廣西隆林黃牛HDACs 家族基因調控肌肉發(fā)育的表達分析

趙易敏，張瑞門，鄧彥飛，程雋如，呂 巧，邢青華，謝炳坤，石德順，楊素芳*，韋英明

（1.廣西大學動物科學技術學院，亞熱帶生物資源保護利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004；2.廣西畜牧研究所，廣西南寧 530001；3.廣西大學農牧產業(yè)發(fā)展研究院，廣西南寧 530004）

隆林黃牛作為廣西三大良種黃牛之一，具有肌肉發(fā)達、抗病力強、適應性好等特性，其體型雖較小，產肉量低，但皮薄骨細，肉質細嫩，屠宰率和凈肉率相對高。據(jù)中國海關總署發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2019 年我國進口肉類產品增長比較快，全年進口豬肉210.8 萬t，同比增加75%；進口牛肉165.9 萬t，同比增加59.7%。從人均年肉類消費量來看，中國為50.3 kg、美國為98.6 kg、歐盟為69.6 kg，可見，中國仍具有較大增長空間。近年來，國人的飲食結構正朝著高蛋白方向轉變，1995—2014 年我國居民人均牛肉購買量占肉類購買總量的比重從4.14%增加到6.46%，未來牛肉需求量還會逐步上升[1]?，F(xiàn)階段，隨著農業(yè)機械化水平越來越高，隆林黃牛逐漸向肉用方向轉化，但其肉用性能還未得到充分的開發(fā)，需應用動物生物學技術來改良提升其肉用價值。目前，提高隆林黃牛產肉性能的研究尚處于起步階段，其肌生成過程中相關基因的調控機制研究較少[2-3]，因此，應用基因表達生物技術研究影響隆林黃牛肌生成過程中的重要功能基因以建立隆林黃牛分子育種與基因改良技術具有重大意義。

組蛋白去乙?；福℉DACs）是在生物學進化過程中高度保守的一類蛋白，在參與細胞凋亡、生長停滯、增殖分化等細胞進程的同時，還在染色體的結構修飾和基因表達調控等方面發(fā)揮著重要作用[4]。Beharry[5]研究發(fā)現(xiàn)HDAC和HAT在多種肌肉萎縮模型中特異性均增加，但I 類HDAC表達增加是廢用性肌肉萎縮所特有的，說明特異性HDAC抑制劑在對抗肌肉萎縮方面可能比pan-HDAC抑制劑更有效；Montgomery 等[6]的研究表明，心臟特異性缺失HDAC2（包括HDAC1）會導致新生兒心律不齊，出現(xiàn)擴張型心肌病以及編碼骨骼肌特異性收縮蛋白和鈣通道的基因上調；Fan 等[7]研究表明，銜接蛋白APPL1 具有協(xié)調HDAC3調節(jié)小鼠棕色脂肪組織的生熱作用；2002 年，Ye[8]等首次報道，HDAC1與豬的肩部脂肪重、后腿重、頰重等主要分割性狀有顯著性聯(lián)系；Hu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)HDAC5的催化結構域具有調控功能，它在控制心肌細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。此外，HDACs家族基因還具有多種治療潛力，如在卵巢腫瘤研究中，HDAC9siRNA通過在體外和體內抑制GC 細胞的增殖和誘導細胞凋亡來抑制GC 腫瘤生長[10]；HDAC6/8/10抑制劑在高級神經母細胞瘤中有治療潛力[11]，HDAC11選擇性抑制劑則有治療肥胖和糖尿病的潛力[12]。

綜上所述，HDACs基因家族在人、小鼠等物種研究中都取得了相應進展[13-14]，但在廣西黃牛骨骼肌發(fā)育和肉品質方面的研究較少。因此，本文研究了廣西隆林黃牛HDAC家族基因在骨骼肌組織及其來源成肌細胞中的表達規(guī)律，進一步篩選具有調控骨骼肌發(fā)育作用的表觀遺傳修飾候選HDAC基因，為今后深入研究HDACs基因家族在黃牛肌肉生長發(fā)育中的功能提供實驗基礎，并為我國黃牛資源的保護、開發(fā)和使用提供生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織采集 選擇廣西崇左市寧明縣富練養(yǎng)牛場的隆林黃牛6 頭，用活體采樣手術器械采集6 月齡（n=3）、18 月齡（n=3）背最長肌肌肉組織，用PBS 緩沖液漂洗組織表面的血跡后剪成小塊放入凍存管后立即置于液氮罐中，運回實驗室并保存于-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑 分子生物學試劑：Trizol 試劑購自Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉錄試劑盒購自Vazyme 公司。細胞生物學試劑：DMEM 高糖基礎液體培養(yǎng)基（GIBCO）、胎牛血清（FBS，GIBCO）、馬血清（HS，GIBCO）、胰酶等均購自Life 公司。

