輔酶Q10對(duì)湖羊精液常溫保存效果的影響

褚長江，張柳明，王彥虎，馬金亮，胡慧茹，馮云奎，李擁軍

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

湖羊是世界著名的多胎綿羊品種，具有四季發(fā)情、一年兩胎等優(yōu)良性狀。精液保存和人工授精技術(shù)可以提高優(yōu)良種公畜的利用率，對(duì)湖羊的規(guī)模化養(yǎng)殖有重大意義。精液的常溫保存技術(shù)具有操作簡便、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較多，但在綿羊上的應(yīng)用報(bào)道較少。影響綿羊精液常溫保存效果的因素有活性氧、滲透壓、溫度等。在精液常溫保存過程中，過多活性氧的產(chǎn)生會(huì)降低精液質(zhì)量，并損傷精子質(zhì)膜，由于精子細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化物不足以中和過多的活性氧（ROS），所以需要添加外源性抗氧化物質(zhì)[1-2]。

輔酶Q10別稱泛醌，是一種重要的脂溶性抗氧化物質(zhì)，易溶于氯仿、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑，不溶于水。輔酶Q10在合成ATP 的電子傳遞鏈中起重要作用，作為線粒體電子傳遞鏈調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)氧化還原的一個(gè)中間體，輔酶Q10可以中和自由基并使其以還原形式再生[3]。目前，輔酶Q10已廣泛用于人類生殖系統(tǒng)疾病的輔助治療，并且取得了一定成效[4]，同時(shí)輔酶Q10作為抗氧化劑在絨山羊[5]、公雞[6]等精液冷凍保存也有應(yīng)用，但關(guān)于輔酶Q10在湖羊精液常溫保存中的應(yīng)用還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度的輔酶Q10對(duì)常溫保存條件下的湖羊精子活力、活率、運(yùn)動(dòng)參數(shù)、膜功能和ROS 含量的影響，以期為湖羊精液保存技術(shù)在生產(chǎn)中應(yīng)用推廣提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 精液樣品的采集與處理 本實(shí)驗(yàn)所用的精液采自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)羊場的3 只1～2 歲的健康湖羊。采用假陰道法收集公羊精液，存放于37℃的保溫杯，在1 h 內(nèi)將精液樣品運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。選取精子活力0.8 以上，色澤和氣味正常的精液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。把合格的精液混勻以后，使用1.5 mL 離心管分裝，每管分裝130 μL 精液量，用含有不同濃度輔酶Q10的稀釋液將精液稀釋10 倍，然后用多層棉花包裹，放置于20℃恒溫箱保存。為防止精子聚沉，每隔12 h 緩慢搖動(dòng)精液。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 Tris、檸檬酸、果糖、磷酸鹽緩沖液和輔酶Q10等購自生工生物工程股份有限公司；ROS 檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。主要儀器包括邁朗精子全自動(dòng)分析系統(tǒng)（CASA）（南寧松景天倫生物科技有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（精宏DK-S26）、臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf）、多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer）。

1.3 精液稀釋液的配制 準(zhǔn)確稱取Tris 3.07 g、檸檬酸1.64 g、果糖2.00 g，溶解于100.00 mL 滅菌超純水中，充分混勻，使用0.22 μmol/L 濾膜過濾除菌，之后加入青霉素、鏈霉素各5 萬IU，配制成基礎(chǔ)稀釋液。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)分為5 組，以配制的基礎(chǔ)稀釋液為對(duì)照組，設(shè)置4 個(gè)處理組，即向基礎(chǔ)稀釋液添加不同濃度的輔酶Q10，使其終濃度分別為5、50、250、500 μmol/L。將稀釋處理后的精液置于20℃保存，每隔24 h 檢測一次精子活率、活力、平均路徑速度（VAP）、曲線速度（VCL）、質(zhì)膜完整性和頂體完整性，在第5 天檢測ROS 含量。

1.5 精子質(zhì)量檢測

1.5.1 精子活力、活率以及運(yùn)動(dòng)速率的測定 每隔24 h，從離心管取出20 μL 精液，使用基礎(chǔ)稀釋液稀釋5 倍，將其置于37℃水浴鍋孵育2 min 后，取2 μL 精液滴在邁朗精子計(jì)數(shù)板中，置于37℃恒溫載物臺(tái)上，使用CASA 分析儀檢測精子活力、活率以及運(yùn)動(dòng)速率。

1.5.2 精子質(zhì)膜完整性檢測 采用低滲腫脹法（HOST）檢測質(zhì)膜完整性。準(zhǔn)確稱取0.49 g 檸檬酸鈉、0.9 g 果糖，使其溶于100 mL 超純水（低滲溶液）。37℃預(yù)熱后，從離心管取出20 μL 精液后加到200 μL 低滲溶液中（1:10），37℃水浴30 min。取2 μL 精液置于400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取視野，計(jì)算彎尾精子數(shù)與總精子數(shù)的比例，總精子數(shù)達(dá)300 以上。

