影響包括生物量和糖利用率2個(gè)方面[20]。在其它條件最優(yōu)時(shí)，高YAN 濃度的葡萄汁中酵母菌的生長(zhǎng)與其發(fā)酵能力呈正相關(guān)，表現(xiàn)為增加生物量，提高發(fā)酵速率的結(jié)果[21]。本研究中，各菌株在氮源充足的情況下發(fā)酵速度差別不明顯，而在低氮（55 mg N/L）條件下，各處理的發(fā)酵速度差異明顯，這與相關(guān)研究的結(jié)果類似[22]。該現(xiàn)象可能與不同菌株對(duì)氮饑餓的感知能力和信號(hào)傳導(dǎo)的差異相關(guān)，因而形成了一種可以減少能量流動(dòng)，增加對(duì)外界環(huán)境壓力適應(yīng)性的機(jī)制[23]。氮源作為酵母生長(zhǎng)代謝的關(guān)鍵因子，是影響混合發(fā)酵的重要因素。Barrajón-Simancas 等[24]的研究認(rèn)為野生釀酒酵母比商業(yè)釀酒酵母消耗更少的氨基酸，與各自純種發(fā)酵相比，二者混合發(fā)酵會(huì)改變氨基酸的吸收規(guī)律，這與不同菌株在競(jìng)爭(zhēng)互作中代謝活動(dòng)的改變有關(guān)。本研究中，NX11424 與UCD522K在混合發(fā)酵中的比例關(guān)系受氮源水平的影響。在433 mg N/L 下，NX11424 具有明顯的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，占據(jù)主導(dǎo)發(fā)酵地位，而在55 mg N/L 下，二者比例基本維持在1∶1?？梢?jiàn)在混合發(fā)酵中，優(yōu)化氮源條件可以調(diào)控混菌體系的組成比例，有利于精準(zhǔn)控制葡萄酒的發(fā)酵進(jìn)程。

嗜殺酵母可分泌毒素（通常是蛋白或者外毒素）殺死或抑制其它酵母菌的生長(zhǎng)，而自身對(duì)嗜殺毒素免疫[25]。因此，在混菌體系中，嗜殺酵母更有利于競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)和空間[26]。本土酵母NX11424作為非嗜殺酵母，在與嗜殺菌株UCD2610K 混合發(fā)酵過(guò)程中，依然保持了穩(wěn)定的數(shù)量，說(shuō)明該菌株具有一定的抗嗜殺性，這可能與我國(guó)工業(yè)生產(chǎn)中接種工業(yè)嗜殺酵母有關(guān)。同時(shí)在不同YAN 濃度下，二者的比例基本維持在接種比例附近，說(shuō)明在混菌體系中二者可以發(fā)揮各自的作用，混合發(fā)酵具有較大的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了具有抗性標(biāo)記的重組菌株UCD522K 和UCD2610K，并進(jìn)行了YAN 濃度為433 mg N/L 和55 mg N/L 條件下的發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)重組菌株與相對(duì)應(yīng)的原始菌株的發(fā)酵速度和數(shù)量基本保持一致，說(shuō)明抗性標(biāo)記不影響酵母菌的發(fā)酵特征，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)混菌發(fā)酵體系中釀酒酵母（S.cerevisiae）菌株水平的快速靈敏區(qū)分。與純種發(fā)酵相比，混合發(fā)酵在高YAN 下不會(huì)改變發(fā)酵速率，然而在低YAN 下，混菌發(fā)酵的速度位于二者純種發(fā)酵之間?；炀l(fā)酵中各菌的數(shù)量變化受菌株及氮源條件的影響。與UCD522K 的混合發(fā)酵中，NX11424 在高YAN 下具有明顯的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，而在低YAN 的發(fā)酵過(guò)程中則基本保持接種比例。在與嗜殺菌株UCD2610K 的混合發(fā)酵中，二者的數(shù)量比受氮源水平的影響不明顯，在2 種YAN濃度的發(fā)酵過(guò)程中均維持在1∶1 附近。我國(guó)本土釀酒酵母NX11424 在與2 株商業(yè)菌株的混合發(fā)酵過(guò)程中，數(shù)量均具有競(jìng)爭(zhēng)力，是具有潛力的酵母菌資源，可為地域特色葡萄酒典型性風(fēng)格的塑造貢獻(xiàn)積極作用。本研究揭示了本土釀酒酵母菌株和商業(yè)酵母菌株在不同發(fā)酵階段的消長(zhǎng)規(guī)律，為研究酵母菌在混合發(fā)酵中的代謝互作奠定基礎(chǔ)，后期將進(jìn)一步研究混菌發(fā)酵代謝的風(fēng)味物質(zhì)及感官質(zhì)量，為釀酒師選用本土酵母與商業(yè)酵母混合釀造工藝提供一定的理論參考。