1.3 引物設計 根據(jù)GenBank 中牛HDACs家族基因序列，應用Oligo 7.0 軟件設計HDAC家族基因特異性擴增引物，用于熒光定量PCR 實驗，具體信息如表1 所示。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 細胞培養(yǎng) 在廣西南寧市魯班路肉聯(lián)廠收集黃牛胎兒（90 日齡），利用手術器械采集背最長肌組織，通過膠原酶消化法分離培養(yǎng)牛骨骼肌來源肌肉干細胞，經過傳代后，一部分培養(yǎng)作為肌肉干細胞增殖期樣本（GM），一部分細胞用于成肌分化誘導（經2% 馬血清的誘導培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)4 d）作為肌細胞分化期樣本（DM），剩余細胞凍存于廣西大學亞熱帶農業(yè)生物保護與利用國家重點實驗室備用。

1.5 RNA 提 取和cDNA 第1 鏈的合成 采用Trizol 法提取6 月齡、18 月齡肌肉組織、胎兒骨骼肌來源肌肉干細胞樣本的總RNA，檢測濃度及純度后，篩選質量合格的RNA 用于cDNA 合成。本實驗利用兩步反轉法合成cDNA 第1 鏈。第1 步，去除基因組DNA：5 μL RNA，4 μL 4×gDNA wiper Μix 及7 μL 相應的RNasefree ddH2O，42℃反應2 min；第2 步，逆轉錄反應：在去除基因組產物中分別加入4 μL 5× HiScript III qRT SuperMix（反轉錄酶），程序為37℃ 15 min、85℃ 5 s。反轉錄得到的cDNA 產物保存于-80℃冰箱。

表1 熒光定量PCR 基因引物合成序列

1.6 RT-qPCR 反應 20 μL 反應體系：2× ChamQTM Universal SYBR?qPCR Μaster Μix 10.0 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA 模板（110 ng/μL）1.0 μL、ddH2O 8.0 μL。qPCR 反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性10 s、60℃退火30 s，40 個循環(huán)。每個樣本設置3 個重復，實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔt計算基因的表達情況。對所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7 作圖，用SPSS Statistics 軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.7 統(tǒng)計分析 以平均值±標準誤差（SEM）表示結果，數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細胞的分離培養(yǎng)和誘導 本實驗利用膠原酶消化法分離得到黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細胞（圖1-A），在細胞分化4 d 時，細胞DAPI 熒光染色顯示誘導第4 天有大量肌管形成（圖1-B）。同時，實驗通過Trizol 法純化獲得廣西黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細胞增殖期樣本（GM）和分化期樣本（DM）的總RNA（圖2-B），從圖中可以觀察到清晰的特異性條帶，說明獲得的RNA 可用于后續(xù)實驗。在檢測成肌分化標志基因MyoD1、MyoG和MyHC的表達實驗中，qPCR 結果表明MyoD1、MyoG、MyHC的mRNA 在分化第4 天相較于對照組都顯著升高（圖1-C）。由此可見，本次實驗成功建立牛骨骼肌來源肌肉干細胞技術培養(yǎng)體系，為后期研究提供了細胞模型。

2.2 黃牛HDACs家族基因的肌肉組織表達規(guī)律 通過Trizol 法純化獲得廣西隆林黃牛6 月齡和18 月齡背最長肌肌肉組織總RNA（圖2-A），從圖中可以觀察到清晰的特異性條帶，說明獲得的RNA 可用于后續(xù)實驗。同時，RT-PCR 實驗顯示，HDACs家族基因擴增序列特異性良好（圖3），說明可用于后續(xù)實驗。圖4 顯示，HDACs家族基因在18 月齡背最長肌組織的表達顯示上調，除了HDAC7、HDAC8、HDAC10基因在2 個階段的肌肉組織表達沒有顯著差異外，其余HDACs家族基因的表達都顯著上調，其中，HDAC11在18 月齡階段肌肉組織的表達量最高（P<0.000 1）。由此可見，HDACs在黃牛骨骼肌發(fā)育過程中可能具有重要的調控作用，可作為后續(xù)骨骼肌發(fā)育研究中的表觀遺傳修飾的候選基因。

圖1 牛胎兒骨骼肌來源肌細胞培養(yǎng)和誘導

圖2 隆林黃牛肌肉組織、肌細胞RNA 的特異性條帶

圖3 牛HDACs 家族基因RT-PCR 電泳圖

2.3 黃牛HDACs家族基因在成肌細胞增殖和分化階段的表達規(guī)律 本實驗熒光定量PCR 數(shù)據(jù)顯示，除了HDAC7基因在2 個細胞階段的表達量沒有顯著差異之外，其余HDACs家族基因在肌肉干細胞增殖階段的表達量均顯著高于肌肉干細胞分化階段（圖5）。與圖4的數(shù)據(jù)比較，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC9、HDAC11在18 月齡時期顯著上調，并且在細胞增殖過程保持高表達水平，由此可見，這些基因在黃牛骨骼肌來源成肌細胞增殖過程中可能具有重要的調控作用，可作為后續(xù)骨骼肌發(fā)育研究中的表觀遺傳修飾的候選基因。