1.5.3 精子頂體完整性檢測 采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行頂體染色。從離心管取出50 μL 精液，加入1 mL 4%多聚甲醛固定10 min，使用離心機(jī)（1 500 r/min）離心5 min，棄上清，然后取10 μL 精液制作抹片，風(fēng)干后使用考馬斯亮藍(lán)染色30 min，用水慢慢沖洗干凈，風(fēng)干后將抹片置于1 000 倍油鏡下觀察。

1.5.4 ROS 含量的檢測 使用碧云天活性氧試劑盒，按照說明書進(jìn)行ROS 含量的測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），處理結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液中添加不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子活率的影響 由表1 可知，精子保存第1、2、3 天，試驗(yàn)組的精子活率顯著高于對(duì)照組；第4 天，50 μmol/L 添加組的精子活率顯著高于其他4 組；第5 天，50 μmol/L添加組的精子活率顯著高于250 μmol/L 和500 μmol/L添加組。

2.2 稀釋液中添加不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子活力的影響 由表2 可知，精子保存第1 天，500 μmol/L 組的精子活力顯著高于其他組；第2 天，5 μmol/L 和50 μmol/L組的精子活力顯著高于其他組，5 μmol/L 和50 μmol/L 組的精子活力無顯著差異；第3 天，各處理組的精子活力無顯著差異，但均顯著高于對(duì)照組；第4、5 天，50 μmol/L組的精子活力顯著高于其他組。

2.3 稀釋液中添加不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子VAP和VCL 的影響 由表3 可知，精子保存第1 天各組的VAP 無顯著差異；第2 天，50 μmol/L 組的VAP 顯著高于對(duì)照組；第3 天，5 μmol/L 和50 μmol/L 組的VAP 顯著高于其他組；第4 天，50 μmol/L 組的VAP顯著高于其他組；第5 天，50 μmol/L 組的VAP 顯著高于250 μmol/L 和500 μmol/L 組。

表1 不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子活率的影響 %

表2 不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子活力的影響 %

精子保存第1 天，各組之間的VCL 無顯著差異；保存第2 天，50 μmol/L 組的VCL 顯著高于5 μmol/L組和對(duì)照組；保存第3、5 天，50 μmol/L 組的VCL 顯著高于250 μmol/L 和500 μmol/L 組；保存第4 天，50μmol/L 組的VCL 顯著高于其他組。

2.4 稀釋液中添加不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子質(zhì)膜完整率的影響 由表4 可知，精子保存第1 天，50 μmol/L組的質(zhì)膜完整率顯著高于250 μmol/L 和500 μmol/L 組；第2、3、5 天，5 μmol/L 和50 μmol/L 組的質(zhì)膜完整率顯著高于其他組，5 μmol/L 和50 μmol/L 組的質(zhì)膜完整率無顯著差異；第4 天，50 μmol/L 組的質(zhì)膜完整率顯著高于250 μmol/L 和500 μmol/L 組。精子質(zhì)膜完整性見圖1。

2.5 稀釋液添加不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子頂體完整率的影響 由表5 可知，精子保存第1 天，各組精子頂體完整率無顯著差異；第2、3、4 天，5 μmol/L 和50 μmol/L 組的頂體完整率顯著高于其他組，兩者間無顯著差異；在第5 天，50 μmol/L 組的頂體完整率顯著高于其他組。精子頂體完整性如圖2 所示。

2.6 稀釋液添加不同濃度輔酶Q10對(duì)ROS 含量的影響由圖3 可知，在保存第5 天，50 μmol/L 組的ROS 含量顯著低于其他組。

圖1 精子質(zhì)膜完整性圖

3 討 論

由于小反芻動(dòng)物精子細(xì)胞膜中含有較高水平的多不飽和脂肪酸（PUFA），其極易受到氧化損傷[7]。據(jù)報(bào)道，維持精子細(xì)胞的獲能和頂體反應(yīng)等生理功能需要少量ROS，過多ROS 的產(chǎn)生會(huì)生成脂質(zhì)過氧化物質(zhì)，導(dǎo)致精子活力下降、質(zhì)膜完整性降低、細(xì)胞功能異常，最終細(xì)胞凋亡[8]。盡管精子細(xì)胞本身存在還原性谷胱甘肽、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等多種抗氧化酶[9]，但精子在體外保存過程中僅靠其自身的保護(hù)機(jī)制遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。精子的保護(hù)防御機(jī)制來源于細(xì)胞質(zhì)，精子在成熟過程中丟失了大部分細(xì)胞質(zhì)[10]，所以在精液保存過程中需要添加外源性抗氧化物質(zhì)來降低精子受氧化應(yīng)激的影響程度。