圖4 HDACs 家族基因在隆林黃牛不同生長階段的背最長肌組織的表達譜

圖5 HDACs 家族基因在牛胎兒骨骼肌來源肌細胞的表達譜

3 討 論

目前，隨著生活水平的提高，國內牛肉產量和品質的供應已無法滿足人們需求，廣西肉牛產業(yè)還處于初級發(fā)展階段，如何提高牛肉產量和肉質值得探討[15]。一直以來，國內對動物骨骼肌發(fā)育的研究取得了一系列進展，明確了生肌調控因子家族基因（MRFs），肌細胞增強因子2（MEF2）、肌生成素、雙肌臀基因，以及非編碼RNA：miRNA、lncRNA、circRNA 等眾多分子在骨骼肌發(fā)育調控中的重要地位[16]。

組蛋白脫乙?；福℉DACs）是一類酶，可從蛋白質上的賴氨酸中去除乙?；鼈冊谡{控家畜動物生長發(fā)育研究方面鮮有報道，因此本研究結果是該領域進展中的一個補充。在人類中，HDAC1～11分為3 類：I類HDAC包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，主要存在于細胞核中，使組蛋白發(fā)生脫乙?；痆17]；II 類HDAC進一步分 為IIa 類（HDAC、HDAC5、HDAC7和HDAC9）和IIb（HDAC6和HDAC10）同工型[18]；III 類HDAC（HDAC11）在腦、腎和睪丸等組織中有表達[19]。從本研究結果分析，HDAC1～11家族基因成員在牛的不同生長階段表現(xiàn)出不同的表達規(guī)律，而這些基因分子在廣西隆林黃牛18 月齡骨骼肌組織的表達均高于6 月齡時期；值得一提的是，牛HDACs家族基因分類、細胞亞定位、組織特異性與人類HDACs家族基因的異同需要進一步探究證實。

在本研究獲得的廣西隆林黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細胞中，HDAC1～11在肌肉干細胞分化進程中基因表達顯示下調，而在增殖過程中維持表達，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC9、HDAC11基因表達差異變化顯著。前述結果足以證明，HDAC1～11家族基因成員均參與了廣西隆林黃牛骨骼肌發(fā)育過程，而這些差異表達分子可能在肌肉干細胞維持增殖過程發(fā)揮調控作用。以往研究報道為后續(xù)研究提供了一些線索，如在小鼠骨骼肌肌萎縮研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC4利用肌球蛋白重鏈（MyHC）等結合底物進而調節(jié)骨骼肌組織的代謝途徑，暗示了其他IIa 類HDAC基因可能參與骨骼肌代謝途徑或者其他生物過程[20]。另外，肥胖如何影響骨骼肌性能是研究者們思考的又一個重要科學問題，謝謹?shù)萚21]研究結果顯示，AMPK 活性降低會促進II 類組蛋白脫乙酰基酶（HDAC5）介導的對肌細胞增強因子2（MEF2）的抑制，從而影響肌肉收縮動能的變化。這些發(fā)現(xiàn)為深入探究牛HDACs基因在調控肌肉發(fā)育功能機制中的作用提供了研究視角。

未來可選擇HDAC5、HDAC11等顯著變化分子深入探討骨骼肌發(fā)育體內體外調控機制，進一步開展相關骨骼肌發(fā)育調控中HDACs的表觀遺傳修飾作用：第一，立足DNA 順式調控元件（啟動子、增強子），解析組蛋白脫乙?；概c上游調控的內在聯(lián)系，找到調控骨骼肌發(fā)育的關鍵調節(jié)劑；第二，聯(lián)系反式作用因子和生肌調控關鍵基因，聯(lián)合組蛋白脫乙酰基酶的表觀修飾作用，把肌肉干細胞增殖、分化過程中影響因素及其關鍵角色進行挖掘；第三，組蛋白脫乙?；概ccircRNA 等非編碼RNA 領域調控肌肉干細胞的發(fā)育關鍵信息值得挖掘，例如組蛋白脫乙?；甘欠裼绊慶ircRNAs 對靶基因的調控或者產生編碼多肽?？傊@些變化是否會影響肌肉干細胞發(fā)育中染色質結構的變化、產肌性能的變化，值得后續(xù)深入探討。

4 結 論

本研究成功挖掘HDAC1～11家族基因在隆林黃牛6 月齡和18 月齡背最長肌組織以及肌肉干細胞的表達規(guī)律，為今后挖掘HDAC5、HDAC11等候選基因調控廣西黃牛肌肉干細胞的關鍵信息奠定了理論基礎。