表3 不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子VAP 和VCL 的影響 μm/s

表4 不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子質(zhì)膜完整率的影響 %

表5 不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子頂體完整率的影響 %

圖2 精子頂體完整性圖

圖3 常溫保存第5 d 后不同濃度輔酶Q10對(duì)湖羊精子ROS 含量的影響

輔酶Q10是一種脂溶性抗氧化物，在動(dòng)物體內(nèi)具有一些必不可少的功能。輔酶Q10存在于所有具有呼吸作用的真核細(xì)胞中，其濃度比其他脂溶性抗氧化物質(zhì)（如維生素E）高5～10 倍，其主要作用是在能量運(yùn)輸過程傳送電子和質(zhì)子，從而在線粒體膜合成ATP，輔酶Q10在整個(gè)能量產(chǎn)生的過程中扮演重要角色[11]。在精子細(xì)胞中，輔酶Q10主要集中在線粒體的中部，因此精子運(yùn)動(dòng)所需的能量依賴于輔酶Q10，輔酶Q10可以直接中和脂質(zhì)過氧化自由基[12]，從而提高線粒體活性。

一些研究已經(jīng)確定了輔酶Q10與精子質(zhì)量之間的聯(lián)系。如Mancini 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10濃度與人類精子活力、密度有著密切關(guān)系。Balecia 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，弱精患者得到輔酶Q10的治療后精液質(zhì)量參數(shù)有明顯提高。通過對(duì)牛、馬和山羊等不同品種體外凍精的研究發(fā)現(xiàn)，在精液稀釋液中添加輔酶Q10可以提高精子質(zhì)量[15]。截至目前，還未發(fā)現(xiàn)輔酶Q10對(duì)精液常溫保存效果的研究。

本研究表明，輔酶Q10的濃度與精子活力有相關(guān)性。在精液保存第2、3、4、5 天，50 μmol/L 組的精子活力顯著高于對(duì)照組，表明適量濃度的輔酶Q10可以提高湖羊精子活力。Larsen[16]研究表明，VCL 是CASA 中最重要且獨(dú)立的參數(shù)，與精子的受精能力高度相關(guān)。本研究結(jié)果表明，50 μmol/L 輔酶Q10可以提高精子的VCL。添加適當(dāng)劑量的輔酶Q10可以通過維持質(zhì)膜穩(wěn)定和清除ROS 來降低細(xì)胞凋亡率[11]。

精子在體外保存過程中，膜磷脂容易發(fā)生氧化，從而降低精子活力和質(zhì)膜完整性。對(duì)牛[17]、人[18]和公雞[19]的研究表明，在精液稀釋液中補(bǔ)充輔酶Q10可以提高質(zhì)膜的完整率。由于輔酶Q10是脂溶性抗氧化劑，它可以直接存在于質(zhì)膜的多不飽和脂肪鏈中，抑制脂質(zhì)過氧化，從而保護(hù)精子的質(zhì)膜[19]。本研究中，在保存第1～5 天，50 μmol/L 組的質(zhì)膜完整率顯著高于對(duì)照組，輔酶Q10對(duì)精子質(zhì)膜的作用效果與霍敏[5]的研究結(jié)果相符合。

本研究結(jié)果顯示，5 μmol/L 和50 μmol/L 組的頂體完整率顯著高于對(duì)照組，表明輔酶Q10對(duì)精子頂體完整性具有保護(hù)作用。霍敏[5]、Masoudi[6]研究發(fā)現(xiàn)添加輔酶Q10可以有效保護(hù)凍融后精子的頂體完整性。輔酶Q10作為一種自由基清除劑，能有效防止精子膜發(fā)生氧化反應(yīng)，從而降低精子的頂體畸形率[6]。

Masoudi[6]研究表明，輔酶Q10能夠清除氧自由基。本研究結(jié)果顯示，50 μmol/L 組的ROS 含量顯著低于其他組，說明在常溫保存過程中添加適量輔酶Q10可以有效保護(hù)精子的線粒體，抑制其體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，從而減少精子細(xì)胞的死亡。該結(jié)果與Yamamoto[20]報(bào)道的精液冷凍保存的結(jié)果相似。

值得注意的是，高濃度的輔酶Q10可能對(duì)精子細(xì)胞有害，應(yīng)該選擇最適宜的添加物濃度[15]。半醌是輔酶Q10的部分還原形式，具有促氧化作用，當(dāng)輔酶Q10含量過高時(shí)可能參與細(xì)胞毒性[21]。相對(duì)較高濃度的抗氧化劑成分反而會(huì)增加精子細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，從而對(duì)精子質(zhì)量造成負(fù)面影響[22]。本研究結(jié)果也顯示，250 μmol/L和500 μmol/L 輔酶Q10可降低精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性以及增加了ROS 含量。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在常溫保存稀釋液中添加輔酶Q10可以提高湖羊精液在20℃保存過程中的質(zhì)量，且以50 μmol/L 輔酶Q10對(duì)湖羊精液的常溫保護(hù)效果最好。